CN109632980B - 一种同时检测尿苷和麦角甾醇的方法及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于中药材成分检测领域，具体涉及一种同时检测尿苷和麦角甾醇的方法及其用途。该方法包括：供试品溶液制备；混合对照品溶液制备；HPLC测定：将供试品溶液和混合对照品溶液进行高效液相色谱检测，供试品溶液进样量0.5‑2.5μL。该方法通过控制进样量克服了尿苷用有机溶剂提取分析时出现的峰塌陷、峰形不对称等问题，实现对尿苷和麦角甾醇的同时检测，同时该检测方法稳定、可靠，应用范围广。

Description

一种同时检测尿苷和麦角甾醇的方法及其用途

技术领域

本发明属于中药材成分检测领域，具体涉及一种同时检测尿苷和麦角甾醇成分的方法。

背景技术

随着药用真菌的种类不断增加，我国已成为名副其实的食药用菌大国。食药用菌因含有多糖、多肽氨基酸、甾体、核苷、生物碱、三萜、矿物质、维生素等多种活性成分而具有重要的药用价值。迄今为止，食药用菌活性成分的研究主要集中于多糖、三萜、核苷和甾体类化合物的单一类成分研究，同时研究多类活性成分的报道还相对较少。目前，已有研究通过高效液相色谱法同时测定冬虫夏草中的核苷和麦角甾醇，但其报道的样品制备方法繁琐复杂、影响因素较多，不利于实际推广和应用。文献《加压溶剂提取-高效液相色谱法测定天然和人工虫草中的麦角甾醇、核苷及其碱基》中同时能够检测到虫草中的麦角甾醇和尿苷，但以甲醇为提取溶剂，提取温度160℃，还需加压提取，总体提取的条件较苛刻。

暗褐网柄牛肝菌是一种具有药用开发价值的食用真菌，经常食用可增强机体免疫力、改善机体微循环，因此，其子实体中活性成分的研究对其日后的开发应用有着重要意义。现市售的暗褐网柄牛肝菌有人工、半人工与野生三种，不同生长环境和真菌对其质量影响较大，无法保证其用药的安全性和有效性。目前已有文献报道绒柄牛肝菌HPLC指纹图谱分析的方法，文献《绒柄牛肝菌有效部位指纹图谱定性和有效成分定量分析研究》中绒柄牛肝菌甲醇有效部位的RP-HPLC指纹图谱可检出11个相对稳定的色谱峰，但没有对峰进行成分归属。药用真菌中尿苷作为主要成分之一，在HPLC检测中因其极性较大，核苷类成分的峰较高较多且容易将尿苷峰包埋在其中，在同时检测小极性甾醇类成分和大极性核苷类成分时，对尿苷进行与其他核苷类成分的有效分离及检测难度大。目前尚未有暗褐网柄牛肝菌分析方法的相关报道，需建立能同时有效鉴别分离暗褐网柄牛肝菌的尿苷和麦角甾醇的方法，为暗褐网柄牛肝菌及其他食药用菌的成分分析提供参考。

发明内容

本发明的目的是提供一种同时检测尿苷和麦角甾醇的方法，该方法通过控制进样量克服了尿苷用有机溶剂提取分析时出现的峰塌陷、峰形不对称等问题，实现了HPLC图谱中各成分峰有效分离。本发明的方法灵敏、快捷、应用范围广。

一方面，本发明提供一种同时检测尿苷和麦角甾醇的方法，包括步骤：

将供试品溶液和混合对照品溶液进行高效液相色谱检测，HPLC色谱条件为：采用Waters HSST3色谱柱(4.6mm×150mm，5μm)，流动相为0.1％甲酸水(A)-甲醇(B)，梯度洗脱(0～5min，0％B；5～15min，0％→4％B；15～45min，4％→100％B；45～60min，100％B)，流速1mL/min，供试品溶液进样量0.5-2.5μL。

在一些实施方案中，所述供试品溶液进样量为0.5μL。

在另一些实施方案中，所述供试品溶液进样量为1μL。

在另一些实施方案中，所述供试品溶液进样量为2μL。

在另一些实施方案中，所述供试品溶液进样量为2.5μL。

在一些实施方案中，所述色谱柱柱温为30℃。

在一些实施方案中，所述高效液相色谱检测波长为250-270nm。

在一些实施方案中，所述高效液相色谱检测波长为260nm。

在一些实施方案中，本发明所述的同时检测核尿苷和麦角甾醇成分的方法，还包括步骤：供试品溶液制备：往样品粉末中加入甲醇进行提取，过滤，取滤液即得。

在一些实施方案中，本发明所述的同时检测尿苷和麦角甾醇成分的方法，还包括步骤：混合对照品溶液制备：取尿苷、麦角甾醇，用甲醇溶解后得混合对照品溶液。

在一些实施方案中，所述混合对照品溶液为尿苷浓度0.340mg/mL和麦角甾醇浓度0.408mg/mL的混合对照品甲醇溶液。

在一些实施方案中，所述样品粉末加入甲醇的料液比为1g/10mL或1g/20mL。

在一些实施方案中，所述样品粉末加入甲醇，所用的样品粉末为0.5g，甲醇为5mL。

在一些实施方案中，所述提取为超声提取，超声提取时间为0.5h-1h。

在一些实施方案中，所述过滤用0.45μm有机滤膜进行。

在一些实施方案中，所述超声提取时间为0.5h。

另一方面，本发明提供了使用本发明所述的方法在鉴定尿苷或麦角甾醇中的用途。

另一方面，本发明提供了使用本发明所述的方法在检测食药用菌中尿苷或麦角甾醇成分中的用途。在一些实施方案中，其中所述的食药用菌为牛肝菌、冬虫夏草、蛹虫草、六妹羊肚菌或松茸。

在一些实施方案中，其中所述的食药用菌为暗褐网柄牛肝菌。本发明所述的“食药用菌”包括具备医药用途的大型真菌，包括但不限于冬虫夏草、蝉花、灵芝、茯苓、猪苓、桑黄、木耳、云芝、牛肝菌、蛹虫草、羊肚菌或松茸等，它们不仅是传统的益气、强身、祛病、通经、益寿等功能，还具增强人体免疫力，抗肿瘤抗癌的功效。在一些实施方案中，本发明的食药用菌包括但不限于牛肝菌、冬虫夏草、蛹虫草、六妹羊肚菌或松茸等。

本发明用到的简写词表示如下含义：

h小时；mg毫克；mL毫升；g克；μL微升；min分钟。

本发明的有益效果为：

1、本发明提供的一种同时检测食药用菌中核苷类和甾醇类成分的方法，通过HPLC检测中控制进样量、控制洗脱梯度克服了尿苷用有机溶剂提取分析时出现的峰塌陷、峰形不对称等问题，该方法稳定、可靠，实现尿苷峰从核苷成分峰中有效分离，同时将极性小的麦角甾醇分离，HPLC图谱中各成分峰清晰，无基线漂移、无峰塌陷、无峰形不对称等问题。为今后暗褐网柄牛肝菌及其相关产品的开发应用和质量监控提供依据。

2、本发明提供的方法检测应用范围广泛，除了能够检测暗褐网柄牛肝菌成分外，还可以检测冬虫夏草、蛹虫草、六妹羊肚菌、松茸等等其他真菌类中药材成分。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方式，其中，1和2分别代表尿苷峰和麦角甾醇峰：

图1～图3分别为暗褐网柄牛肝菌供试品溶液HPLC检测中梯度洗脱1、梯度洗脱2和梯度洗脱3条件下的HPLC图谱，V01～V03分别代表样品进样量为5μL、10μL和20μL条件下的HPLC图谱，R0为混合对照品进样量为5μL条件下的HPLC图谱；

图4为暗褐网柄牛肝菌供试品溶液HPLC检测中不同进样量条件的HPLC图谱，R代表混合对照品0.5μL进样量条件下的HPLC图谱；V1～V6分别代表样品进样量为0.25μL、0.5μL、1μL、2μL、2.5μL和3μL条件下的HPLC图谱；

图5为暗褐网柄牛肝菌供试品溶液HPLC检测中进样量考察时进样量0.5μL条件下的HPLC图谱；

图6为暗褐网柄牛肝菌供试品溶液制备过程中不同提取溶剂条件下的HPLC图谱，R代表混合对照品的HPLC图谱；S1a～S5a分别代表样品提取溶剂为：超纯水、50％甲醇、无水甲醇、水复溶和50％甲醇复溶条件下的HPLC图谱；

图7为冬虫夏草、蛹虫草、六妹羊肚菌和松茸供试品溶液按实施例3的HPLC色谱条件测定条件下的HPLC图谱，R代表混合对照品的HPLC图谱；S1c～S4c分别代表冬虫夏草、蛹虫草、六妹羊肚菌和松茸的HPLC图谱。

具体实施方式

以下所述的是本发明的优选实施方式，本发明所保护的不限于以下优选实施方式。应当指出，对于本领域的技术人员来说在此发明创造构思的基础上，做出的若干变形和改进，都属于本发明的保护范围。实施例中所用的原料、仪器均可以通过商业途径获得。

1.药材来源

2.实验仪器

Agilent1260型高效液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司)；Waters HSST3色谱柱(4.6mm×150mm，5μm)；XPE205型十万分之一电子天平(美国梅特勒-托利多仪器有限公司)；Milli-Q超纯水系统(德国默克密理博公司)；JAC-2010P超声波清洗机(上海君翼仪器设备有限公司)；Tube Mill 100控制型试管研磨机(德国IKA集团)。

3.实验试剂

分析甲醇(AR级，西陇科学股份有限公司)；色谱甲醇(HPLC级，美国spectrum公司)；甲酸(HPLC级，阿拉丁上海有限公司)；超纯水。尿苷(99.8％，上海诗丹德生物技术有限公司，批号3555)；麦角甾醇(95.1％，上海诗丹德生物技术有限公司，批号2173)。

4.对照品溶液的制备

分别称取尿苷20mg、麦角甾醇65mg，精密称定，置50mL容量瓶中，加适量无水甲醇超声助溶，待对照品完全溶解后，用无水甲醇定容至刻度，摇匀，即得混合对照品储备液。使用前，根据实验需要将此对照品储备液用无水甲醇稀释1～100倍，制成系列混合对照品溶液，使用前过0.45μm有机滤膜。除线性考察，其他考察所用对照品溶液均为尿苷0.340mg/mL和麦角甾醇0.408mg/mL的混合对照品溶液稀释液。

5.供试品溶液的制备

取S3样品粉末约0.5g，精密称定，置10mL离心管中，加5mL无水甲醇，超声提取30min，放冷至室温，取上清液过0.45μm有机滤膜，取滤液，即得。

具体实施例

实施例1：暗褐网柄牛肝菌HPLC特征图谱的高效液相色谱法的建立

1.1不同梯度洗脱考察

Waters HSST3色谱柱(4.6mm×150mm，5μm)，流动相为0.1％甲酸水(A)-甲醇(B)，梯度洗脱，流速1mL/min，检测波长260nm，柱温30℃，3个梯度洗脱分别进样5μL、10μL和20μL，梯度洗脱条件具体如下：

梯度洗脱1：0～15min，15％B；15～16min，15％→100％B；16～30min，100％B；30～35min，100％→15％B；

梯度洗脱2：0～10min，0％→15％B；10～20min，15％→30％B；20～30min，30％→100％B；30～35min，100％B；35～40min，100％→0％B；

梯度洗脱3：0～5min，0％B；5～15min，0％→4％B；15～45min，4％→100％B；45～60min，100％B。

取混合对照品稀释液和供试品溶液，按上述色谱条件进行分析，结果如图1、图2和图3所示。由结果可知，与梯度1和梯度2相比，梯度3能较好地分离样品中的成分，故确定最终梯度洗脱为：0～5min，0％B；5～15min，0％→4％B；15～45min，4％→100％B；45～60min，100％B。

结果还表明，当进样量为常规进样量(5μL、10μL和20μL)时大部分成分无法达到有效分离，各成分因相互包埋导致出现裂峰、不对称峰、塌陷峰等不正常峰形，还会导致提前出峰，尿苷峰也被包埋。

1.2不同进样量考察

Waters HSST3色谱柱(4.6mm×150mm，5μm)，流动相为0.1％甲酸水(A)-甲醇(B)，梯度洗脱(0～5min，0％B；5～15min，0％→4％B；15～45min，4％→100％B；45～60min，100％B)，流速1mL/min，检测波长260nm，柱温30℃。

取混合对照品稀释液和供试品溶液，按上述色谱条件，分别进样0.25μL、0.5μL、1μL、2μL、2.5μL、和3μL进行分析，结果如图4所示。由结果可知，当进样量<0.5μL时，有些成分响应很低，无法达到定性分析要求；进样量为3μL时，极性较大的成分又会出现基线不稳和峰形不对称的现象；进样量在0.5μL～2.5μL时，各成分均能达到基线分离，峰形对称且分离度良好，符合质量评价的基本要求，此外，当进样量为0.5μL即可进行定性定量分析，进样量为0.5μL的HPLC图谱如图5所示。

实施例2：供试品溶液制备中的提取方法考察

2.1提取溶剂考察

供试品制备：

取S3样品粉末约0.5g，精密称定3份，置10mL离心管中，分别加5mL超纯水、50％甲醇和无水甲醇，超声提取30min，放冷至室温，取上清液过0.45μm有机滤膜，取续滤液，即得。

另取无水甲醇提取液2mL至蒸发皿中，80℃水浴挥干，平行制备2份，挥干后分别加2mL超纯水和50％甲醇复溶，取复溶液过0.45μm有机滤膜，取续滤液，即得。

色谱条件：

Waters HSST3色谱柱(4.6mm×150mm，5μm)，流动相为0.1％甲酸水(A)-甲醇(B)，梯度洗脱(0～5min，0％B；5～15min，0％→4％B；15～45min，4％→100％B；45～60min，100％B)，流速1mL/min，检测波长260nm，柱温30℃，进样量0.5μL。

取混合对照品稀释液和上述供试品溶液，按上述色谱条件进行分析，结果如图6所示。用无水甲醇提取获得的供试品溶液进行HPLC检测能够同时检测出尿苷和麦角甾醇；无水甲醇提取挥干的供试品水复溶后可检测出尿苷，但麦角甾醇仅检出很少；无水甲醇提取挥干的供试品50％甲醇复溶后可检测出尿苷和少部分麦角甾醇。由结果可知，不同浓度甲醇提取对核苷和甾醇成分均有一定影响，纯水提取核苷成分较好，无水甲醇提取甾醇成分较好，根据实验结果确定最终的提取溶剂为无水甲醇。

实施例3：方法学考察

3.1色谱条件

Waters HSST3色谱柱(4.6mm×150mm，5μm)，流动相为0.1％甲酸水(A)-甲醇(B)，梯度洗脱(0～5min，0％B；5～15min，0％→4％B；15～45min，4％→100％B；45～60min，100％B)，流速1mL/min，检测波长260nm，柱温30℃，进样量0.5μL。

3.2供试品溶液的制备

取S3样品粉末约0.5g，精密称定，置10mL离心管中，加5mL无水甲醇，超声提取30min，放冷至室温，取上清液过0.45μm有机滤膜，取续滤液，即得。

3.3线性考察

取系列混合对照品溶液，按实施例3所述色谱条件测定，以峰面积y和浓度x(mg/mL)绘制个对照品标准曲线，结果见表2，各化合物在相应浓度范围内线性关系良好。

表2尿苷和麦角甾醇的线性考察

3.4精密度考察

取S3供试品溶液，按实施例3所述色谱条件连续进样6次，记录各峰的峰面积并计算RSD值，结果如表3所示，RSD均小于2％，表明仪器精密度良好。

表3精密度考察结果

3.5重复性考察

取S3样品粉末6份，按实施例3所述方法制备供试品溶液，按实施例3所述色谱条件进行测定，记录各峰的峰面积并计算RSD值，结果如下表4所示，RSD均小于2％，表明方法重复性良好。

表4重复性考察结果

3.6稳定性考察

取S3供试品溶液，室温存放，按实施例3所述色谱条件在24h内分次进样，记录各峰的峰面积并计算RSD值，结果如下表5所示，RSD均小于2％，表明供试品溶液在24h内稳定性良好。

表5稳定性考察结果

3.7加样回收率考察

取已知含量的同一批牛肝菌样品粉末(S3)6份，每份约0.25g，精密称定，准确加入与样品中含量等量的对照品，按实施例3所述方法制备供试品溶液，按实施例3所述色谱条件测定，计算平均回收率，结果见表6，表明加样回收率达到要求，本发明的HPLC检测方法可靠。

表6加样回收率结果

实施例4：样品含量测定

取不同产地牛肝菌样品粉末，按实施例3所述方法制备供试品溶液，按实施例3所述色谱条件测定，每个样品平行制备2份，用外标法计算含量，取平均值，结果见表7。

表7样品测定结果(mg/g，n＝2)

实施例5：方法通用性考察

取冬虫夏草、蛹虫草、六妹羊肚菌和松茸样品粉末，按实施例3所述方法制备供试品溶液，按实施例3所述色谱条件测定，结果见图7。由结果可知，所建立的方法可用于其他真菌类中药材(如冬虫夏草、蛹虫草、六妹羊肚菌、松茸等)大极性和小极性成分的分析。

当然，本发明还可有其它多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员当可根据本发明作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。

Claims (8)

1.一种同时检测食药用菌中的尿苷和麦角甾醇的方法，包括步骤：

供试品溶液制备：往样品粉末中加入甲醇进行提取，过滤，取滤液即得；

将供试品溶液和混合对照品溶液进行高效液相色谱检测，HPLC色谱条件为：采用WatersHSST3色谱柱：4.6mm×150mm，5μm；流动相为0.1％甲酸水(A)-甲醇(B)，梯度洗脱程序为：0～5min，0％B；5～15min，0％→4％B；15～45min，4％→100％B；45～60min，100％B；流速1mL/min；供试品溶液进样量0.5-2.5μL。

2.根据权利要求1所述的同时检测食药用菌中的尿苷和麦角甾醇的方法，其中，所述供试品溶液进样量为0.5μL、1μL、2μL或2.5μL。

3.根据权利要求1所述的同时检测食药用菌中的尿苷和麦角甾醇的方法，还包括步骤：混合对照品溶液制备：取尿苷、麦角甾醇，用甲醇溶解后得混合对照品溶液。

4.根据权利要求1所述的同时检测食药用菌中的尿苷和麦角甾醇的方法，其中，混合对照品溶液为尿苷浓度0.340mg/mL和麦角甾醇浓度0.408mg/mL的混合对照品甲醇溶液。

5.根据权利要求1所述的同时检测食药用菌中的尿苷和麦角甾醇的方法，其中，所述样品粉末加入甲醇的料液比为1g/10mL或1g/20mL。

6.根据权利要求1所述的同时检测食药用菌中的尿苷和麦角甾醇的方法，其中，所述提取为超声提取，超声提取时间为0.5h-1h。

7.权利要求1-6任一项所述的方法在检测食药用菌中尿苷或麦角甾醇成分中的用途。

8.权利要求7所述的用途，其中所述食药用菌为牛肝菌、冬虫夏草、蛹虫草、六妹羊肚菌或松茸。

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