CN110286183B - 一种止得咳颗粒hplc指纹图谱及其质量分析方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种止得咳颗粒HPLC指纹图谱及其质量分析方法，所述质量分析方法是运用聚类分析法对止得咳颗粒样品的指纹图谱进行分析，将多个批次样品的共有峰的峰面积经归一化处理后作为变量，导入IBM SPSS Statistics20.0软件，选择离差平方和法，以欧式距离作为样品的度量标准，得出树状聚类图，分别将多批次止得咳颗粒进行分类，评价止得咳颗粒的质量。能够更加精准的评价止得咳颗粒的综合质量得分，为建立完善的止得咳颗粒质量标准提供依据，以期建立止得咳颗粒的质量控制与评价体系。

Description

一种止得咳颗粒HPLC指纹图谱及其质量分析方法

技术领域

本发明属于药品分析技术领域，尤其是涉及一种止得咳颗粒HPLC指纹图谱及其质量分析方法。

背景技术

止得咳颗粒系广西中医药大学附属瑞康医院的院内制剂，是由龙脷叶、射干、桔梗、黄芩、柴胡等十味药材组成的中药复方制剂，具有宣肺止咳、化痰利咽的功效。该颗粒剂的相关研究尚处在初级阶段，至今有关止得咳颗粒整体质量控制的研究并未完善。现行的质控方法仅用简单的薄层定性鉴别以及黄芩苷、次野鸢尾黄素2种化学成分表征该制剂的质量，标准相对较低，无法表征该复方制剂化学物质成分群，难以全面控制止得咳颗粒的内在质量，一定程度上限制了该制剂的应用和发展。

近年来，中药指纹图谱分析技术的广泛应用推动了其发展，不仅提升了中药材和中成药的质量标准也让产品整体质量水平得以进步。但目前没有关于止得咳颗粒指纹图谱的研究，且目前对指纹图谱的评价多采用相似度分析作为基本评价方法，有部分人指出指纹图谱中峰面积过大及峰高较高的主导色谱峰会对相似度的准确性产生一定的影响，但相关方面的研究有限。

因此，现阶段需研究一种止得咳颗粒HPLC指纹图谱，并构建一种质量分析方法，建立完善的止得咳颗粒质量标准提供依据，以期建立止得咳颗粒的质量控制与评价体系。

发明内容

针对上述问题，本发明提供一种止得咳颗粒HPLC指纹图谱及其质量分析方法，建立了止得咳颗粒HPLC指纹图谱，通过多种分析模式为系统评价其内在质量提供依据。

为此，本发明提供的方案是：

一种止得咳颗粒HPLC指纹图谱，其构建方法具体包括如下步骤：

(1)：将止得咳颗粒按照下述提取方法制成待检样，备用；所述提取方法为：取止得咳颗粒，精密加入纯水，定量后置超声仪中超声提取25-30min，取出放冷至室温，用纯水补足失重，于12000-13000r·min^-1下离心10-12min，用0.45μm微孔滤膜滤过上清液，即为待检样备用；所述止得咳颗粒与纯水的质量比为2.0：9-10；

(2)：分别精密称取对照品黄芩苷、次野鸢尾黄素、汉黄芩素、柴胡皂苷d，加甲醇配制得混合对照品溶液；

(3)：将所述待检样、混合对照品溶液分别进行高效液相色谱分析，将待检样的色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统，采用中位数法建立止得咳颗粒的HPLC指纹图谱。

进一步地，在步骤(1)中，所述提取方法中的纯水，可替换为甲醇或乙醇。

进一步地，所述混合对照品溶液包括浓度为0.3-0.5mg·mL^-1黄芩苷、浓度为0.015-0.025mg·mL^-1次野鸢尾黄素、浓度为0.003-0.005mg·mL^-1汉黄芩素、0.4-0.5mg·mL^-1浓度为柴胡皂苷d。

进一步地，所述色谱分析的条件设置如下：Agilent ZORBAX Eclipse Plus-C18色谱柱，4.6mm×250mm,5μm，柱温30℃；检测波长为254nm；进样量为10μL；流动相为甲醇和0.2％磷酸溶液，流速0.8mL·min^-1。

进一步地，梯度洗脱设置为甲醇：0～30min，5％～20％；30～50min，20％～35％；50～75min，35％～40％；75～110min，40％～60％；110～150min，60％～90％。

进一步地，所述止得咳颗粒的HPLC指纹图谱中有31个特征共有峰，将混合对照品溶液在相同色谱条件下进样分析，通过比较保留时间和紫外吸收光谱进行峰定位，对各峰进行指认，其中20号峰为黄芩苷，28号峰为次野鸢尾黄素，30号峰为汉黄芩素，31号峰为柴胡皂苷d。

本发明提供所述止得咳颗粒的质量分析方法，是运用聚类分析法对多批次止得咳颗粒样品的指纹图谱进行分析，分析待检验指纹图谱与对照图谱的相似度R，具体是将多个批次待检样的共有峰的峰面积经归一化处理后作为变量，导入IBM SPSS Statistics20.0软件，选择离差平方和法，以欧式距离作为度量标准，得出树状聚类图,当R≤0.9时，说明待检样不合格；当R＞0.9时，说明待检验合格；

当欧式距离为＞20时，分为两类，其中第一类0.991＜R₁＜0.994,说明待检验品质良，第二类R₂≥0.995，说明待检验品质优；

当4≤欧式距离≤20时，分为三类，其中第一类0.991＜R₁≤0.993，说明待检验品质中,第二类0.993≤R₂＜0.995，说明待检验品质良，第三类R₃≥0.995，说明待检验品质优；

当欧式距离＜4时，分为四类，其中第一类0.991＜R₁≤0.993，说明待检验品质中,第二类0.993≤R₂＜0.995，说明待检验品质良，第三类0.995≤R₃＜0.996，说明待检验品质优，第三类R₄≥0.997，说明待检验品质特优。

本发明具有以下有益效果：

1.本发明为了提升止得咳颗粒的质量标准，本研究按照中药指纹图谱研究技术要求，首次采用HPLC技术对止得咳颗粒进行指纹图谱研究，建立止得咳颗粒指纹图谱，具有重现性好、精密度高、稳定性好的特点，通过比较指纹图谱能有效地鉴别止得咳颗粒的品质优劣，去除主导色谱峰后相似度的大小规律相接近，因此得出去除主导色谱峰后所得相似度结果更与实际情况相符的结论。通过本发明方法能够更精准有效的区别不同品质的药品，完善止得咳颗粒的质量评价体系。

2.本发明通过应用聚类分析研究不同批次样品的差异，为建立完善的止得咳颗粒质量标准提供依据，以期建立止得咳颗粒的质量控制与评价体系。确保止得咳颗粒成分的真实、安全、有效、稳定和一致性，为进一步开发、制定其中药材标准提供参考依据，规范、保障临床用药。

附图说明

附图1为本发明10批止得咳颗粒样品叠加指纹图谱。

附图2为本发明止得咳颗粒共有模式指纹图谱。

附图3为本发明混合对照品色谱图。

附图4为本发明10批止得咳颗粒样品指纹图谱聚类分析结果。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步说明，但不作为是对本发明的限制。

实施例1

一种止得咳颗粒HPLC指纹图谱，其构建方法具体包括如下步骤：

(1)：将止得咳颗粒按照下述提取方法制成待检样，备用；所述提取方法为：取止得咳颗粒，精密加入纯水，定量后置超声仪中超声提取25min，取出放冷至室温，用纯水补足失重，于12000r·min^-1下离心10min，用0.45μm微孔滤膜滤过上清液，即为待检样备用；所述止得咳颗粒与纯水的质量比为2.0：9；

(2)：分别精密称取对照品黄芩苷、次野鸢尾黄素、汉黄芩素、柴胡皂苷d，加甲醇配制得混合对照品溶液，所述混合对照品溶液包括浓度为0.371mg·mL^-1黄芩苷、浓度为0.02mg·mL^-1次野鸢尾黄素、浓度为0.004mg·mL^-1汉黄芩素、0.464mg·mL^-1浓度为柴胡皂苷d；

(3)：将所述待检样、混合对照品溶液分别进行高效液相色谱分析，将待检样的色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统，采用中位数法建立止得咳颗粒的HPLC指纹图谱；所述色谱分析的条件设置如下：Agilent ZORBAX Eclipse Plus-C18色谱柱，4.6mm×250mm,5μm，柱温30℃；检测波长为254nm；进样量为10μL；流动相为甲醇和0.2％磷酸溶液，流速0.8mL·min^-1；梯度洗脱设置为甲醇：0～30min，5％～20％；30～50min，20％～35％；50～75min，35％～40％；75～110min，40％～60％；110～150min，60％～90％；

所述止得咳颗粒的HPLC指纹图谱中有31个特征共有峰，将混合对照品溶液在相同色谱条件下进样分析，通过比较保留时间和紫外吸收光谱进行峰定位，对各峰进行指认，其中20号峰为黄芩苷，28号峰为次野鸢尾黄素，30号峰为汉黄芩素，31号峰为柴胡皂苷d。

实施例2

一种止得咳颗粒HPLC指纹图谱，其构建方法具体包括如下步骤：

(1)：将止得咳颗粒按照下述提取方法制成待检样，备用；所述提取方法为：取止得咳颗粒，精密加入纯水，定量后置超声仪中超声提取30min，取出放冷至室温，用纯水补足失重，于13000r·min^-1下离心12min，用0.45μm微孔滤膜滤过上清液，即为待检样备用；所述止得咳颗粒与纯水的质量比为2.0：10；

(2)：分别精密称取对照品黄芩苷、次野鸢尾黄素、汉黄芩素、柴胡皂苷d，加甲醇配制得混合对照品溶液，所述混合对照品溶液包括浓度为0.3mg·mL^-1黄芩苷、浓度为0.015mg·mL^-1次野鸢尾黄素、浓度为0.003mg·mL^-1汉黄芩素、0.4mg·mL^-1浓度为柴胡皂苷d；

(3)：将所述待检样、混合对照品溶液分别进行高效液相色谱分析，将待检样的色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统，采用中位数法建立止得咳颗粒的HPLC指纹图谱；所述色谱分析的条件设置如下：Agilent ZORBAX Eclipse Plus-C18色谱柱，4.6mm×250mm,5μm，柱温30℃；检测波长为254nm；进样量为10μL；流动相为甲醇和0.2％磷酸溶液，流速0.8mL·min^-1；梯度洗脱设置为甲醇：0～30min，5％～20％；30～50min，20％～35％；50～75min，35％～40％；75～110min，40％～60％；110～150min，60％～90％；

所述止得咳颗粒的HPLC指纹图谱中有31个特征共有峰，将混合对照品溶液在相同色谱条件下进样分析，通过比较保留时间和紫外吸收光谱进行峰定位，对各峰进行指认，其中20号峰为黄芩苷，28号峰为次野鸢尾黄素，30号峰为汉黄芩素，31号峰为柴胡皂苷d。

实施例3

一种止得咳颗粒HPLC指纹图谱，其构建方法具体包括如下步骤：

(1)：将止得咳颗粒按照下述提取方法制成待检样，备用；所述提取方法为：取止得咳颗粒，精密加入纯水，定量后置超声仪中超声提取28min，取出放冷至室温，用纯水补足失重，于12500r·min^-1下离心11min，用0.45μm微孔滤膜滤过上清液，即为待检样备用；所述止得咳颗粒与纯水的质量比为2.0：9.5；

(2)：分别精密称取对照品黄芩苷、次野鸢尾黄素、汉黄芩素、柴胡皂苷d，加甲醇配制得混合对照品溶液，所述混合对照品溶液包括浓度为0.5mg·mL^-1黄芩苷、浓度为0.025mg·mL^-1次野鸢尾黄素、浓度为0.005mg·mL^-1汉黄芩素、0.5mg·mL^-1浓度为柴胡皂苷d；

(3)：将所述待检样、混合对照品溶液分别进行高效液相色谱分析，将待检样的色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统，采用中位数法建立止得咳颗粒的HPLC指纹图谱；所述色谱分析的条件设置如下：Agilent ZORBAX Eclipse Plus-C18色谱柱，4.6mm×250mm,5μm，柱温30℃；检测波长为254nm；进样量为10μL；流动相为甲醇和0.2％磷酸溶液，流速0.8mL·min^-1；梯度洗脱设置为甲醇：0～30min，5％～20％；30～50min，20％～35％；50～75min，35％～40％；75～110min，40％～60％；110～150min，60％～90％；

所述止得咳颗粒的HPLC指纹图谱中有31个特征共有峰，将混合对照品溶液在相同色谱条件下进样分析，通过比较保留时间和紫外吸收光谱进行峰定位，对各峰进行指认，其中20号峰为黄芩苷，28号峰为次野鸢尾黄素，30号峰为汉黄芩素，31号峰为柴胡皂苷d。

实验验证：

选取10批次止得咳颗粒S1-S10进行下述试验，均由广西中医药大学附属瑞康医院提供，S1-S10批号依次为：20181201、20181202、20181203、20181223、20181224、20181225、20181226、20190110、20190111、20190112。

1.精密度试验

取止得咳颗粒样品S1，按实施例1中步骤(1)方法制备1份供试品溶液，按步骤(3)色谱条件连续进样6次，以黄芩苷(20号峰)为参照峰，考察各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果见表1-表2，显示各共有峰的相对保留时间RSD＜0.88％，相对峰面积RSD＜4.52％，实验说明仪器精密度良好。

RSD计算说明：

各共有峰相对保留时间＝各共有峰的保留时间/参照峰的保留时间

各共有峰相对峰面积＝各共有峰的峰面积/参照峰的峰面积

相对标准偏差(RSD)＝标准偏差(SD)/计算结果的算术平均值(X)

表1相对保留时间

表2相对峰面积

2.重复性试验

取止得咳颗粒样品S1，按实施例1中步骤(1)方法平行制备供试品溶液6份，以黄芩苷(20号峰)为参照峰，考察各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果见表3-表4，各共有峰的相对保留时间RSD＜0.68％，相对峰面积RSD＜4.77％，结果表明该分析方法重复性良好。

表3相对保留时间

表4相对峰面积

3.稳定性试验

取止得咳颗粒样品S1，按实施例1中步骤(1)方法制备1份供试品溶液，于制备后0、4、8、10、12、24、48h进样测定，记录色谱图，以黄芩苷(20号峰)为参照峰，考察各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果见表5-表6，显示各共有峰的相对保留时间RSD＜0.88％，相对峰面积RSD＜4.75％，表明样品溶液在48h内稳定性良好。

表5相对保留时间

表6相对峰面积

4.样品图谱的采集和对照指纹图谱的建立

取止得咳颗粒样品S1，按实施例1中步骤(1)方法制备10批次止得咳颗粒的样品溶液，步骤(3)色谱条件分别进样测定各批次的色谱图，得到10批颗粒剂的叠加指纹图谱，见图1。以样品S1为参照谱经多点校正后对10批颗粒剂的指纹图谱进行峰匹配，生成止得咳颗粒指纹图谱的共有模式并标定31个共有峰，共有模式指纹图谱见图2。

5.指纹图谱少量色谱峰的指认

将混合对照品溶液在相同色谱条件下进样分析，通过比较保留时间和紫外吸收光谱进行峰定位，对各峰进行指认，混合对照品色谱图见图3。止得咳颗粒样品HPLC指纹图谱中20、28、30、31号峰得到了明确的化学指认，依次为黄芩苷、次野鸢尾黄素、汉黄芩素、柴胡皂苷d。其中，黄芩苷所指示的20号峰峰面积及保留时间适宜，出峰时间稳定且色谱峰分离度好，故选为参照峰S。共有峰相对峰面积见表7。

表7 10批次止得咳颗粒共有峰相对峰面积

6.指纹图谱的相似度评价

止得咳颗粒经HPLC检测后得到的色谱图中，由于黄芩苷色谱峰与其他色谱峰相比，峰高过高且峰面积也过大，与其他峰差异太大，以致其在相似度评价中占据了主导作用，使相似度结果均大于0.999。故考虑将其色谱峰去除后重新计算相似度，结果见表8。

表8 10批止得咳颗粒指纹图谱相似度评价结果

7.为了验证所得相似度的准确性，对指纹图谱数据进行模式识别的整体分析，是运用聚类分析法对止得咳颗粒样品的指纹图谱进行分析，将多个批次待检样的共有峰的峰面积经归一化处理后作为变量，导入IBM SPSS Statistics20.0软件，选择离差平方和法，以欧式距离作为样品的度量标准，得出树状聚类图，聚类结果见图4；

依据判断原则：当R≤0.9时，说明待检样不合格；当R＞0.9时，说明待检验合格；

当欧式距离＞20时，分为两类，其中第一类0.991＜R₁＜0.994,说明待检验品质良，第二类R₂≥0.995，说明待检验品质优；

当4≤欧式距离≤20时，分为三类，其中第一类0.991＜R₁≤0.993，说明待检验品质中,第二类0.993≤R₂＜0.995，说明待检验品质良，第三类R₃≥0.995，说明待检验品质优；

当欧式距离＜4时，分为四类，其中第一类0.991＜R₁≤0.993，说明待检验品质中,第二类0.993≤R₂＜0.995，说明待检验品质良，第三类0.995≤R₃＜0.996，说明待检验品质优，第三类R₄≥0.997，说明待检验品质特优。

根据判断原则及聚类结果图4，检测结果如下：

当欧式距离＞20时，10批次止得咳颗粒可分为两大类，S1、S2、S3和S5为第一类，其余为第二类；其中，结合去除黄芩苷色谱峰后的相似度结果，第一类的相似度依次为0.992、0.993、0.993、0.994，在10批样品中相似度最低，均小于0.994，说明待检验品质良；第二类的相似度分别为0.998、0.998、0.999、0.999、0.995、0.997，说明该类样品的品质优。

当4≤欧式距离≤20时，10批次止得咳颗粒可分为三大类，其中S1、S2聚为第一类，S3、S5聚为第二类，S4、S6、S7、S8、S9、S10聚为第三类。结合去除黄芩苷色谱峰后的相似度结果，第一类的相似度依次为0.992，S2为0.993，说明待检验品质中，第二类相似度依次为0.993、0.994，说明待检验品质良；第三类的相似度分别为0.998、0.998、0.999、0.999、0.995、0.997，说明该类样品的品质优。

当欧式距离＜4时，10批次止得咳颗粒可分为四大类，其中，S1、S2为第一类，S3、S5为第二类，S9为第三类，S4、S6、S7、S8、S10为第四类，结合去除黄芩苷色谱峰后的相似度结果，第一类S1、S2相似度分别为0.992、0.993，说明待检验品质中,第二类S3、S5相似度分别为0.993、0.994，说明待检验品质良；第三类S9相似度为0.995，说明待检验品质优；第四类为S4、S6、S7、S8、S10相似度分别为0.998、0.998、0.999、0.999、0.997，说明该类样品的品质特优；且分类后相似度值更加相近。

该分析及数据处理方法能实现止得咳颗粒指纹图谱的整体分析，可以对指纹图谱相似度进行有效的补充，验证了峰面积大及峰高较高的色谱峰确实会对相似度的准确性有一定的影响，为止得咳颗粒质量综合评价和控制提供科学依据。

通过上述深入分析样本聚集情况后，与去除黄芩苷色谱峰后相似度的大小规律相接近，因此得出去除黄芩苷色谱峰后所得相似度结果更与实际情况相符的结论。在制备工艺相同的条件下生产的止得咳颗粒，不同批次样品间也有一定的差异，通过本发明方法能够有效的区别不同品质的药品。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化，均落入本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种止得咳颗粒HPLC指纹图谱的构建方法，其特征在于，其构建方法具体包括如下步骤：

（1）：将止得咳颗粒按照下述提取方法制成待检样，备用；所述提取方法为：取止得咳颗粒，精密加入纯水，定量后置超声仪中超声提取25-30min，取出放冷至室温，用纯水补足失重，于12000-13000r·min^-1下离心10-12min，用0.45μm微孔滤膜滤过上清液，即为待检样备用；所述止得咳颗粒与纯水的质量比为2.0：9-10；

（2）：分别精密称取对照品黄芩苷、次野鸢尾黄素、汉黄芩素、柴胡皂苷d，加甲醇配制得混合对照品溶液；

（3）：将所述待检样、混合对照品溶液分别进行高效液相色谱分析，将待检样的色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统，采用中位数法建立止得咳颗粒的HPLC指纹图谱；

所述色谱分析的条件设置如下：Agilent ZORBAX Eclipse Plus-C18色谱柱，4.6mm×250mm, 5μm，柱温30℃；检测波长为254nm；进样量为10μL；流动相为甲醇和0.2%磷酸溶液，流速0.8 mL·min^-1；

梯度洗脱设置为甲醇：0～30min，5%～20%；30～50min，20%～35%；50～75min，35%～40%；75～110min，40%～60%；110～150min，60%～90%。

2.根据权利要求1所述止得咳颗粒HPLC指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述混合对照品溶液包括浓度为0.3-0.5mg·mL^-1黄芩苷、浓度为0.015-0.025mg·mL^-1次野鸢尾黄素、浓度为0.003-0.005mg·mL^-1汉黄芩素、0.4-0.5mg·mL^-1浓度为柴胡皂苷d。

3.根据权利要求1所述止得咳颗粒HPLC指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述止得咳颗粒的HPLC指纹图谱中有31个特征共有峰，将混合对照品溶液在相同色谱条件下进样分析，通过比较保留时间和紫外吸收光谱进行峰定位，对各峰进行指认，其中20号峰为黄芩苷，28号峰为次野鸢尾黄素，30号峰为汉黄芩素，31号峰为柴胡皂苷d。

4. 一种如权利要求1-3任一项所述止得咳颗粒的质量分析方法，其特征在于，是运用聚类分析法对多批次止得咳颗粒样品的指纹图谱进行分析，分析待检验指纹图谱与对照图谱的相似度R，具体是将多个批次待检样的共有峰的峰面积经归一化处理后作为变量，导入IBM SPSS Statistics20.0软件，选择离差平方和法，以欧式距离作为度量标准，得出树状聚类图, 当R≤0.9时，说明待检样不合格；当R＞0.9时，说明待检验合格；

当欧式距离＞20时，分为两类，其中第一类0.991＜R₁＜0.994,说明待检验品质良，第二类R₂≥0.995，说明待检验品质优；

当4≤欧式距离≤20时，分为三类，其中第一类0.991＜R₁≤0.993，说明待检验品质中,第二类0.993≤R₂＜0.995，说明待检验品质良，第三类R₃≥0.995，说明待检验品质优；

当欧式距离＜4时，分为四类，其中第一类0.991＜R₁≤0.993，说明待检验品质中,第二类0.993≤R₂＜0.995，说明待检验品质良，第三类0.995≤R₃＜0.996，说明待检验品质优，第三类R₄≥0.997，说明待检验品质特优。

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