CN104730158B - 一种加味藿香正气软胶囊的含量测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种加味藿香正气软胶囊的含量测定方法,包括制备含有橙皮苷、厚朴酚、和厚朴酚、甘草苷的混合对照品和加味藿香正气软胶囊供试品溶液以及阴性样品溶液;以C18色谱柱,水‑‑甲醇为流动相,梯度洗脱,流速1.0mL·min‑1,柱温30℃,进样量10μL,在287nm波长下检测对照品、供试品及阴性溶液并记录色谱图计算供试品溶液中橙皮苷、厚朴酚、和厚朴酚、甘草苷的含量。
Description
本申请要求于2013年12月22日提交中国专利局、申请号为201310746074.5、发明名称为:“一种加味藿香正气软胶囊的含量测定方法”的中国专利申请的优先权,其全部内容通过引用结合在本申请中。
技术领域
本发明属于中药领域,特别涉及一种中药组合物的含量测定方法。
背景技术
加味藿香正气软胶囊的组方出自宋代官方太医局编写的《太平惠民和剂局方》卷之二治伤寒,由大腹皮、白芷、紫苏叶、茯苓、半夏、白术、陈皮、厚朴、生姜、桔梗、广藿香、甘草、大枣等十三味中药组成。功效是解表化湿,理气和中。现有文献报道多以其药理作用和临床研究为主要方面,对质量控制的研究较少。现代药理研究表明,厚朴中的厚朴酚与和厚朴酚、陈皮中的主要化学成分橙皮苷、甘草的主要成分三萜皂苷和黄酮类化合物是主要的药效物质,能够改善外感风寒、内伤湿滞引起的脘腹胀痛、呕吐、泄泻等症状。而2010年版《中国药典》收载的加味藿香正气软胶囊的含量检测指标仅为厚朴酚与和厚朴酚,这显然不能全面控制其质量。罗文敏等建立了一种同时测定藿香正气胶囊中8个成分含量的方法(《药物分析杂志》2011年第31卷第9期),该方法同时测定甘草苷、柚皮苷、橙皮苷、麝香草酚、欧前胡素、和厚朴酚、异欧前胡素以及厚朴酚。但与本发明相比,此方法使用三相流动相,对仪器的要求更高;而本发明为两相流动相,具有普适性;同时,本发明所述检测方法,甘草苷的线性范围较文献方法更宽,厚朴酚、和厚朴酚、橙皮苷的线性也更加准确。本发明对该制剂中的厚朴、陈皮和甘草中的4种主要化学成分厚朴酚、和厚朴酚、橙皮苷和甘草苷同时进行了含量测定,旨在为加味藿香正气软胶囊提供一种更全面、更适用的质量控制方法。
说明书
一种加味藿香正气软胶囊的检测方法,其特征在于,该方法由以下步骤组成:
(1)取橙皮苷、厚朴酚、和厚朴酚、甘草苷标准品,溶于甲醇或乙腈中,制备混合对照品溶液;
(2)取加味藿香正气软胶囊内容物,加入甲醇或乙醇或乙腈,称重,采用加热回流或索氏提取或萃取或超声的方法进行提取,室温下称重,应用提取溶剂补足重量,过滤,制备供试品溶液;
(3)利用高效液相色谱法测定供试品溶液中橙皮苷、厚朴酚、和厚朴酚、甘草苷含量,色谱条件为:
色谱柱为C18柱;流动相:A为水或磷酸溶液,B为甲醇或乙腈溶液;流速0.7~1.5mL·min-1;检测波长:250~300nm;柱温:15~40℃;进样量:5~15μL;梯度洗脱程序为:
0→5min,A为95%~85%,B为5%~15%;
5→12min,A从95%~85%降低到90%~80%,B从5%~15%上升到10%~20%;
12→19min,A从90%~80%降低到75%~65%,B从10%~20%上升到25%~35%;
19→36min,A从75%~65%降低到60%~50%,B从25%~35%上升到40%~50%;
36→48min,A从60%~50%降低到20%~10%,B从40%~50%上升到80%~90%;
48→60min,A从20%~10%降低到15%~5%,B从80%~90%上升到85%~95%;
60→70min,A为15%~5%,B为85%~95%;
(4)根据高效液相色谱分析结果计算供试品中橙皮苷、厚朴酚、和厚朴酚、甘草苷含量。
优选的,步骤(1)中混合对照品溶液是将橙皮苷、厚朴酚、和厚朴酚、甘草苷标准品,溶于甲醇或乙腈中,制成1mL含橙皮苷0.447mg、厚朴酚0.342mg、和厚朴酚0.349mg、甘草苷0.393mg的混合溶液;
最优选的,混合对照品由甲醇溶液制成。
优选的,步骤(2)中甲醇或乙醇或乙腈的浓度为40%~80%;
优选的,步骤(2)中甲醇或乙醇或乙腈的浓度为60%;
最优选的,步骤(2)中采用60%乙醇。
优选的,步骤(2)中供试品的提取方法采用超声提取,提取条件为250W,40kHz,45min。
优选的,步骤(3)中优选的色谱条件为:色谱柱为Kromasil C18;流动相:A为水或磷酸溶液、B为甲醇,梯度洗脱;流速1.0mL·min-1;检测波长:287nm;柱温:30℃;进样量:10μL;
优选的梯度洗脱的程序:
0→5min,A为90%,B为10%;
5→12min,A从90%降低到85%,B从10%上升到15%;
12→19min,A从85%降低到70%,B从15%上升到30%;
19→36min,A从70%降低到55%,B从30%上升到45%;
36→48min,A从55%降低到15%,B从45%上升到85%:
48→60min,A从15%降低到10%,B从85%上升到90%:
60→70min,A为10%,B为90%。
本发明提供了一种加味藿香正气软胶囊的含量测定方法,包括以下步骤:取橙皮苷、厚朴酚、和厚朴酚、甘草苷标准品,溶于甲醇或乙腈中,制备混合对照品溶液;取加味藿香正气软胶囊内容物,加入甲醇或乙醇或乙腈,称重,采用加热回流或索氏提取或萃取或超声的方法进行提取,室温下称重,应用提取溶剂补足重量,过滤,制备供试品溶液;对混合对照品溶液、供试品溶液进行高效液相色谱检测,根据高效液相色谱图,利用外标法计算供试品中橙皮苷、厚朴酚、和厚朴酚、甘草苷的含量。所述高效液相色谱的检测条件为色谱柱为C18柱;流动相:A为水或磷酸溶液,B为甲醇或乙腈溶液;流速0.7~1.5mL·min-1;检测波长:250~300nm;柱温:15~40℃;进样量:5~15μL;梯度洗脱程序为
0→5min,A为95%~85%,B为5%~15%;
5→12min,A从95%~85%降低到90%~80%,B从5%~15%上升到10%~20%;
12→19min,A从90%~80%降低到75%~65%,B从10%~20%上升到25%~35%;
19→36min,A从75%~65%降低到60%~50%,B从25%~35%上升到40%~50%;
36→48min,A从60%~50%降低到20%~10%,B从40%~50%上升到80%~90%;
48→60min,A从20%~10%降低到15%~5%,B从80%~90%上升到85%~95%;
60→70min,A为15%~5%,B为85%~95%。
为验证本发明的技术效果,发明人进行了实验研究。下述实验用于进一步说明本发明的技术效果,但不限制本发明。
附图说明
图1:Kromasil C18色谱柱时的高效液相色谱图;
图2:Shimadzu C18色谱柱时的高效液相色谱图;
图3:Zorbax C18色谱柱时的高效液相色谱图;
图4:Luna C18色谱柱时的高效液相色谱图;
图5:Polaris C18色谱柱时的高效液相色谱图;
图6:流动相为磷酸溶液-甲醇时的高效液相色谱图;
图7:流动相为水-甲醇时的高效液相色谱图;
图8:流动相为水-乙腈时的高效液相色谱图;
图9:流动相为磷酸溶液-乙腈时的高效液相色谱图;
图10:加味藿香正气软胶囊样品高效液相色谱图;
图11:系统适应性考察高效液相色谱图。
具体实施方式
以下实验所需仪器与试药包括:Waters高效液相色谱仪;电子分析天平;对照品甘草苷、橙皮苷、厚朴酚、和厚朴酚购自中国药品生物制品检定所,乙腈和甲醇为色谱纯,水为超纯水,其他试剂均为分析纯。加味藿香正气软胶囊购自江苏康缘药业股份有限公司。
本发明中所述对照品溶液、供试品溶液按照以下方法制备:
(1)混合对照品溶液的制备精密称取橙皮苷、厚朴酚、和厚朴酚、甘草苷各适量,加甲醇或乙腈分别制成1mL含橙皮苷0.447mg、厚朴酚0.342mg、和厚朴酚0.349mg、甘草苷0.393mg的混合溶液,即得。
(2)供试品溶液的制备取2粒加味藿香正气软胶囊内容物置于三角瓶中,精密加入体积分数为60%的甲醇或乙醇或乙腈25mL,称重,超声处理(250W,频率40kHz)45min,放冷,称重,用60%的甲醇或乙醇或乙腈补足重量,过滤,滤液过0.45μm滤膜,即得。
从安全、经济等方面考虑,优选甲醇为溶剂。
供试品溶液制备过程中,发明人对不同的提取方法进行了考察,包括加热回流,索式提取、萃取、超声提取等四种方法,通过峰面积对比以及考虑到操作的简便性,优选超声提取做为供试品溶液制备方法,条件为250W,频率40kHz,45min。
精密量取供试品溶液10μL,注入高效液相色谱仪,色谱柱为Kromasil C18、Shimadzu C18、Zorbax C18、Luna C18和Polaris C18,流动相:A为水,B为甲醇,梯度洗脱,洗脱梯度见表1;流速1.0mL·min-1;检测波长:287nm;柱温:30℃;。
表1洗脱梯度表
检测结果如图1~图5所示。经比较,本发明优选采用Kromasil C18色谱柱。
精密量取供试品溶液10μL,注入高效液相色谱仪,色谱柱为Kromasil C18,梯度洗脱,洗脱程序见表1;流速1.0mL·min-1;检测波长:287nm;柱温:30℃;流动相:A为水或磷酸溶液,B为甲醇或乙腈,经组合流动相系统可以为水-甲醇,磷酸溶液-甲醇、水-乙腈、磷酸溶液-乙腈系统。检测结果如图6~图9所示。从图6~图9可以看出,水-甲醇和磷酸溶液-甲醇的系统中各峰能够得到较好的分离,且基线较平稳。此外,水-甲醇系统对色谱柱的伤害小。本发明优选水-甲醇系统为流动相。
综上所述,发明人优选的色谱条件为:Kromasil C18流动相:水-甲醇;梯度洗脱,洗脱梯度见表1;流速1.0mL·min-1;检测波长:287nm;柱温:30℃;进样量10μL。
取加味藿香正气软胶囊按照上述供试品溶液制备方法配制溶液,精密量取该溶液10μL注入高效液相色谱仪,按照上述优选的色谱条件进行测定,结果如图10所示。
发明人在确立了优选的溶液制备方法以及色谱条件后,对该检测方法进行了方法学考察。
系统适应性试验按2010年版《中国药典》中加味藿香正气软胶囊处方及工艺制成不含甘草、白芷、陈皮和厚朴的阴性样品,按照供试品溶液制备方法制得阴性样品溶液。
分别取对照品溶液、供试品溶液和阴性样品溶液各10μL,在上述优选的色谱条件下进样分析,记录色谱图。结果表明橙皮苷、厚朴酚、和厚朴酚、甘草苷与制剂中其他成分达到良好分离,阴性样品在橙皮苷、厚朴酚、和厚朴酚、甘草苷相应的保留时间处无干扰。结果见图11。
线性关系考察精密量取混合对照品溶液0.1mL、0.2mL、1mL、2mL、4mL,分别置于10mL量瓶中,用甲醇稀释至刻度,摇匀,得到系列标准溶液,各进样10μL,平行测定3次。以进样浓度为横坐标,以峰面积为纵坐标作图,得到橙皮苷、厚朴酚、和厚朴酚、甘草苷的回归方程分别为:
y=21170x-42159 r=0.9999
y=17951x-28287 r=0.9999
y=17594x-22494 r=0.9999
y=52526x-26382 r=0.9999
结果表明上述4个成分进样浓度在4.47~178.70μg·mL-1,3.42~136.96μg·mL-1,3.49~139.48μg·mL-1,3.92~157.20μg·mL-1范围内与峰面积积分值呈良好线性关系。
精密度试验精密吸取同一供试品溶液10μL,连续进样6次,结果橙皮苷、厚朴酚、和厚朴酚、甘草苷峰面积的RSD值分别为0.55%,1.07%,1.67%,1.30%,结果表明仪器的精密度良好。
重复性试验按实施例1所述测定方法,对同一批次的5份样品进行含量测定,结果橙皮苷、厚朴酚、和厚朴酚、甘草苷的含量平均值分别为0.17%,0.10%,0.25%,0.24%,RSD值为0.56%,2.27%,1.82%,1.75%,结果表明该方法的重复性良好。
稳定性试验取同一供试品溶液,分别在0,2,4,6,8,12h进样10μL,结果橙皮苷、厚朴酚、和厚朴酚、甘草苷含量的RSD值分别为0.56%,1.05%,2.27%,1.82%,结果表明样品放置在12h内稳定。
回收率试验取110320批加味藿香正气软胶囊,按照实施例1所述供试品溶液制备方法配制溶液,测定含量;精密量取6份供试品溶液(橙皮苷、厚朴酚、和厚朴酚、甘草苷的含量分别为71.4,39.5,103.2,95.4μg·mL-1)各1mL,分别置于10mL容量瓶中,精密加入含橙皮苷70.5μg·mL-1,厚朴酚40.2μg·mL-1,和厚朴酚100.7μg·mL-1,甘草苷95.5μg·mL-1的混合对照品溶液1mL,用50%甲醇定容至刻度,经0.45μm滤膜过滤后,进样测定,结果上述4个成分的平均回收率分别为98.4%,99.5%,97.4%,101.5%,(n=6);RSD值分别为0.56%,0.70%,0.27%,0.14%,符合定量要求。
具体实施例
实施例1
取橙皮苷、厚朴酚、和厚朴酚、甘草苷标准品,溶于甲醇中,制成1mL含橙皮苷0.447mg、厚朴酚0.342mg、和厚朴酚0.349mg、甘草苷0.393mg的混合对照品溶液;
取110402批加味藿香正气软胶囊,内容物置于三角瓶中,精密加入60%乙醇25mL,称重,超声处理(250W,频率40kHz)45min,放冷,称重用60%乙醇补足重量,过滤,滤液过0.45μm滤膜,得供试品溶液;
取供试品溶液10μL注入高效液相色谱仪检测,色谱条件:Kromasil C18;流动相:A为水,B为甲醇;梯度洗脱,洗脱程序见表1;流速1.0mL·min-1;检测波长:287nm;柱温:30℃;
检测结果:橙皮苷0.93mg/粒、厚朴酚0.54mg/粒、和厚朴酚1.36mg/粒、甘草苷1.30mg/粒。
实施例2
取橙皮苷、厚朴酚、和厚朴酚、甘草苷标准品,溶于甲醇中,制成1mL含橙皮苷0.447mg、厚朴酚0.342mg、和厚朴酚0.349mg、甘草苷0.393mg的混合对照品溶液;
取110404批加味藿香正气软胶囊,内容物置于三角瓶中,精密加入40%甲醇25mL,称重,超声处理(250W,频率40kHz)45min,放冷,称重用40%甲醇补足重量,过滤,滤液过0.45μm.滤膜,得供试品溶液;
取供试品溶液10μL注入高效液相色谱仪检测,色谱条件:Shimadzu C18;流动相:A为磷酸溶液,B为甲醇,梯度洗脱,洗脱程序见表1;流速1.0mL·min-1;检测波长:287nm;柱温:30℃;
检测结果:橙皮苷0.97mg/粒、厚朴酚0.56mg/粒、和厚朴酚1.39mg/粒、甘草苷1.31mg/粒。
实施例3
取橙皮苷、厚朴酚、和厚朴酚、甘草苷标准品,溶于甲醇中,制成1mL含橙皮苷0.447mg、厚朴酚0.342mg、和厚朴酚0.349mg、甘草苷0.393mg的混合对照品溶液;
取110406批加味藿香正气软胶囊,内容物置于三角瓶中,精密加入40%乙醇25mL,称重,超声处理(250W,频率40kHz)45min,放冷,称重用40%乙醇补足重量,过滤,滤液过0.45μm.滤膜,得样品溶液;
取样品溶液10μL注入高效液相色谱仪检测,色谱条件:Luna C18;流动相:A为水,B为甲醇;梯度洗脱,洗脱程序见表1;流速1.0mL·min-1;检测波长:287nm;柱温:30℃;
检测结果:橙皮苷0.95mg/粒、厚朴酚0.57mg/粒、和厚朴酚1.35mg/粒、甘草苷1.29mg/粒。
实施例4
取橙皮苷、厚朴酚、和厚朴酚、甘草苷标准品,溶于甲醇中,制成1mL含橙皮苷0.447mg、厚朴酚0.342mg、和厚朴酚0.349mg、甘草苷0.393mg的混合对照品溶液;
取110408批加味藿香正气软胶囊,内容物置于三角瓶中,精密加入80%乙醇25mL,称重,超声处理(250W,频率40kHz)45min,放冷,称重用80%乙醇补足重量,过滤,滤液过0.45μm.滤膜,得样品溶液;
取样品溶液10μL注入高效液相色谱仪检测,色谱条件:Luna C18;流动相:A为磷酸溶液,B为甲醇,梯度洗脱,洗脱程序见表1;流速1.0mL·min-1;检测波长:287nm;柱温:30℃;
检测结果:橙皮苷0.95mg/粒、厚朴酚0.53mg/粒、和厚朴酚1.34mg/粒、甘草苷1.31mg/粒。
Claims (7)
1.一种加味藿香正气软胶囊的检测方法,其特征在于,该方法由以下步骤组成:
(1)取橙皮苷、厚朴酚、和厚朴酚、甘草苷标准品,溶于甲醇或乙腈中,制备混合对照品溶液;
(2)取加味藿香正气软胶囊内容物,加入甲醇溶液或乙醇溶液或乙腈溶液,称重,采用加热回流或索氏提取或超声的方法进行提取,室温下称重,应用提取溶剂补足重量,过滤,制备供试品溶液;
(3)利用高效液相色谱法测定供试品溶液中橙皮苷、厚朴酚、和厚朴酚、甘草苷含量,色谱条件为:
色谱柱为Kromasil C18;流动相:A为水,B为甲醇,梯度洗脱;流速0.7~1.5mL·min-1;检测波长:250~300nm;柱温:15~40℃;进样量:5~15μL;
梯度洗脱的程序为:
0→5min,A为95%~85%,B为5%~15%;
5→12min,A从95%~85%降低到90%~80%,B从5%~15%上升到10%~20%;
12→19min,A从90%~80%降低到75%~65%,B从10%~20%上升到25%~35%;
19→36min,A从75%~65%降低到60%~50%,B从25%~35%上升到40%~50%;
36→48min,A从60%~50%降低到20%~10%,B从40%~50%上升到80%~90%;
48→60min,A从20%~10%降低到15%~5%,B从80%~90%上升到85%~95%;
60→70min,A为15%~5%,B为85%~95%;
(4)根据高效液相色谱分析结果计算供试品中橙皮苷、厚朴酚、和厚朴酚、甘草苷含量。
2.如权利要求1所述检测方法,其特征在于,步骤(1)中混合对照品溶液是将橙皮苷、厚朴酚、和厚朴酚、甘草苷标准品,溶于甲醇或乙腈中,制成1mL含橙皮苷0.447mg、厚朴酚0.342mg、和厚朴酚0.349mg、甘草苷0.393mg的混合溶液。
3.如权利要求1所述检测方法,其特征在于,步骤(2)中甲醇溶液或乙醇溶液或乙腈溶液的浓度为40%~80%。
4.如权利要求3所述检测方法,其特征在于,优选的甲醇溶液或乙醇溶液或乙腈溶液的浓度为60%。
5.如权利要求1所述检测方法,其特征在于,步骤(2)中优选的供试品的提取方法采用超声提取,提取条件为250W,40kHz,45min。
6.如权利要求1所述检测方法,其特征在于,步骤(3)中优选的色谱条件为:色谱柱为Kromasil C18;流动相:A为水,B为甲醇,梯度洗脱;流速1.0mL·min-1;检测波长:287nm;柱温:30℃;进样量:10μL。
7.如权利要求6所述检测方法,其特征在于,优选的流动相:A为水,B为甲醇,梯度洗脱程序为:
0→5min,水为90%,甲醇为10%;
5→12min,水从90%降低到85%,甲醇从10%上升到15%;
12→19min,水从85%降低到70%,甲醇从15%上升到30%;
19→36min,水从70%降低到55%,甲醇从30%上升到45%;
36→48min,水从55%降低到15%,甲醇从45%上升到85%:
48→60min,水从15%降低到10%,甲醇从85%上升到90%:
60→70min,水为10%,甲醇为90%。
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