CN106442834A - 一种益肾安神药物hplc特征图谱的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种补肾安神药物HPLC特征图谱的构建方法，具体的说是用高效液相色谱（HPLC）特征图谱方法来测定益肾安神口服液成品的特征图谱的方法。方法包括：（1）对照品溶液的配制；（2）供试品溶液的配制；（3）色谱柱为Agilent ZORBAX SB‑C18（5μm，4.6×250mm）柱，流动相由A相和B相组成，A相为乙腈，B相为0.05～0.15%的磷酸水溶液，进行梯度洗脱，检测波长为200～260nm，柱温为30～40℃。（4）测定：照高效液相色谱法测定特征图谱。通过对10批益肾安神口服液HPLC特征图谱的对比，确定了10个共有峰，建立了益肾安神口服液标准特征图谱。本发明为益肾安神口服液提供完整、准确的新的评价手段，可有效的控制益肾安神口服液的质量，特别是可作为益肾安神口服液真伪鉴别指标之一。
Description
技术领域 本发明属于中药技术领域，具体涉及一种益肾安神药物的特征图谱构建方法。
背景技术 中药特征图谱是指某种或某几种中药材中所共有的，具有特征性的某类成分的色谱或光谱的图谱。目前，特征图谱已成为国际公认的控制中药或天然药物质量的有效手段，是当前中药界关注的热点问题，近年来，人们已经逐步认识到，只针对某一化学成分而形成的质量控制方法，已经不能恰当的反映中药的内在质量，为了能够更好的控制产品内在质量，加强产品的真实性与有效性。目前，对益肾安神口服液的质量控制，主要是通过枸杞子、石菖蒲、五味子、远志药材的薄层鉴别以及对五味子中五味子醇甲的含量的控制，上述方法虽能在一定程度上检测产品质量，但无法全面的反映产品的质量状况，为弥补其不足，使其质量控制技术更加完善、科学，对其今后的标准化生产提供一种可利用的质量控制模式。构建益肾安神口服液HPLC特征图谱，从整体上更好的控制产品的质量，为药品的生产和临床应用提供了有效保障。
发明内容 本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种益肾安神药物的特征图谱构建方法以及标准特征图谱，该方法采用高效液相色谱法对益肾安神口服液的多种指标性成分进行测定，获得特征图谱；并应用益肾安神口服液特征图谱的构建方法建立益肾安神口服液标准特征图谱。本发明中所述的益肾安神口服液由熟地黄、巴戟天、枸杞子、远志、山药、山茱萸、石菖蒲、肉苁蓉、牛膝、五味子、杜仲、小茴香、楮实子、续断、大枣15味药材经过特有方法加工，加入辅料制备而成。
本发明的HPLC特征图谱的构建方法包括以下步骤：
（1）对照品溶液的制备：精密称取五味子醇甲对照品适量，加甲醇制成每1ml含50μg的溶液。
（2）供试品溶液的制备：取供试品溶液1ml置10ml容量瓶中，加3～5ml的浓度为10～100％甲醇，超声3～10分钟，取出，放冷，用同种溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，取连续滤液，即得。
（3）色谱条件为：色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18（5μm，4.6×250mm）或WondaCract ODS-2（5μm，4.6×250mm）柱或Thermo Syncronis C18（5μm，4.6×250mm）柱，流动相由A相和B相组成，A相为乙腈，B相为0.05～0.15%的磷酸水溶液，进行梯度洗脱，流速为0.5～1. 5ml/分钟，检测波长为200～260nm，柱温为30～40℃，理论塔板数按照五味子醇甲峰计算不低于6000。
（4）测定：分别精密吸取上述两种溶液5～20μl注入高效液相色谱仪，记录60分钟的图谱，用指纹图谱软件进行处理，即得益肾安神口服液特征图谱。
优选的，本发明的HPLC特征图谱的构建方法包括以下步骤：
（1）对照品溶液的制备：精密称取五味子醇甲对照品适量，加甲醇制成每1ml含49.5μg的溶液，作为对照品溶液。
（2）供试品溶液的制备：取供试品溶液1ml置10ml量瓶中，加甲醇适量，超声处理5分钟，取出，放冷，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。
（3）色谱条件：Agilent ZORBAX SB-C18（5μm，4.6×250mm）柱为色谱柱，流动相A相为乙腈，B相为0.05%磷酸水溶液，梯度洗脱，流速为1.0ml/分钟，检测波长为210nm，柱温为35℃，进样量为10μl，理论板数按五味子醇甲峰计算应不低于6000。
（4）测定：精密吸取供试品溶液10µl注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到益肾安神口服液的特征图谱。
优先的，梯度洗脱的时间及流动相比例为：0～10分钟，A相：5～40%、B相：95～60%；10～35分钟，A相：40～70%、B相：60～30%；35～60分钟，A相：70～100%、B相：30～0%；
上述所得益肾安神口服液特征图谱中，确定有10个共有峰。
本发明是通过多批次样品进行试验研究，建立了益肾安神口服液标准特征图谱，能较好地保证益肾安神口服液的质量。目前为止，上述的控制方法尚无公开报道。
用前述益肾安神口服液特征图谱的构建方法建立10批次益肾安神口服液HPLC特征图谱，采用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004年A版）”生成有10个共有峰构成的益肾安神口服液HPLC标准特征图谱。其中第1号峰为五味子醇甲。如图3所示。
在标准特征图谱中，以五味子醇甲为参照峰S峰，计算各共有峰与S峰的相对保留时间，所述相对保留时间在第一规定值的±10%之内，所述第一规定值为：1.00-峰S、1.07-峰2、1.11-峰3、1.17-峰4、1.23-峰5、1.35-峰6、1.38-峰7、1.63-峰8、1.71-峰9、1.73-峰10；所述共有峰的峰面积在第二规定值的±10%之内，所述第二规定值为：1.00-峰S、0.36-峰2、0.28-峰3、0.12-峰4、0.27-峰5、0.15-峰6、0.23-峰7、0.33-峰8、0.15-峰9、0.57-峰10。
取益肾安神口服液样品，按上述同法操作，得到益肾安神口服液样品特征图谱，采用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004年A版）”软件对益肾安神口服液标准特征图谱和样品特征图谱进行分析，相似度大于0.95。
益肾安神口服液相关性研究：共有峰的归属
阴性供试品溶液的制备
分别取益肾安神口服液缺五味子阴性样品、缺续断阴性样品、缺远志阴性样品，缺小茴香阴性样品，缺山茱萸阴性样品，按前述益肾安神口服液特征图谱的构建方法的供试品溶液制备方法制备阴性样品溶液，用0.45μm微孔滤膜滤过，即得。
用前述益肾安神口服液特征图谱的构建方法的色谱条件，取上述阴性样品，照高效液相色谱法进行检测，得益肾安神口服液相关性图谱。如图3所示。
结果：益肾安神口服液标准特征图谱中的10个共有峰，通过阴性样品及对照品做对照，对其进行归属，结果表明：1号峰与8号峰归属为五味子药材；2号峰、3号峰为续断药材；4号峰、6号峰为远志药材；5号峰为小茴香药材；9号峰、10号峰归属为山茱萸药材。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
（1）本发明所公开的供试品处理方法及样品检测方法简单、易操作，特征性成分保留完整，且供试品溶液稳定性良好；
（2）该高效液相方法的精密度高、重现性良好，分析时间短，具有一定的专属性，所得特征图谱中各峰之间分离效果较好。用本发明所提供的方法构建的益肾安神口服液HPLC特征图谱与对照图谱的相似度大于0.95，能有效的表征其质量，有利于全面监控产品质量。
（3）本发明指认了10个特征峰，较完整的保留了供试液中的有效化学成分。通过药材专属性研究，应用本发明可以同时鉴别产品中五味子、续断、远志、小茴香、山茱萸等药材真伪，具有方便、省时、高效等优点。
（4）本发明为益肾安神口服液提供了完整、准确的新的评价手段，可有效的控制益肾安神口服液的质量，有利于全面监控产品质量，特别是可作为益肾安神口服液真伪鉴别指标之一。
附图说明
图1 益肾安神口服液特征图谱；
图2 10批次益肾安神口服液的特征图谱及共有模式；
图3 益肾安神口服液的标准特征图谱；
图4 益肾安神口服液相关性图谱（自下而上图谱依次为：标准HPLC特征图谱
远志阴性HPLC色谱图
续断阴性HPLC色谱图
小茴香阴性HPLC色谱图
山茱萸阴性HPLC色谱图
五味子阴性HPLC色谱图）。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但不限制本发明的范围。
实施例1：益肾安神口服液特征图谱方法确立及方法学考察
仪器：Ultimate 3000型高效液相色谱仪（厂家：美国戴安公司），MS205DU型分析天平（厂家：梅特勒托利多上海仪器有限公司），TP-150超声波清洗仪（北京天鹏仪器有限公司）。
试药：五味子醇甲对照品（来源：中国食品药品检定研究院，批号：110857-201211）、甲醇为色谱纯（厂家：美国（TEDIA）天地试剂公司）、其余试剂为分析纯（均购自北京化工厂）、水为纯化水（自制）、益肾安神口服液（修正药业集团子公司通药制药有限公司提供，批号：140701）。
对照品溶液的制备：精密称取五味子醇甲对照品适量，加甲醇制成每1ml含49.5μg的溶液，作为对照品溶液。
供试品溶液的制备：取供试品溶液1ml置10ml量瓶中，加甲醇适量，超声处理5分钟，取出，放冷，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。
色谱条件：Agilent ZORBAX SB-C18（5μm，4.6×250mm）柱为色谱柱，流动相A相为乙腈，B相为0.05%磷酸水溶液，梯度洗脱，流速为1.0ml/分钟，检测波长为210nm，柱温为35℃，进样量为10μl，理论板数按五味子醇甲峰计算应不低于6000。
前述中，梯度洗脱的时间及流动相比例为：0～10分钟，A相：5～40%、B相：95～60%；10～35分钟，A相：40～70%、B相：60～30%；35～60分钟，A相：70～100%、B相：30～0%；
测定：精密吸取供试品溶液10µl注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到益肾安神口服液的特征图谱。如图1所示。
方法学研究
（1）精密度考察
取批号为140701的供试品，依法制成供试品溶液，连续进样5次，记录色谱图，考察相对保留时间和相对峰面积，共有峰相对保留时间及相对峰面积的RSD均小于3%，表明仪器精密度好。
各共有峰相对保留时间
各共有峰相对峰面积
（2）重现性考察
取批号为140701的供试品，依法制成5份供试品溶液，按上述方法进行检测，考察各色谱峰相对保留时间及相对峰面积比值一致性，结果表明，5份供试品中，共有峰相对保留时间及相对峰面积的RSD均小于3%，表明方法重现性良好。
各共有峰相对保留时间
各共有峰相对峰面积
（3）稳定性考察
取批号为140701的供试品，依法制成供试品溶液，分别在0，3，6，9，12，24小时不同时间点进行检测，分别对共有峰时间以及峰面积比值进行统计，结果：共有峰相对保留时间及相对峰面积的RSD均小于3%，表明样品在24小时内稳定。
各共有峰相对保留时间
各共有峰相对峰面积
益肾安神口服液标准特征图谱的建立及相似度评价
采用实施例1所述的方法测定10个批次益肾安神口服液（批号分别为：140701，140702，140703、140801、140802、140803、140901、140902、140903、150101，由修正药业集团子公司通药制药股份有限公司提供）。
10个批次益肾安神口服液的特征图谱及共有模式如图2所示。
试验了10批样品，以参照峰五味子醇甲的相对保留时间和相对峰面积为1，计算10批样品共有峰相对保留时间以及相对峰面积，其RSD均小于3%。
益肾安神口服液样品10个共有峰的相对保留时间
益肾安神口服液样品10个共有峰的相对保留峰面积
通过10个批次益肾安神口服液HPLC特征图谱的比较，进行相似度评价：采用国家药典委员会“中药色谱特征图谱相似度评价系统（2004年A版）”对10批次益肾安神口服液特征图谱进行相似度计算，10批次益肾安神口服液特征图谱与对照特征图谱（10批次益肾安神口服液生成的共有模式R）相似度均大于0.95。
。
益肾安神口服液10批样品相似度评价
通过上述方法所建立的益肾安神口服液标准特征图谱如图3所示。
Claims (3)
1.一种益肾安神口服液的特征图谱测定方法，包括以下步骤：
(1)对照品溶液的制备：精密称取五味子醇甲对照品适量，加甲醇制成每1ml含50μg的溶液。
(2)供试品溶液的制备：取供试品溶液1ml置10ml容量瓶中，加3～5ml的浓度为10～100％甲醇，超声3～10分钟，取出，放冷，用同种溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，取连续滤液，即得。
(3)色谱条件为：色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18(5μm，4.6×250mm)或Wonda CractODS-2(5μm，4.6×250mm)柱或Thermo Syncronis C18(5μm，4.6×250mm)柱，流动相由A相和B相组成，A相为乙腈，B相为0.05～0.15％的磷酸水溶液，进行梯度洗脱，流速为0.5～1.5ml/分钟，检测波长为200～260nm，柱温为30～40℃，理论塔板数按照五味子醇甲峰计算不低于6000。
(4)测定：分别精密吸取上述两种溶液5～20μl注入高效液相色谱仪，记录60分钟的图谱，用指纹图谱软件进行处理，即得益肾安神口服液特征图谱。
2.根据权利要求1所述的一种益肾安神口服液的特征图谱测定方法，包含以下步骤；
(1)对照品溶液的制备：精密称取五味子醇甲对照品适量，加甲醇制成每1ml含49.5μg的溶液，作为对照品溶液。
(2)供试品溶液的制备：取供试品溶液1ml置10ml量瓶中，加甲醇适量，超声处理5分钟，取出，放冷，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。
(3)色谱条件：Agilent ZORBAX SB-C18(5μm，4.6×250mm)柱为色谱柱，流动相A相为乙腈，B相为0.05％磷酸水溶液，梯度洗脱，流速为1.0ml/分钟，检测波长为210nm，柱温为35℃，进样量为10μl，理论板数按五味子醇甲峰计算应不低于6000。
(4)测定：精密吸取供试品溶液10μl注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到益肾安神口服液的特征图谱。
3.根据权利要求1所述的一种益肾安神口服液的特征图谱测定方法，其特征是：所述梯度洗脱的时间及流动相比例为：0～10分钟，A相：5～40％、B相：95～60％；10～35分钟，A相：40～70％、B相：60～30％；35～60分钟，A相：70～100％、B相：30～0％。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20170222 |