CN114910590B - 一种十味安神颗粒hplc指纹图谱的建立方法及其指纹图谱 - Google Patents
一种十味安神颗粒hplc指纹图谱的建立方法及其指纹图谱 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种十味安神颗粒HPLC指纹图谱的建立方法，该方法包括对照品及供试品溶液的制备、HPLC色谱条件的确定及HPLC标准指纹图谱的制作。同时公开了由该方法得到的十味安神颗粒HPLC标准指纹图谱，该指纹图谱有24个共有峰，通过对照品指认14个共有峰。方法简便、稳定性及重现性好，所得图谱特征峰全面，通过标准指纹图谱共有峰的比对，可对十味安神颗粒的质量进行全面评价和控制，有利于精准评估制剂的内在质量，确保临床用药的安全性、有效性。
Description
技术领域
本发明属于中药制剂分析领域，本发明公开了一种十味安神颗粒HPLC指纹图谱的建立方法及其指纹图谱。
背景技术
十味安神颗粒由山萸肉、五味子、地黄、白芍、牡丹皮、栀子、柴胡、莲子心、知母、酸枣仁10味药物组成，具有治疗失眠、焦虑、抑郁和更年期综合征的作用。
十味安神颗粒制剂是中药复方制剂，含多味中药且化学成分复杂，对其进行有效的质量控制是保证其临床疗效的重要基础。为保证并稳定产品质量，需要对其质量检测和控制法进行全面地研究。
十味安神颗粒HPLC指纹图谱研究能够指认14个共有峰，提供一种十味安神颗粒的HPLC指纹图谱建立方法，有效反映十味安神颗粒化学成分的整体性和复杂性，对制剂质量进行全面地评价和控制，进而保证临床用药的安全性与有效性。
发明内容
本发明的目的是提供一种十味安神颗粒指纹图谱建立方法。具体来说，该方法将十味安神颗粒制备成供试品溶液，经过HPLC分离检测，从而获得十味安神颗粒HPLC标准指纹图谱，实现全方位多方面检测，完善其质量检测体系，进而为十味安神颗粒的真伪鉴别和内在质量提供可靠依据。
本发明一种十味安神颗粒HPLC指纹图谱的建立方法，包括下列步骤。
1)对照品和供试品溶液的制备：称取莫诺苷、马钱苷、栀子苷、芒果苷、新芒果苷、芍药苷、丹皮酚、五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯乙、五味子甲素、五味子乙素、柴胡皂苷A、柴胡皂苷B1对照品适量，用甲醇溶解，作为对照品溶液。
取十味安神颗粒研细，精密称定，加入50%~100%甲醇25~100 ml，超声提取10~30min，放冷，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。
2)HPLC色谱条件的确定：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，以乙腈为流动相A，0.1~0.3%磷酸溶液为流动相B，采用梯度洗脱；检测波长：220~260nm；流速：0.5~1.0ml/min；柱温：30~40℃。
3)指纹图谱的制作：按步骤2)色谱条件对对照品溶液和供试品溶液进行分析比较，得到由样品共有特征峰构成的十味安神颗粒HPLC标准指纹图谱。
优选地，步骤1)所述供试品溶液，按如下步骤制备：取十味安神颗粒研细，取约1.0g，精密称定，加入80%甲醇25 ml，超声提取30min，放冷，滤过，取续滤液，得供试品溶液。
优选地，步骤2)所述的色谱柱为Waters Symmetry C18 Column色谱柱。
进一步优选，所述色谱柱的规格为4.6×250mm，5μm。
优选地，步骤2)所述流动相B为0.1％磷酸溶液。
步骤2)所述梯度洗脱条件为。
。
优选地，所述的检测波长为240nm，流速为0.5~1.0ml/min，柱温为35℃。
本发明的另一个目的，是提供所述十味安神颗粒HPLC标准指纹图谱，将10批十味安神颗粒样品，按上述方法制备成供试品溶液，以HPLC分离检测，使用国家药典委员会推荐的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版》软件分析，得到十味安神颗粒HPLC标准指纹图谱。
本发明所得到的指纹图谱有24个共有峰，以五味子醇甲为参比峰，其共有峰相对保留时间tR依次分别为：0.261 ，0.294 ，0.564 ，0.578 ，0.602 ，0.659 ，0.727 ，0.764 ，0.773 ，0.890 ，0.943 ，0.950 ，0.966 ，0.970，1.013 ，1.020 ，1.025 ，1.044 ，1.058 ，1.095 ，1.127 ，1.134 ，1.138。
通过对照品比对，指认了其中14个共有峰，分别为莫诺苷（1号峰）、新芒果苷（2号峰）、栀子苷（3号峰）、芒果苷（4号峰）、马钱苷（5号峰）、芍药苷（6号峰）、丹皮酚（11号峰）、柴胡皂苷a（12号峰）、柴胡皂苷B1（14号峰）、五味子醇甲（15号峰）、五味子醇乙（18号峰）、五味子酯乙（21号峰）、五味子甲素（22号峰）、五味子乙素（24号峰）。
与现有技术相比，本申请能产生的有益效果包括。
1)本发明一种十味安神颗粒HPLC指纹图谱的建立方法，根据十味安神颗粒的处方成分构成特点，优选最佳的HPLC条件，所得指纹图谱分离度高、峰形好，各特征色谱峰均实现了良好分离，稳定性好、特征峰多，能全面、准确地评价十味安神颗粒的质量，适用于对十味安神颗粒产品质量的控制。
2)本发明检测方法以五味子醇甲为参比峰，确定了24个共有峰为构成十味安神颗粒指纹图谱的共有峰，从共有峰中鉴定出莫诺苷、栀子苷、芒果苷、马钱苷、芍药苷、丹皮酚、五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素、新芒果苷、柴胡皂苷A、柴胡皂苷B1、五味子醇乙、五味子酯乙等14种化学成分，指纹图谱组成更加丰富、全面。
3)本发明建立的十味安神颗粒HPLC指纹图谱克服了现有技术检测指标单一、不能反映内在质量的缺点，所提供的十味安神颗粒HPLC指纹图谱建立方法精密度高、重现性好，通过对比所得指纹图谱中共有峰的有无，可对十味安神颗粒的质量进行全面评价，有效地保证了成品的质量。
附图说明
图1为十味安神颗粒HPLC混合对照图谱。
其中，莫诺苷（1号峰）、新芒果苷（2号峰）、栀子苷（3号峰）、芒果苷（4号峰）、马钱苷（5号峰）、芍药苷（6号峰）、丹皮酚（11号峰）、柴胡皂苷a（12号峰）、柴胡皂苷B1（14号峰）、五味子醇甲（15号峰）、五味子醇乙（18号峰）、五味子酯乙（21号峰）、五味子甲素（22号峰）、五味子乙素（24号峰）。
图2为十味安神颗粒HPLC标准指纹图谱。
图标1-24为24个共有峰，其中，莫诺苷（1号峰）、新芒果苷（2号峰）、栀子苷（3号峰）、芒果苷（4号峰）、马钱苷（5号峰）、芍药苷（6号峰）、丹皮酚（11号峰）、柴胡皂苷a（12号峰）、柴胡皂苷B1（14号峰）、五味子醇甲（15号峰）、五味子醇乙（18号峰）、五味子酯乙（21号峰）、五味子甲素（22号峰）、五味子乙素（24号峰）。
图3为10批十味安神颗粒的HPLC指纹图谱叠加图。
其中，莫诺苷（1号峰）、新芒果苷（2号峰）、栀子苷（3号峰）、芒果苷（4号峰）、马钱苷（5号峰）、芍药苷（6号峰）、丹皮酚（11号峰）、柴胡皂苷a（12号峰）、柴胡皂苷B1（14号峰）、五味子醇甲（15号峰）、五味子醇乙（18号峰）、五味子酯乙（21号峰）、五味子甲素（22号峰）、五味子乙素（24号峰）。
具体实施方式
为了使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚、明晰，以下将结合附图对实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。显而易见，以下实施例是本申请实施例的一部分，而不是全部。因此，以下对实施例的详细描述并非限定本申请要求保护的范围，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所作出的等同替换或修改，均应包含在本发明的保护范围之内。
实施例1十味安神颗粒HPLC标准指纹图谱的建立。
1仪器与试药。
1.1仪器。
Thermo Scientific Vanquish Core HPLC戴安高效液相色谱仪（德国），DAD检测器；KQ5200B型超声波清洗器（昆山市超声仪器厂）；天平 ESJ30-5A（上海精密仪器仪表有限公司）。
1.2试药。
10批十味安神颗粒，样品批号见表1，乙腈为色谱纯，水为纯化水，其余试剂均为分析纯。
表1十味安神颗粒测试样品批号。
。
2方法与结果。
2.1色谱条件：色谱条件Waters Symmetry C18 Column色谱柱(5 μm, 4.6×250mm)，柱温35 ℃，流速1.0 ml/min，检测波长为240nm，进样10µl；流动相：以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B。
按下表进行梯度洗脱。
。
2.2对照品和供试品溶液的制备。
精密称取莫诺苷、马钱苷、栀子苷、芒果苷、新芒果苷、芍药苷、丹皮酚、五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯乙、五味子甲素、五味子乙素、柴胡皂苷A、柴胡皂苷B1混合对照品，加甲醇溶解，作为混合对照品溶液。
取十味安神颗粒研细，取约1.0g，精密称定，加入80%甲醇25 ml，超声提取30min，放冷，滤过，取续滤液，得供试品溶液。
2.3指纹图谱的建立。
将上述对照品溶液和供试品溶液分别注入HPLC色谱系统，测定10个批号十味安神颗粒HPLC指纹图谱，并进行分析比较，得到由其共有特征峰构成的十味安神颗粒HPLC标准指纹图谱。混合对照品溶液的图谱如图1所示，十味安神颗粒HPLC标准指纹图谱如图2所示，其中以15号五味子醇甲峰为参照峰，计算得出该标准指纹图谱具有的共有峰的相对保留时间tR分别为： 0.261 ，0.294 ，0.564 ，0.578 ，0.602 ，0.659 ，0.727 ，0.764 ，0.773 ，0.890 ，0.943 ，0.950 ，0.966 ，0.970，1.013 ，1.020 ，1.025 ，1.044 ，1.058 ，1.095 ，1.127 ，1.134 ，1.138。
其中，莫诺苷（1号峰）、新芒果苷（2号峰）、栀子苷（3号峰）、芒果苷（4号峰）、马钱苷（5号峰）、芍药苷（6号峰）、丹皮酚（11号峰）、柴胡皂苷a（12号峰）、柴胡皂苷B1（14号峰）、五味子醇甲（15号峰）、五味子醇乙（18号峰）、五味子酯乙（21号峰）、五味子甲素（22号峰）、五味子乙素（24号峰）。
将10个批号十味安神颗粒HPLC指纹图谱导入药典委员会推荐的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版》软件分析，进行色谱峰匹配，确定24个共有峰为构成十味安神颗粒指纹图谱的特征峰，以15号五味子醇甲色谱峰为参照峰，样品共有峰的相对保留时间分别列于表2，10批十味安神颗粒共有峰的相对峰面积见表3。10批十味安神颗粒与标准指纹图谱相似度计算结果依次为1.000，0.999，1.000，1.000，1.000，1.000，1.000，1.000，1.000，1.000。10批十味安神颗粒的HPLC指纹图谱叠加图如图3所示。
表2 10批十味安神颗粒共有峰的相对保留时间(tR)。
| 序号 | S1 | S2 | S3 | S4 | S5 | S6 | S7 | S8 | S9 | S10 |
| 1 | 0.260 | 0.261 | 0.261 | 0.262 | 0.262 | 0.263 | 0.260 | 0.262 | 0.262 | 0.262 |
| 2 | 0.290 | 0.291 | 0.293 | 0.295 | 0.296 | 0.298 | 0.287 | 0.295 | 0.297 | 0.297 |
| 3 | 0.563 | 0.563 | 0.563 | 0.564 | 0.565 | 0.565 | 0.563 | 0.564 | 0.565 | 0.565 |
| 4 | 0.576 | 0.576 | 0.577 | 0.578 | 0.579 | 0.579 | 0.576 | 0.578 | 0.579 | 0.579 |
| 5 | 0.601 | 0.601 | 0.601 | 0.602 | 0.602 | 0.602 | 0.601 | 0.602 | 0.602 | 0.602 |
| 6 | 0.658 | 0.658 | 0.659 | 0.659 | 0.659 | 0.659 | 0.658 | 0.659 | 0.659 | 0.659 |
| 7 | 0.726 | 0.727 | 0.727 | 0.727 | 0.728 | 0.728 | 0.727 | 0.728 | 0.728 | 0.728 |
| 8 | 0.763 | 0.763 | 0.763 | 0.764 | 0.764 | 0.764 | 0.763 | 0.764 | 0.764 | 0.764 |
| 9 | 0.772 | 0.772 | 0.772 | 0.773 | 0.773 | 0.773 | 0.772 | 0.773 | 0.773 | 0.773 |
| 10 | 0.890 | 0.890 | 0.890 | 0.890 | 0.890 | 0.890 | 0.890 | 0.890 | 0.890 | 0.890 |
| 11 | 0.943 | 0.943 | 0.943 | 0.943 | 0.943 | 0.943 | 0.943 | 0.944 | 0.944 | 0.944 |
| 12 | 0.951 | 0.951 | 0.951 | 0.950 | 0.950 | 0.950 | 0.950 | 0.950 | 0.950 | 0.950 |
| 13 | 0.966 | 0.966 | 0.966 | 0.966 | 0.966 | 0.966 | 0.966 | 0.966 | 0.966 | 0.966 |
| 14 | 0.970 | 0.970 | 0.970 | 0.970 | 0.970 | 0.970 | 0.970 | 0.969 | 0.969 | 0.970 |
| 15 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 |
| 16 | 1.012 | 1.012 | 1.012 | 1.013 | 1.013 | 1.013 | 1.013 | 1.013 | 1.013 | 1.013 |
| 17 | 1.019 | 1.019 | 1.019 | 1.020 | 1.020 | 1.020 | 1.020 | 1.020 | 1.020 | 1.020 |
| 18 | 1.025 | 1.025 | 1.025 | 1.025 | 1.025 | 1.025 | 1.025 | 1.025 | 1.025 | 1.025 |
| 19 | 1.044 | 1.044 | 1.044 | 1.044 | 1.044 | 1.044 | 1.044 | 1.044 | 1.044 | 1.044 |
| 20 | 1.058 | 1.058 | 1.058 | 1.058 | 1.058 | 1.058 | 1.058 | 1.058 | 1.058 | 1.058 |
| 21 | 1.094 | 1.094 | 1.095 | 1.095 | 1.095 | 1.095 | 1.095 | 1.095 | 1.095 | 1.095 |
| 22 | 1.127 | 1.127 | 1.127 | 1.128 | 1.128 | 1.128 | 1.128 | 1.128 | 1.128 | 1.128 |
| 23 | 1.134 | 1.134 | 1.134 | 1.134 | 1.134 | 1.134 | 1.134 | 1.135 | 1.135 | 1.135 |
| 24 | 1.137 | 1.137 | 1.138 | 1.138 | 1.138 | 1.138 | 1.138 | 1.138 | 1.138 | 1.138 |
表3 10批十味安神颗粒共有峰的相对峰面积(％)。
| 序号 | S1 | S2 | S3 | S4 | S5 | S6 | S7 | S8 | S9 | S10 |
| 1 | 0.260 | 0.261 | 0.261 | 0.262 | 0.262 | 0.263 | 0.260 | 0.262 | 0.262 | 0.262 |
| 2 | 0.290 | 0.291 | 0.293 | 0.295 | 0.296 | 0.298 | 0.287 | 0.295 | 0.297 | 0.297 |
| 3 | 0.563 | 0.563 | 0.563 | 0.564 | 0.565 | 0.565 | 0.563 | 0.564 | 0.565 | 0.565 |
| 4 | 0.576 | 0.576 | 0.577 | 0.578 | 0.579 | 0.579 | 0.576 | 0.578 | 0.579 | 0.579 |
| 5 | 0.601 | 0.601 | 0.601 | 0.602 | 0.602 | 0.602 | 0.601 | 0.602 | 0.602 | 0.602 |
| 6 | 0.658 | 0.658 | 0.659 | 0.659 | 0.659 | 0.659 | 0.658 | 0.659 | 0.659 | 0.659 |
| 7 | 0.726 | 0.727 | 0.727 | 0.727 | 0.728 | 0.728 | 0.727 | 0.728 | 0.728 | 0.728 |
| 8 | 0.763 | 0.763 | 0.763 | 0.764 | 0.764 | 0.764 | 0.763 | 0.764 | 0.764 | 0.764 |
| 9 | 0.772 | 0.772 | 0.772 | 0.773 | 0.773 | 0.773 | 0.772 | 0.773 | 0.773 | 0.773 |
| 10 | 0.890 | 0.890 | 0.890 | 0.890 | 0.890 | 0.890 | 0.890 | 0.890 | 0.890 | 0.890 |
| 11 | 0.943 | 0.943 | 0.943 | 0.943 | 0.943 | 0.943 | 0.943 | 0.944 | 0.944 | 0.944 |
| 12 | 0.951 | 0.951 | 0.951 | 0.950 | 0.950 | 0.950 | 0.950 | 0.950 | 0.950 | 0.950 |
| 13 | 0.966 | 0.966 | 0.966 | 0.966 | 0.966 | 0.966 | 0.966 | 0.966 | 0.966 | 0.966 |
| 14 | 0.970 | 0.970 | 0.970 | 0.970 | 0.970 | 0.970 | 0.970 | 0.969 | 0.969 | 0.970 |
| 15 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 |
| 16 | 1.012 | 1.012 | 1.012 | 1.013 | 1.013 | 1.013 | 1.013 | 1.013 | 1.013 | 1.013 |
| 17 | 1.019 | 1.019 | 1.019 | 1.020 | 1.020 | 1.020 | 1.020 | 1.020 | 1.020 | 1.020 |
| 18 | 1.025 | 1.025 | 1.025 | 1.025 | 1.025 | 1.025 | 1.025 | 1.025 | 1.025 | 1.025 |
| 19 | 1.044 | 1.044 | 1.044 | 1.044 | 1.044 | 1.044 | 1.044 | 1.044 | 1.044 | 1.044 |
| 20 | 1.058 | 1.058 | 1.058 | 1.058 | 1.058 | 1.058 | 1.058 | 1.058 | 1.058 | 1.058 |
| 21 | 1.094 | 1.094 | 1.095 | 1.095 | 1.095 | 1.095 | 1.095 | 1.095 | 1.095 | 1.095 |
| 22 | 1.127 | 1.127 | 1.127 | 1.128 | 1.128 | 1.128 | 1.128 | 1.128 | 1.128 | 1.128 |
| 23 | 1.134 | 1.134 | 1.134 | 1.134 | 1.134 | 1.134 | 1.134 | 1.135 | 1.135 | 1.135 |
| 24 | 1.137 | 1.137 | 1.138 | 1.138 | 1.138 | 1.138 | 1.138 | 1.138 | 1.138 | 1.138 |
2.4方法学考察。
2.4.1精密度试验。
取样品(20210301)，按照2.2项下方法制备供试品溶液，连续进样6次，以15号五味子醇甲峰为参照峰，计算出1-24号共有色谱峰相对保留时间的RSD<0.27％、相对峰面积的RSD<1.83％，同时用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版》软件计算各色谱指纹图谱的相似度均大于0.99，表明仪器稳精密度良好。
2.4.2稳定性试验。
取样品(20210301)，按照2.2项下方法制备供试品溶液，分别在0，3，6，9，12，18，24h进样，以15号五味子醇甲峰为参照峰，计算出1-24号共有峰相对保留时间的RSD<0.73％，相对峰面积的RSD<2.86％，同时用相似度评价软件计算各色谱指纹图谱的相似度均大于0.99，表明供试品溶液在24小时内稳定。
2.4.3重现性试验。
取同一批号样品(20210301)，分别精密量取6份，按照2.2项下方法制备供试品溶液，分别进样，以15号五味子醇甲峰为参照峰，计算出1-24号共有峰相对保留时间的RSD<0.66％，相对峰面积的RSD<1.92％，同时用相似度评价软件计算各色谱指纹图谱的相似度均大于0.99，表明方法重现性良好。
实施例2十味安神颗粒HPLC标准指纹图谱的建立。
1仪器与试药。
1.1仪器。
Thermo Scientific Vanquish Core HPLC戴安高效液相色谱仪（德国），DAD检测器；KQ5200B型超声波清洗器（昆山市超声仪器厂）；天平 ESJ30-5A（上海精密仪器仪表有限公司）。
1.2试药。
10批十味安神颗粒，样品批号见表1，乙腈为色谱纯，水为纯化水，其余试剂均为分析纯。
2方法与结果。
2.1色谱条件：色谱条件Waters Symmetry C18 Column色谱柱(5 μm, 4.6×250mm)，柱温35 ℃，流速1.0 ml/min，检测波长为240nm，进样10µl；流动相：以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B。
按下表进行梯度洗脱。
| 时间 | 流速（ml/min） | 流动相A（%） | 流动相B（%） |
| 0~15 | 1 | 7 | 93 |
| 15~15.1 | 1→0.5 | 7 | 93 |
| 15.1~20 | 0.5 | 7 | 93 |
| 20~22 | 0.5 | 7→10 | 93→90 |
| 22~40 | 0.5 | 10→14 | 90→86 |
| 40~40.1 | 0.5→1.0 | 14 | 86 |
| 40.1~50 | 1.0 | 14→22 | 86→78 |
| 50~52 | 1.0 | 22→30 | 78→70 |
| 52~70 | 1.0 | 30→70 | 70→30 |
| 70~71 | 1.0 | 70→90 | 30→10 |
| 71~80 | 1.0 | 90 | 10 |
2.2对照品和供试品溶液的制备。
精密称取莫诺苷、马钱苷、栀子苷、芒果苷、新芒果苷、芍药苷、丹皮酚、五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯乙、五味子甲素、五味子乙素、柴胡皂苷A、柴胡皂苷B1混合对照品，加80%甲醇溶解，作为混合对照品溶液。
取十味安神颗粒研细，取约1.0g，精密称定，加入50%甲醇25 ml，超声提取20min，放冷，滤过，取续滤液，得供试品溶液。
2.3指纹图谱的建立。
将上述对照品溶液和供试品溶液分别注入HPLC色谱系统，测定10个批号十味安神颗粒HPLC指纹图谱，并进行分析比较，得到由其共有特征峰构成的十味安神颗粒HPLC标准指纹图谱。混合对照品溶液的图谱如图1所示，十味安神颗粒HPLC标准指纹图谱如图2所示，其中以15号五味子醇甲峰为参照峰，计算得出该标准指纹图谱具有的共有峰的相对保留时间tR分别为： 0.261 ，0.294 ，0.564 ，0.578 ，0.602 ，0.659 ，0.727 ，0.764 ，0.773 ，0.890 ，0.943 ，0.950 ，0.966 ，0.970，1.013 ，1.020 ，1.025 ，1.044 ，1.058 ，1.095 ，1.127 ，1.134 ，1.138。
实施例3十味安神颗粒HPLC标准指纹图谱的建立。
1仪器与试药。
1.1仪器。
Thermo Scientific Vanquish Core HPLC戴安高效液相色谱仪（德国），DAD检测器；KQ5200B型超声波清洗器（昆山市超声仪器厂）；天平 ESJ30-5A（上海精密仪器仪表有限公司）。
1.2试药。
10批十味安神颗粒，样品批号见表1，乙腈为色谱纯，水为纯化水，其余试剂均为分析纯。
2方法与结果。
2.1色谱条件：色谱条件Waters Symmetry C18 Column色谱柱(5 μm, 4.6×250mm)，柱温35 ℃，流速1.0 ml/min，检测波长为240nm，进样10µl；流动相：以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B。
按下表进行梯度洗脱。
| 时间 | 流速（ml/min） | 流动相A（%） | 流动相B（%） |
| 0~15 | 1 | 7 | 93 |
| 15~15.1 | 1→0.5 | 7 | 93 |
| 15.1~20 | 0.5 | 7 | 93 |
| 20~22 | 0.5 | 7→10 | 93→90 |
| 22~40 | 0.5 | 10→14 | 90→86 |
| 40~40.1 | 0.5→1.0 | 14 | 86 |
| 40.1~50 | 1.0 | 14→22 | 86→78 |
| 50~52 | 1.0 | 22→30 | 78→70 |
| 52~70 | 1.0 | 30→70 | 70→30 |
| 70~71 | 1.0 | 70→90 | 30→10 |
| 71~80 | 1.0 | 90 | 10 |
2.2对照品和供试品溶液的制备。
精密称取莫诺苷、马钱苷、栀子苷、芒果苷、新芒果苷、芍药苷、丹皮酚、五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯乙、五味子甲素、五味子乙素、柴胡皂苷A、柴胡皂苷B1混合对照品，加80%甲醇溶解，作为混合对照品溶液。
取十味安神颗粒研细，取约1.0g，精密称定，加入甲醇25 ml，超声提取10min，放冷，滤过，取续滤液，得供试品溶液。
2.3指纹图谱的建立。
将上述对照品溶液和供试品溶液分别注入HPLC色谱系统，测定10个批号十味安神颗粒HPLC指纹图谱，并进行分析比较，得到由其共有特征峰构成的十味安神颗粒HPLC标准指纹图谱。混合对照品溶液的图谱如图1所示，十味安神颗粒HPLC标准指纹图谱如图2所示，其中以15号五味子醇甲峰为参照峰，计算得出该标准指纹图谱具有的共有峰的相对保留时间tR分别为： 0.266 ，0.304 ，0.566 ，0.581 ，0.603 ，0.660 ，0.729 ，0.764 ，0.774 ，0.890 ，0.944 ，0.950 ，0.966 ，0.970，1.013 ，1.020 ，1.025 ，1.044 ，1.058 ，1.095 ，1.127 ，1.134 ，1.138。
Claims (7)
1.一种十味安神颗粒HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于，包括下列步骤：
1）对照品和供试品溶液的制备：称取莫诺苷、马钱苷、栀子苷、芒果苷、新芒果苷、芍药苷、丹皮酚、五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯乙、五味子甲素、五味子乙素、柴胡皂苷A、柴胡皂苷B1对照品适量，用甲醇溶解，作为对照品溶液；
取十味安神颗粒研细，精密称定，加入50%~100%甲醇25~100ml，超声提取10~30min，放冷，滤过，取续滤液，即得；
2）HPLC色谱条件的确定：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，规格为4.6×250mm，5μm，以乙腈为流动相A，0.1~0.3%磷酸溶液为流动相B，采用梯度洗脱；检测波长：220~260nm；流速：0.5~1.0ml/min；柱温：30~40℃；梯度洗脱条件为：t0~15,1ml/min,7%A;t15~15.1,1.0→0.5ml/min,7%A;t15.1~20,0.5ml/min,7%A;t20~22,0.5ml/min,7%→10%A;t22~40,0.5ml/min,10%→14%A;t40~40.1,0.5→1.0ml/min,14%A;t40.1~50,1.0ml/min,14%→22%A;t50~52,1.0ml/min,22%→30%A;t52~70,1.0ml/min,30%→70%A;t70~71,1.0ml/min,70%→90%A;t71~80,1.0ml/min,90%A；
3）指纹图谱的制作：按步骤2）色谱条件对对照品溶液和供试品溶液进行分析比较，得到由样品共有特征峰构成的十味安神颗粒HPLC标准指纹图谱。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1）所述供试品溶液，按如下步骤制备：取十味安神颗粒研细，取约1.0g，精密称定，加入80%甲醇25 ml，超声提取30min，放冷，滤过，取续滤液，得供试品溶液。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2）所述的色谱柱为Waters SymmetryC18 Column色谱柱。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2）所述流动相B为0.1%磷酸溶液。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)所述的检测波长为240nm，流速为0.5~1.0ml/min，柱温为35℃。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，指纹图谱包括24个共有峰，以五味子醇甲为参比峰，各共有峰保留时间与参比峰保留时间比值分别为：0.261，0.294，0.564，0.578，0.602，0.659，0.727，0.764，0.773，0.890，0.943，0.950，0.966，0.970，1.013，1.020，1.025，1.044，1.058，1.095，1.127，1.134，1.138。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，指纹图谱包括24个共有峰，分别为1号峰为莫诺苷、2号峰为新芒果苷、3号峰为栀子苷、4号峰为芒果苷、5号峰为马钱苷、6号峰为芍药苷、11号峰为丹皮酚、12号峰为柴胡皂苷a、14号峰为柴胡皂苷B1、15号峰为五味子醇甲、18号峰为五味子醇乙、21号峰为五味子酯乙、22号峰为五味子甲素、24号峰为五味子乙素。
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