CN108535372A - 发酵虫草菌粉及制剂甾醇类hplc指纹图谱的构建方法及其指纹图谱 - Google Patents

发酵虫草菌粉及制剂甾醇类hplc指纹图谱的构建方法及其指纹图谱 Download PDF

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Abstract

本发明属于药物分析技术领域，涉及发酵虫草菌粉的质量控制方法，具体涉及发酵虫草菌粉及其制剂甾醇类HPLC指纹图谱的构建方法及其指纹图谱。本发明所述方法，包括以下步骤：(1)对照品溶液的制备；(2)供试品溶液的制备；(3)HPLC测定指纹图谱及相似度评价：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液，HPLC分离检测，流动相为甲醇‑水洗脱系统，得到发酵虫草菌粉甾醇指纹图谱，将得到的指纹图谱导入相似度软件评价系统进行相似度评价。

Description

发酵虫草菌粉及制剂甾醇类HPLC指纹图谱的构建方法及其指 纹图谱
技术领域
本发明属于药物分析技术领域，涉及发酵虫草菌粉的质量控制方法，具体涉及发酵虫草菌粉及其制剂甾醇类HPLC指纹图谱的构建方法及其指纹图谱。
背景技术
冬虫夏草为麦角菌科真菌冬虫夏草菌(Cordyceps sinensis)寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座和幼虫尸体的干燥复合体，是我国的名贵中药材之一。由于对冬虫夏草资源的过度开发，加上其寄主的专一性和环境的局限，冬虫夏草资源日渐枯竭。发酵虫草菌粉是从冬虫夏草中分离出药用菌株，经过深层发酵得到的菌粉，经研究发现，发酵虫草菌粉具有冬虫夏草相似的化学成分和药理作用，因此可作为冬虫夏草的替代品使用。
发酵虫草菌粉含有核苷类、甾醇类、多糖类等化学成分，营养和药用价值丰富。目前对于发酵虫草菌粉及其制剂质量控制以核苷类化学成分为主，而甾醇类化合物却很少被作为质量控制目标物，对发酵虫草菌粉甾醇类化合物指纹图谱的研究更是鲜有报道，造成缺乏完善的质量评价体系，难以达到对发酵虫草菌粉及其制剂质量的有效控制。
中药指纹图谱技术是一种综合地反映中药多成分特征的质量控制模式，能够准确地评价中药材质量的均一性、疗效和稳定性，具有整体性和模糊性等特点，是国内外公认的中药质量评价体系之一。
为此，我们结合中药指纹图谱技术，并经过长时间的努力研究得到一种发酵虫草菌粉甾醇的指纹图谱的构建方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种发酵虫草菌粉甾醇的指纹图谱的构建方法。
完善现有发酵虫草菌粉质量评价体系，通过建立发酵虫草菌粉甾醇类指纹图谱的方法，并由此得到发酵虫草菌粉甾醇类共有模式指纹图谱。
本发明所述发酵虫草菌粉甾醇的指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：
(1)对照品溶液的制备
分别精密称取麦角甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇和胡萝卜苷适量，置于同一容量瓶中，加入甲醇超声溶解，即得对照品溶液；
(2)供试品溶液的制备
称取虫草菌粉适量，加入醇溶液超声提取，取出冷却至常温后，离心，取上清液过微孔滤膜，过滤液加入醇溶液定容，取定容后的提取液加入氢氧化钾-甲醇溶液混合均匀，水浴皂化反应完成后取出放冷，过微孔滤膜后即得供试品溶液；
(3)HPLC测定指纹图谱及相似度评价
分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液，HPLC分离检测，流动相为甲醇-水洗脱系统，得到发酵虫草菌粉甾醇指纹图谱，将得到的指纹图谱导入相似度软件评价系统进行相似度评价；
其中，步骤(3)所述的HPLC条件为：C18色谱柱，流动相为甲醇-水，梯度洗脱。
优选的，本发明所述的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)对照品溶液的制备
分别精密称取麦角甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇和胡萝卜苷适量，置于同一10mL容量瓶中，加入甲醇超声溶解，定容至刻度，即得对照品溶液；
(2)供试品溶液的制备
称取虫草菌粉适量，加入甲醇超声提取60min，取出冷却至常温后，8000r/min离心10min，取上清液过0.22μm微孔滤膜，过滤液加入甲醇定容，取定容后的提取液加入氢氧化钾-甲醇溶液混合均匀，水浴皂化后取出放冷，过0.22μm微孔滤膜后即得供试品溶液；
(3)HPLC测定指纹图谱及相似度评价
分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液，HPLC分离检测，流动相为甲醇-水洗脱系统，得到发酵虫草菌粉甾醇指纹图谱，将得到的指纹图谱导入相似度软件评价系统进行相似度评价。
其中，步骤(1)所述的对照品溶液浓度为：麦角甾醇122μg/mL、豆甾醇119μg/mL、β-谷甾醇114μg/mL、胡萝卜苷113μg/mL。
其中，步骤(2)所述的供试品的制备：称取发酵虫草菌粉1.5g，加入甲醇10ml超声提取60min，取出冷却至常温后，8000r/min离心10min，取上清液过0.22μm微孔滤膜，过滤液用甲醇定容至10ml，取定容后的提取液适量,加入浓度为0.4mol/L的氢氧化钾-甲醇溶液混合均匀进行皂化反应，水浴皂化反应45min后取出放冷，过微孔滤膜后即得供试品溶液；
其中，步骤(3)所述的HPLC条件为：DikMA Platisil ODS C18色谱柱，规格为250mm×4.6mm,5μm，流动相使用甲醇-水系统，检测波长208nm，柱温：30℃，进样量20μl，梯度洗脱如下所示：
时间/min A(水％) B(甲醇％) 流速(ml/min)
0～31 2 98 0.8
31～32 0 100 1.0
32～46 0 100 1.0
其中，发酵虫草菌粉甾醇类指纹图谱中，图谱总长度为46min，确定了12个共有特征峰，鉴定了4个特征峰，分别为7号峰为胡萝卜苷；10号峰为麦角甾醇；11号峰为豆甾醇；12号峰为β-谷甾醇，
以10号峰麦角甾醇峰为参照，其他色谱峰相对保留时间和相对峰面积如下：
1号峰，平均相对保留时间为0.3600，平均相对峰面积为2.8712；
2号峰，平均相对保留时间为0.4357，平均相对峰面积为7.3177；
3号峰，平均相对保留时间为0.4686，平均相对峰面积为0.1348；
4号峰，平均相对保留时间为0.5343，平均相对峰面积为0.0686；
5号峰，平均相对保留时间为0.5583，平均相对峰面积为0.568；
6号峰，平均相对保留时间为0.6794，平均相对峰面积为0.5721；
7号峰，平均相对保留时间为0.7336，平均相对峰面积为0.0902；
8号峰，平均相对保留时间为0.7709，平均相对峰面积为0.1264；
9号峰，平均相对保留时间为0.8887，平均相对峰面积为0.0959；
10号峰，平均相对保留时间为1，平均相对峰面积为1；
11号峰，平均相对保留时间为1.2698，平均相对峰面积为0.0558；
12号峰，平均相对保留时间为1.3857，平均相对峰面积为0.0458。
进一步优选的，本发明所述的构建方法，包括以下步骤：
(1)对照品溶液的制备
分别精密称取麦角甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇和胡萝卜苷适量，置同一10mL容量瓶中，加入甲醇超声溶解，定容至刻度，即得对照品溶液；
(2)供试品溶液的制备
称取金水宝片1.5g研磨成细粉，加入甲醇10ml超声提取60min，取出冷却至常温后，8000r/min离心10min，取上清液过0.22μm微孔滤膜，过滤液用甲醇定容至10ml，取定容后的提取液适量,加入浓度为0.4mol/L的氢氧化钾-甲醇溶液混合均匀进行皂化反应，水浴皂化反应45min后取出放冷，过微孔滤膜后即得供试品溶液；
(3)高效液相色谱分析
精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20μl，注入高效液相色谱仪中，色谱条件如下：DikMA Platisil ODS C18色谱柱，规格为250mm×4.6mm,5μm，流动相使用甲醇-水系统，检测波长208nm，柱温：30℃，进样量20μl，梯度洗脱，如下所示：
时间/min A(水％) B(甲醇％) 流速(ml/min)
0～31 2 98 0.8
31～32 0 100 1.0
32～46 0 100 1.0
(4)特征指纹图谱的构建及相似度评价
将测定的金水宝片液相色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》进行相似度评价分析，并得到共有特征峰构成的发酵虫草菌粉甾醇类HPLC标准指纹图谱。
进一步优选的，本发明所述的构建方法，包括以下步骤：
(1)对照品溶液的制备
分别精密称取麦角甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇和胡萝卜苷适量，置于同一10mL容量瓶中，加入甲醇超声溶解，定容至刻度，即得对照品溶液；
(2)供试品溶液的制备
称取金水宝胶囊1.5g，加入甲醇10ml超声提取60min，取出冷却至常温后，8000r/min离心10min，取上清液过0.22μm微孔滤膜，过滤液用甲醇定容至10ml，取定容后的提取液适量,加入浓度为0.4mol/L的氢氧化钾-甲醇溶液混合均匀进行皂化反应，水浴皂化反应45min后取出放冷，过微孔滤膜后即得供试品溶液；
(3)高效液相色谱分析
精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20μl，注入高效液相色谱仪中，色谱条件如下：DikMA Platisil ODS C18色谱柱，规格为250mm×4.6mm，5μm，流动相使用甲醇-水系统，检测波长208nm，柱温：30℃，进样量20μl，梯度洗脱，如下：
时间/min A(水％) B(甲醇％) 流速(ml/min)
0～31 2 98 0.8
31～32 0 100 1.0
32～46 0 100 1.0
(4)特征指纹图谱的构建及相似度评价
将测定的金水宝胶囊液相色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》进行相似度评价分析，并得到共有特征峰构成的发酵虫草菌粉甾醇类HPLC的标准指纹图谱。
本发明还提供发酵虫草菌粉甾醇类HPLC指纹图谱的精密度、稳定性及重复性试验。
1、精密度试验：
取同一份供试品溶液，连续进样6次，以麦角甾醇峰为参照峰，计算其他色谱峰的相对保留时间和相对峰面积，各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值均小于5％，表明仪器精密度良好。
2、稳定性试验：
取同一份供试品溶液，分别于制备后第0、2、4、6、8、10、24h进样，以麦角甾醇峰为参照峰，计算其他色谱峰的相对保留时间和相对峰面积，各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值均小于5％，表明供试品在24h内稳定性良好。
3、重复性试验：
取同一批次发酵虫草菌粉粉末6份，按供试品制备方法制备供试品溶液进样，以麦角甾醇峰为参照峰，计算其他色谱峰的相对保留时间和相对峰面积，各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值均小于5％，表明方法重复性良好。
4、甾醇特征峰的鉴别
发酵虫草菌粉甾醇指纹图谱中，图谱总长度为46min，确定了12个共有特征峰，通过与对照品图谱比较，鉴定了4个特征峰，分别为7号峰为胡萝卜苷；10号峰为麦角甾醇；11号峰为豆甾醇；12号峰为β-谷甾醇。以10号峰麦角甾醇峰为参照，其他色谱峰相对保留时间和相对峰面积如下：
1号峰，平均相对保留时间为0.3600，平均相对峰面积为2.8712；
2号峰，平均相对保留时间为0.4357，平均相对峰面积为7.3177；
3号峰，平均相对保留时间为0.4686，平均相对峰面积为0.1348；
4号峰，平均相对保留时间为0.5343，平均相对峰面积为0.0686；
5号峰，平均相对保留时间为0.5583，平均相对峰面积为0.568；
6号峰，平均相对保留时间为0.6794，平均相对峰面积为0.5721；
7号峰，平均相对保留时间为0.7336，平均相对峰面积为0.0902；
8号峰，平均相对保留时间为0.7709，平均相对峰面积为0.1264；
9号峰，平均相对保留时间为0.8887，平均相对峰面积为0.0959；
10号峰，平均相对保留时间为1，平均相对峰面积为1；
11号峰，平均相对保留时间为1.2698，平均相对峰面积为0.0558；
12号峰，平均相对保留时间为1.3857，平均相对峰面积为0.0458。
本发明相对于现有技术而言，有益效果在于：通过高效液相色谱(HPLC)建立的发酵虫草菌粉甾醇类标准指纹图谱，并鉴定出四种主要甾醇类化合物，通过试验验证指纹图谱的稳定性、重复性及精密度，均符合要求，发酵虫草菌粉甾醇类标准指纹图谱的共有峰模式可以准确、全面地对发酵虫草菌粉的甾醇类质量进行评价，进一步地完善了发酵虫草菌粉及其制剂的质量评价体系，保证了发酵虫草菌粉及制剂质量稳定性及临床用药有效性与安全性。
本发明中一些技术词语进行解释：
中药指纹图谱：中药材经过适当的处理后采用一定的分析手段，得到的能够表示该中药材特性的共有峰的图谱；
《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》：由国家药典委员会推出的应用于中药指纹图谱相似度分析的常用的评价系统软件，本发明使用的评价系统为《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2004版。
附图说明：
图1A为金水宝片指纹图谱
图1B为金水宝片共有峰特征图谱
图中：A指纹图谱；B特征图谱；7胡萝卜苷；10麦角甾醇；11豆甾醇；12β-谷甾醇
图2A为金水宝胶囊指纹图谱
图2B为金水宝胶囊共有峰特征图谱
图中：A指纹图谱；B特征图谱；7胡萝卜苷；10麦角甾醇；11豆甾醇；12β-谷甾醇
具体实施方式
通过以下具体的实施例，对本发明作进一步详细的说明，但不作为本发明的限制。
实施例1、金水宝片甾醇类HPLC指纹图谱的构建方法及其指纹图谱
(1)对照品溶液的制备
分别精密称取麦角甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇和胡萝卜苷适量，置同一10mL容量瓶中，加入甲醇超声溶解，定容至刻度，即得对照品溶液。
(2)供试品溶液的制备
称取10批次金水宝片各1.5g(批号为160401、160501、160502、160601、160701、160702、160703、161202、161203、161204)研磨成细粉，加入甲醇10ml超声提取60min，取出冷却至常温后，8000r/min离心10min，取上清液过0.22μm微孔滤膜，过滤液用甲醇定容至10ml，取定容后的提取液适量,加入浓度为0.4mol/L的氢氧化钾-甲醇溶液混合均匀进行皂化反应，水浴皂化反应45min后取出放冷，过微孔滤膜后即得供试品溶液。
(3)高效液相色谱分析
精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20μl，注入高效液相色谱仪中，色谱条件如下：DikMA Platisil ODS C18色谱柱，规格为250mm×4.6mm,5μm，流动相使用甲醇-水系统，检测波长208nm，柱温：30℃，进样量20μl，梯度洗脱，如下表1。
表1梯度洗脱条件
(4)特征指纹图谱的构建及相似度评价
将测定的10批金水宝片液相色谱图AIA格式导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2004A版软件进行相似度评价分析，并得到共有特征峰构成的发酵虫草菌粉甾醇类HPLC标准指纹图谱，如图1和表2。结果表明10批金水宝片各批次相似度均大于0.9，各批次金水宝片与特征图谱的相似度分别为0.989、0.987、0.987、0.965、0.994、0.964、0.969、0.957、0.992、0.992，相似度均大于0.95，符合指纹图谱的要求。
表2金水宝片相似度结果
S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 对照
S1 1.000
S2 1.000 1.000
S3 0.978 0.976 1.000
S4 0.925 0.923 0.944 1.000
S5 0.997 0.997 0.985 0.935 1.000
S6 0.924 0.922 0.941 0.998 0.934 1.000
S7 0.929 0.928 0.952 0.997 0.940 0.998 1.000
S8 0.932 0.929 0.955 0.901 0.949 0.900 0.907 1.000
S9 0.983 0.982 0.965 0.947 0.986 0.948 0.952 0.944 1.000
S10 0.988 0.987 0.967 0.942 0.989 0.943 0.947 0.942 0.999 1.000
对照 0.989 0.987 0.987 0.965 0.994 0.964 0.969 0.957 0.992 0.992 1.000
实施例2
金水宝胶囊甾醇类HPLC指纹图谱的构建方法及其指纹图谱
(1)对照品溶液的制备
分别精密称取麦角甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇和胡萝卜苷适量，置同一10mL容量瓶中，加入甲醇超声溶解，定容至刻度，即得对照品溶液。
(2)供试品溶液的制备
称取10次金水宝胶囊1.5g(批号为16010005、16070345、16080393、16110701、16090394、16030133、16050229、16040185、16020075、16050347)，加入甲醇10ml超声提取60min，取出冷却至常温后，8000r/min离心10min，取上清液过0.22μm微孔滤膜，过滤液用甲醇定容至10ml，取定容后的提取液适量,加入浓度为0.4mol/L的氢氧化钾-甲醇溶液混合均匀进行皂化反应，水浴皂化反应45min后取出放冷，过微孔滤膜后即得供试品溶液。
(3)高效液相色谱分析
精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20μl，注入高效液相色谱仪中，色谱条件如下：DikMA Platisil ODS C18色谱柱，规格为250mm×4.6mm，5μm，流动相使用甲醇-水系统，检测波长208nm，柱温：30℃，进样量20μl，梯度洗脱，如下表3。
表3梯度洗脱条件
时间/t A(水％) B(甲醇％) 流速(ml/min)
0～31 2 98 0.8
31～32 0 100 1.0
32～46 0 100 1.0
(4)特征指纹图谱的构建及相似度评价
将测定的10批金水宝胶囊液相色谱图AIA格式导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2004A版软件进行相似度评价分析，并得到共有特征峰构成的发酵虫草菌粉甾醇类HPLC的标准指纹图谱，如图2和表4。结果表明10批金水宝胶囊各批次相似度均大于0.9，各批次金水宝胶囊与特征图谱的相似度分别为0.982，0.984，0.994，0.982，0.993，0.994，0.992，0.970，0.982，0.975，相似度均大于0.95，符合指纹图谱的要求。
表4金水宝胶囊相似度结果
实施例3
本发明所述发酵虫草菌粉甾醇的指纹图谱的构建方法，是经过大量实验优选最终确定的，优选实验如下：
1、色谱条件的优化
(1)洗脱系统的选择
除洗脱系统条件外其他与供试品进行色谱检测的基本步骤相同。实验中选择甲醇-水，乙腈-水，甲醇-0.1％磷酸水，乙腈-0.1％磷酸水洗脱系统进行研究。结果显示选择甲醇-0.1％磷酸水洗脱系统各成分响应较小，分离度较差，而乙腈-水、乙腈-0.1％磷酸水洗脱系统各甾醇成分在相应时间内未出峰，因此选择甲醇-水作为流动相洗脱系统。
(2)流速考察
除流速条件外其他与供试品进行色谱检测的基本步骤相同。实验中考察0.8ml/min，1.0ml/min，1.2ml/min所得图谱，结果显示0.8ml/min流速条件下豆甾醇和β-谷甾醇分离度较差，1.0ml/min流速条件下胡萝卜苷分离度较差，综合实验考虑，最终确定选择0.8-1.0ml/min流速进行实验。
(3)柱温考察
除柱温条件外其他与供试品进行色谱检测的基本步骤相同。实验中考察25℃，30℃，35℃所得图谱，结果显示25℃各个成分分离度较差，30℃和35℃条件下各个成分分离度和色谱峰的对称性均较好，考虑到实验室和仪器的控温能力，选择柱温为30℃。
2、供试品溶液的制备
(1)提取方式的选择
除提取方式条件外其他与供试品进行色谱检测的基本步骤相同。精密称取9份发酵虫草菌粉1.5g，分别加入甲醇10ml，考察超声提取60min、冷凝回流提取60min和冷浸提取24h(各3份)，以色谱峰个数和主峰峰面积为评价指标，实验结果表明三种提取方式色谱峰个数相当，超声提取主峰峰面积较大。故选择超声提取。
(2)提取溶剂的考察
除提取溶剂条件外其他与供试品进行色谱检测的基本步骤相同。精密称取9份发酵虫草菌粉1.5g，分别加入甲醇、乙醇、95％乙醇10ml，每种提取溶剂各三份，以色谱峰个数和主峰峰面积为评价指标，实验结果表明甲醇为提取溶剂时色谱峰个数最多，且主峰峰面积较大，故选择甲醇为提取溶剂。
(3)皂化反应时间的考察
除皂化反应时间条件外其他与供试品进行色谱检测的基本步骤相同。取发酵虫草菌粉提取液适量，加入浓度为0.4mol/L的氢氧化钾-甲醇溶液混合均匀进行皂化反应，分别考察水浴皂化反应时间为30min，45min，60min，75min，90min，以主峰峰面积为评价指标，结果显示皂化反应时间为45min时，主峰峰面积较大，故选择的皂化反应时间为45min。
综合上述实验，本发明最终确定的发酵虫草菌粉甾醇供试品溶液的制备方法为：称取发酵虫草菌粉1.5g，加入甲醇10ml超声提取60min，取出冷却至常温后，8000r/min离心10min，取上清液过0.22μm微孔滤膜，过滤液用甲醇定容至10ml，取定容后的提取液适量,加入浓度为0.4mol/L的氢氧化钾-甲醇溶液混合均匀进行皂化反应，水浴皂化反应45min后取出放冷，过微孔滤膜后即得供试品溶液。

Claims (8)

1.一种发酵虫草菌粉甾醇的指纹图谱的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)对照品溶液的制备
分别精密称取麦角甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇和胡萝卜苷适量，置于同一容量瓶中，加入甲醇超声溶解，即得对照品溶液；
(2)供试品溶液的制备
称取虫草菌粉适量，加入甲醇溶液超声提取，取出冷却至常温后，离心，取上清液过微孔滤膜，过滤液加入甲醇溶液定容，取定容后的提取液加入氢氧化钾-甲醇溶液混合均匀，水浴皂化反应完成后取出放冷，过微孔滤膜后即得供试品溶液；
(3)HPLC测定指纹图谱及相似度评价
分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液，HPLC分离检测，流动相为甲醇-水洗脱系统，得到发酵虫草菌粉甾醇指纹图谱，将得到的指纹图谱导入相似度软件评价系统进行相似度评价；
其中，步骤(3)所述的HPLC条件为：C18色谱柱，流动相为甲醇-水，梯度洗脱。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)对照品溶液的制备
分别精密称取麦角甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇和胡萝卜苷适量，置于同一10mL容量瓶中，加入甲醇超声溶解，定容至刻度，即得对照品溶液；
(2)供试品溶液的制备
称取虫草菌粉适量，加入甲醇超声提取60min，取出冷却至常温后，8000r/min离心10min，取上清液过0.22μm微孔滤膜，过滤液加入甲醇定容，取定容后的提取液加入氢氧化钾-甲醇溶液混合均匀，水浴皂化后取出放冷，过0.22μm微孔滤膜后即得供试品溶液；
(3)HPLC测定指纹图谱及相似度评价
分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液，HPLC分离检测，流动相为甲醇-水洗脱系统，得到发酵虫草菌粉甾醇指纹图谱，将得到的指纹图谱导入相似度软件评价系统进行相似度评价。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)所述的对照品溶液浓度为：麦角甾醇122μg/mL、豆甾醇119μg/mL、β-谷甾醇114μg/mL、胡萝卜苷113μg/mL。
4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)所述的供试品的制备：称取发酵虫草菌粉1.5g，加入甲醇10ml超声提取60min，取出冷却至常温后，8000r/min离心10min，取上清液过0.22μm微孔滤膜，过滤液用甲醇定容至10ml，取定容后的提取液0.9ml，加入浓度为0.4mol/L的氢氧化钾-甲醇溶液混合均匀进行皂化反应，水浴皂化反应45min后取出放冷，过微孔滤膜后即得供试品溶液。
5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(3)所述的HPLC条件为：DikMAPlatisil ODS C18色谱柱，规格为250mm×4.6mm,5μm，流动相使用甲醇-水系统，检测波长208nm，柱温：30℃，进样量20μl，梯度洗脱如下所示：
6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，发酵虫草菌粉甾醇类指纹图谱中，图谱总长度为46min，确定了12个共有特征峰，鉴定了4个特征峰，分别为7号峰为胡萝卜苷；10号峰为麦角甾醇；11号峰为豆甾醇；12号峰为β-谷甾醇，
以10号峰麦角甾醇峰为参照，其他色谱峰相对保留时间和相对峰面积如下：
1号峰，平均相对保留时间为0.3600，平均相对峰面积为2.8712；
2号峰，平均相对保留时间为0.4357，平均相对峰面积为7.3177；
3号峰，平均相对保留时间为0.4686，平均相对峰面积为0.1348；
4号峰，平均相对保留时间为0.5343，平均相对峰面积为0.0686；
5号峰，平均相对保留时间为0.5583，平均相对峰面积为0.568；
6号峰，平均相对保留时间为0.6794，平均相对峰面积为0.5721；
7号峰，平均相对保留时间为0.7336，平均相对峰面积为0.0902；
8号峰，平均相对保留时间为0.7709，平均相对峰面积为0.1264；
9号峰，平均相对保留时间为0.8887，平均相对峰面积为0.0959；
10号峰，平均相对保留时间为1，平均相对峰面积为1；
11号峰，平均相对保留时间为1.2698，平均相对峰面积为0.0558；
12号峰，平均相对保留时间为1.3857，平均相对峰面积为0.0458。
7.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)对照品溶液的制备
分别精密称取麦角甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇和胡萝卜苷适量，置同一10mL容量瓶中，加入甲醇超声溶解，定容至刻度，即得对照品溶液；
(2)供试品溶液的制备
称取金水宝片1.5g研磨成细粉，加入甲醇10ml超声提取60min，取出冷却至常温后，8000r/min离心10min，取上清液过0.22μm微孔滤膜，过滤液用甲醇定容至10ml，取定容后的提取液适量,加入浓度为0.4mol/L的氢氧化钾-甲醇溶液混合均匀进行皂化反应，水浴皂化反应45min后取出放冷，过微孔滤膜后即得供试品溶液；
(3)高效液相色谱分析
精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20μl，注入高效液相色谱仪中，色谱条件如下：DikMA Platisil ODS C18色谱柱，规格为250mm×4.6mm,5μm，流动相使用甲醇-水系统，检测波长208nm，柱温：30℃，进样量20μl，梯度洗脱，如下所示：
时间/min A(水％) B(甲醇％) 流速(ml/min) 0～31 2 98 0.8 31～32 0 100 1.0 32～46 0 100 1.0
(4)特征指纹图谱的构建及相似度评价
将测定的金水宝片液相色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》进行相似度评价分析，并得到共有特征峰构成的发酵虫草菌粉甾醇类HPLC标准指纹图谱。
8.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)对照品溶液的制备
分别精密称取麦角甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇和胡萝卜苷适量，置于同一10mL容量瓶中，加入甲醇超声溶解，定容至刻度，即得对照品溶液；
(2)供试品溶液的制备
称取金水宝胶囊1.5g，加入甲醇10ml超声提取60min，取出冷却至常温后，8000r/min离心10min，取上清液过0.22μm微孔滤膜，过滤液用甲醇定容至10ml，取定容后的提取液适量,加入浓度为0.4mol/L的氢氧化钾-甲醇溶液混合均匀进行皂化反应，水浴皂化反应45min后取出放冷，过微孔滤膜后即得供试品溶液；
(3)高效液相色谱分析
精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20μl，注入高效液相色谱仪中，色谱条件如下：DikMA Platisil ODS C18色谱柱，规格为250mm×4.6mm，5μm，流动相使用甲醇-水系统，检测波长208nm，柱温：30℃，进样量20μl，梯度洗脱，如下：
时间/min A(水％) B(甲醇％) 流速(ml/min) 0～31 2 98 0.8 31～32 0 100 1.0 32～46 0 100 1.0
(4)特征指纹图谱的构建及相似度评价
将测定的金水宝胶囊液相色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》进行相似度评价分析，并得到共有特征峰构成的发酵虫草菌粉甾醇类HPLC的标准指纹图谱。
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