CN110441445A - 一种鸡冠花hplc特征指纹图谱的构建方法及黄酮类成分含量测定 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种鸡冠花HPLC特征指纹图谱的构建方法及黄酮类成分含量测定。所述的鸡冠花药材HPLC特征指纹图谱的建立方法包含如下步骤：（1）精密称取鸡冠花药材，制备得到鸡冠花供试品溶液；（2）将鸡冠花供试品溶液采用高效液相色谱仪分析，得到鸡冠花HPLC特征指纹图谱；黄酮类成分含量测定方法为：（1）吸取不同浓度的混合对照品溶液注入高效液相色谱仪，以进样浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标绘制标准曲线，确定线性回归方程；（2）将待测鸡冠花样品溶液注入高效液相色谱仪，测定相应峰面积；（3）通过线性回归方程计算，即得；该方法精密度、稳定性和重现性较好，能更好的评价鸡冠花药材的质量。

Description

一种鸡冠花HPLC特征指纹图谱的构建方法及黄酮类成分含量 测定

技术领域

本发明涉及中药材检测技术领域，具体公开了一种鸡冠花HPLC特征指纹图谱的构建方法及黄酮类成分含量测定。

背景技术

鸡冠花为苋科(Amaranthaceae)青葙属植物鸡冠花(Celosia cristata L.)的干燥花序，具有收敛止血，止带，止痢之功效。味甘涩，归肝经，入血分。《本草纲目》载：“鸡冠花可治疗痔漏下血，赤白下痢，崩中，赤白带下，分赤白用”。鸡冠花起源于非洲、美洲和亚洲热带地区，唐代引入我国，明代已栽种普遍，现全国均有种植。

目前对鸡冠花的质量研究鲜有报道，大部分文献均只对鸡冠花进行了单一的指纹图谱研究，没有对其多种成分进行研究，存在很大的局限性，到目前为止，尚未有只用一个色谱系统就可同时测定能体现 鸡冠花药材特征信息的指纹图谱及同时测定其黄酮类成分的方法，这一问题亟待解决。中药成分复杂，仅以几个化合物的含量作为质量的评价指标亦是不全面的。中药指纹图谱是指中药材或中药制剂经适当处理后采用一定的分析手段，得到能够标示其化学特征的色谱图或光谱图。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术存在的缺陷与不足，提供了一种鸡冠花HPLC特征指纹图谱的构建方法及其黄酮类成分含量的测定方法，该方法精密度高、稳定性好、重复性好，通过所构建的指纹图谱及其黄酮类成分的测定能够对鸡冠花药材进行全面而有效的检测。

本发明所要解决的上述技术问题，通过如下技术方案予以实现：

一种鸡冠花药材的HPLC特征指纹图谱的构建方法，其包含如下步骤：

（1）精密称取鸡冠花药材，制备得到鸡冠花供试品溶液；

（2）将鸡冠花供试品溶液采用高效液相色谱仪分析，得到鸡冠花药材的HPLC特征指纹图谱。

作为一种优选方案，所用高效液相色谱仪分析的色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱温为28~32℃；以乙腈为流动相A，以0.18~0.22%的磷酸水溶液为流动相B进行梯度洗脱；流速为0.9~1.1ml/min；检测波长为254~365nm；进样量为8~15μl，所述磷酸水溶液含体积分数为0.15~0.25%三乙胺。

作为一种最优选方案，所用高效液相色谱仪分析的色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱温为30℃；以乙腈为流动相A，以0.20%的磷酸水溶液为流动相B进行梯度洗脱；流速为1.0ml/min；检测波长为290nm；进样量为10μl，所述的磷酸水溶液含体积分数为0.20%三乙胺。

作为一种优选方案，所述梯度洗脱条件为 ：0~5min，乙腈的体积分数变化为13~18%，磷酸的体积分数变化为87~82%；5~6min，乙腈的体积分数变化为18~20%，磷酸的体积分数变化为82~80%；6~18min，乙腈的体积分数变化为20%，磷酸的体积分数变化为80%；18~23min，乙腈的体积分数变化为20~38%，磷酸的体积分数变化为80~62%；23~32min，乙腈的体积分数变化为38%，磷酸的体积分数变化为62%；32~38min，乙腈的体积分数变化为38~55%，磷酸的体积分数变化为62~45%；38~43min，乙腈的体积分数变化为55%，磷酸的体积分数变化为45%。

作为一种优选方案，所述的供试品溶液通过包含如下步骤的方法制备得到：取鸡冠花药材粉末0.08~0.12g，精密加入混合溶液40~60ml，加热55~65分钟，放冷，再称定重量，用混合溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

作为一种优选方案所述的混合溶液由乙醇、水和盐酸组成，所述的乙醇、水和盐酸的体积比为：45~65：20~30：15~25。

作为一种最优选方案，所述的供试品溶液通过包含如下步骤的方法制备得到：取鸡冠花药材粉末0.1g，精密称量，置具塞锥形瓶中，精密加入混合溶液50ml，称定重量，沸水浴回流60分钟，放冷，再称定重量，用混合溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

作为一种最优选方案，所述的混合溶液由乙醇、水和盐酸组成，所述的乙醇、水和盐酸的体积比为：50：20：15。

作为一种优选方案，所述混合对照品溶液制备方法为加有机溶剂制成每1ml含山柰素20~30μg、异鼠李素1~3μg、山奈酚-4'-O-甲醚1~3μg的混合对照品溶液，即得。

作为一种最优选方案，所述混合对照品溶液制备方法为加甲醇制成每1ml含山柰素25.4603μg、异鼠李素2.05461μg、山奈酚-4'-O-甲醚2.0846μg的混合对照品溶液，即得。

本发明还提供了一种鸡冠花药材中黄酮类成分的含量测定方法，包括如下步骤：

（1）吸取不同浓度的混合对照品溶液注入高效液相色谱仪，以进样浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标绘制标准曲线，确定线性回归方程；

（2）将待测鸡冠花样品溶液注入高效液相色谱仪，测定相应峰面积，

（3）通过线性回归方程计算，即得。

作为一种优选方案，所述黄酮类成分为山柰素、异鼠李素、山奈酚-4'-O-甲醚。

作为一种优选方案，所用高效液相色谱仪分析的色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱温为28~32℃；以乙腈为流动相A，以体积分数0.18~0.22%的磷酸水溶液为流动相B进行梯度洗脱；流速为0.9~1.1ml/min；检测波长为，300~400nm；进样量为8~15μl；所述磷酸水溶液含体积分数为0.15~0.25%的三乙胺。

作为一种最优选方案，所用高效液相色谱仪分析的色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱温为30℃；以乙腈为流动相A，以体积分数0.2%的磷酸水溶液为流动相B进行梯度洗脱；流速为1ml/min；检测波长为365nm；进样量为10μl；所述磷酸水溶液含体积分数为0.2%的三乙胺。

作为一种优选方案，梯度洗脱条件为：0~15min，流动相A的体积分数为35%，流动相B的体积分数变化为65%；15~20min，流动相A的体积分数变化为35~63%，流动相B的体积分数变化为65~37%；20~28min，流动相A的体积分数为63%，流动相B的体积分数为37%。

作为一种优选方案，所述的待测鸡冠花样品溶液通过包含如下步骤的方法制备得到：取待测鸡冠花药材粉末0.18~0.22g，精密加入混合溶液40~60ml，加热55~65分钟，放冷，再称定重量，用混合溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

作为一种优选方案所述的混合溶液由乙醇、水和盐酸组成，所述的乙醇、水和盐酸的体积比为：45~65：20~30：15~25。

作为一种最优选方案，所述的待测鸡冠花样品溶液通过包含如下步骤的方法制备得到：取鸡冠花药材粉末0.2g，精密称量，置具塞锥形瓶中，精密加入混合溶液50ml，称定重量，沸水浴回流60分钟，放冷，再称定重量，用混合溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

作为一种最优选方案所述的混合溶液由乙醇、水和盐酸组成，所述的乙醇、水和盐酸的体积比为：50：20：15。

作为一种优选方案，所述混合对照品溶液制备方法为加有机溶剂制成每1ml含山柰素15~25μg、异鼠李素1~3μg、山奈酚-4'-O-甲醚1~3μg的混合对照品溶液，即得。

作为一种最优选方案，所述混合对照品溶液制备方法为加甲醇制成每1ml含山柰素20μg、异鼠李素2μg、山奈酚-4'-O-甲醚2μg的混合对照品溶液，即得。

有益效果：（1）本发明首次构建了鸡冠花药材的HPLC特征指纹图谱及其黄酮类成分的测定方法；（2）本发明构建的鸡冠花药材的特征指纹图谱，充分展示了鸡冠花药材的化学成分特征；（3）本发明构建的特征指纹图谱全面的反应样品的特征峰信息，且方法稳定，精密度高，重现性较好；（4）本发明所述的鸡冠花药材黄酮类成分的测定方法，测定鸡冠花药材的三种黄酮类物质含量，更加快速，准确度更高，能更好的评价鸡冠花药材的质量。

附图说明

图1为 15批鸡冠花药材HPLC指纹图谱叠加图。

图2 为15批鸡冠花药材HPLC指纹图谱共有峰图，其中峰8为山柰素，峰9为异鼠李素，峰12为山奈酚-4'-0-甲醚。

图3 为鸡冠花药材色谱峰对照品指认图，其中A为对照品溶液；B为供试品溶液；1：山柰素；2：异鼠李素；3：山奈酚-4'-0-甲醚。

图4 为鸡冠花样品聚类分析结果图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

鸡冠花药材特征指纹图谱的构建

主要仪器：Waters ARC高效液相色谱仪（沃特世公司，美国）；Waters HSS T3色谱柱（4.6mm×250mm，5μm)；ME204E型万分之一天平（梅特勒-托利多公司，美国）；XP26型百万分之一天平（梅特勒-托利多公司，美国）；Milli-Q Integral 5 超纯水机（默克密理博公司，德国）；FW100中草药粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）；

鸡冠花药材取自各大全国不同中药材市场及药店。

表1 鸡冠花药材来源

主要试剂：山柰素（山柰酚） (批号：110861-201611；来源：中国食品药品检定研究院；含量：95.5%)；异鼠李素(批号：110860-201611；来源：中国食品药品检定研究院；含量：99.8%)；山奈酚-4'-O-甲醚(批号：491-54-3；来源：上海诗丹德生物有限公司；含量：98%)；乙醇（天津市富宇精细化工有限公司）分析纯；液相用磷酸（天津市科密欧化学试剂有限公司）、三乙胺（天津市科密欧化学试剂有限公司）、乙腈（默克股份有限公司）为色谱级，水为超纯水（实验室自制）。

试验方法

鸡冠花药材供试品的配制

取鸡冠花药材粉末0.1g，精密称量，置具塞锥形瓶中，精密加入混合溶液50ml，称定重量，沸水浴回流60分钟，放冷，再称定重量，用混合溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

混合溶液由乙醇、水和盐酸组成，所述的乙醇、水和盐酸的体积比为：50：20：15。

混合对照品溶液

精密称定山柰素对照品、异鼠李素对照品、山奈酚-4'-O-甲醚对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含山柰素25.4603μg、异鼠李素2.05461μg、山奈酚-4'-O-甲醚2.0846μg的混合对照品溶液，即得。

色谱条件

采用规格为4.6 mm× 250mm，5μm 的Waters HSS T3色谱柱；柱温为30℃；以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂以乙腈为流动相A，以0.20%磷酸水溶液为流动相B进行梯度洗脱；流速为1.0ml/min；检测波长为290nm；进样量为10μl。所述磷酸水溶液含0.20%三乙胺。

表2 梯度洗脱流动相配比

数据处理

利用中药色谱指纹图谱相似度评价软件和SPSS20.0对市售鸡冠花药材HPLC数据进行处理分析。

HPLC指纹图谱的建立

精密度试验

取供试品溶液，连续进样6次，记录色谱图，以山柰素为参比峰，计算各共有峰相对保留时间的RSD均小于3.0%，相对峰面积的RSD均小于3.0%，表明仪器精密度良好。

稳定性试验

取供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、18、24h进样，记录色谱图，以山柰素为参比峰，计算各共有峰相对保留时间的RSD均小于3.0%，相对峰面积的RSD均小于3.0%，结果表明供试品溶液在24h内稳定。

重复性试验

取样品粉末6份，分别进样，记录色谱图，以山柰素为参比峰，计算各共有峰相对保留时间的RSD均小于3.0%，相对峰面积的RSD均小于3.0%，结果表明方法重复性良好。

鸡冠花药材指纹图谱的建立

共有峰的确定

取15批鸡冠花药材样品，按供试品溶液制备方法制备供试品溶液，进样测定，使用《中药色谱指纹图谱相似度评价软件》对15批鸡冠花药材指纹图谱进行共有峰标识，并生成对照图谱。结果见图1，图2。以8号峰为参照，各批样品的共有峰的保留时间与峰面积见表3。各共有峰较稳定，具有指纹图谱特征性，可初步定为鸡冠花药材的指标成分群。经对照品对照，8号峰为山柰素峰，9号峰为异鼠李素峰，12号峰为山奈酚-4'-0-甲醚峰，见图3。山柰素峰因分离效果好、出峰稳定，选定为参照峰。

表3 鸡冠花药材指纹图谱共有峰保留时间及峰面积

各产地药材指纹图谱相似度评价

以15批鸡冠花药材生成的共有模式(R)为对照指纹图谱，15批次鸡冠花药材与对照指纹图谱的相似度范围为0.859~0.988，除了S5和S15与对照指纹图谱相似度小于0.9以外，其他各批次药材与对照指纹图谱的相似度均在0.9以上，说明其他各产地药材表现出了良好的相似度。不同来源鸡冠花药材的相似度较为接近，说明市售鸡冠花质量稳定。

表4 鸡冠花样品指纹图谱相似度评价

鸡冠花药材的样品聚类分析

将各色谱峰面积相对于称样量量化，运用SPSS20.0软件对15批鸡冠花药材样品进行系统聚类，采用组间平均数联结法，以夹角余弦作为样品相似度的距离公式。聚类分析将鸡冠花药材样品分为4类，Ⅰ类包括S1、S3、S7、S8、S9、S10，即河北样品与广西及一批江苏样品聚为一类；Ⅱ类包括S2、S4、S6，即河北、安徽、江苏各一批样品聚为一类；Ⅲ类包括S11、S12、S13、S14，即4批广东样品聚为一类；Ⅳ类包括S15、Ⅴ类包括S5，即一批江苏样品及一批广东样品聚为一类。总体看来，广东、广西市售的鸡冠花药材质量大体相近，但不同来源的样品亦能聚到一类，说明不同来源的样品质量差异不大，与相似度分析的评价结果相一致。具体结果见图4。

实施例2

鸡冠花药材中黄酮类成分含量测定，测量步骤如下：

（1）吸取不同浓度的混合对照品溶液注入高效液相色谱仪，得到HPLC特征指纹图谱；

（2）将待测鸡冠花样品溶液注入高效液相色谱仪，测定相应峰面积，以进样浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标绘制标准曲线，确定线性回归方程；

（3）通过线性回归方程计算，即得。

待测鸡冠花样品溶液的配制

取待测鸡冠花样品粉末0.2g，精密称量，置具塞锥形瓶中，精密加入混合溶液50ml，称定重量，沸水浴回流60分钟，放冷，再称定重量，用混合溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

混合溶液由乙醇、水和盐酸组成，所述的乙醇、水和盐酸的体积比为：50：20：15。

混合对照品溶液

精密称定山柰素对照品、异鼠李素对照品、山奈酚-4'-O-甲醚对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含山柰素20μg、异鼠李素2μg、山奈酚-4'-O-甲醚2μg的混合对照品溶液，即得。

色谱条件

采用规格为4.6 mm× 250mm，5μm 的Waters HSS T3色谱柱；柱温为30℃，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，以0 .20%磷酸溶液（含0.2%三乙胺）为流动相B进行梯度洗脱；流速为1.0ml/min；检测波长为365nm；进样量为10μl。

表5梯度洗脱流动相配比

精密称定山柰素对照品4.188mg，置10ml量瓶中，加甲醇至刻度，即得浓度为509.206μg/mg。精密称定异鼠李素对照品2.196mg，置10ml量瓶中，加甲醇至刻度，即得浓度为219.1608μg/mg。精密称定山奈酚-4’-O-甲醚对照品2.431mg，置10ml量瓶中，加甲醇至刻度，即得浓度为238.238μg/mg。

精密吸取上述山柰素对照品储备液8ml、异鼠李素对照品储备液1.5ml和山奈酚-4'-O-甲醚对照品储备液1.4ml置20ml量瓶中，加甲醇制成每1ml含山柰素203.6824μg、异鼠李素16.4371μg和山奈酚-4'-O-甲醚16.6767μg的对照品线性母液。分别精密吸取线性母液0.25ml、0.5ml、1.25ml、2.5ml、5.0ml至10ml容量瓶中，配制成山柰素浓度为5.0921、10.1841、25.4603、50.9206、101.8412μg/ml、异鼠李素浓度为0.4109、0.8219、2.0546、4.1093、8.2185、16.4371μg/ml、山奈酚-4'-O-甲醚浓度为0.4169、0.8338、2.0846、4.1692、8.3383、16.6767μg/ml混合对照品溶液，做标准曲线，注入液相色谱仪，以进样浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标绘制标准曲线。

表6 线性回归方程及线性范围

加样回收率试验

取已测定含量鸡冠花药材粉末0.1g，精密称定，平行称定9份，每份加入相当于样品含量1.5:1:0.5的对照品，按供试品溶液制备方法制备供试品溶液，制备供试品溶液9份。每份精密吸取10μl测定，计算加样回收率。

表7 加样回收率实验结果（n=9）

样品测定

取15批不同来源鸡冠花药材，按照供试品溶液制备方法制备供试品溶液，进样测定，并计算山柰素、异鼠李素、山奈酚-4’-O-甲醚的含量结果见表8。结果表明，15批样品中山柰素、异鼠李素、山奈酚-4’-O-甲醚总含量最高值为11.34最低值为4.327mg/g，含量差异不大，与指纹图谱结果一致。

表8 鸡冠花药材中黄酮类成分含量测定结果

目前，对于鸡冠花药材指纹图谱的研究鲜有报道，无法科学地评价鸡冠花药材质量。本实验对鸡冠花药材中黄酮类成分进行研究，首次建立鸡冠花药材指纹图谱，并结合山柰素、异鼠李素、山奈酚-4'-O-甲醚含量测定方法，针对鸡冠花的黄酮类成分进行综合性评价。而鸡冠花的黄酮类成分具有促凝血及抗阴道毛滴虫、增强免疫作用，与鸡冠花“收敛止血，止带，止痢”的功效一致，本次实验未对其展开研究，有待更深入的探究。本研究运用指纹图谱分析方法以及以山柰素、异鼠李素、山奈酚-4'-O-甲醚含量作为指标，较全面地评价了市售鸡冠花药材的质量，为鸡冠花药材的质量控制研究奠定基础。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明的范围内。本发明要求的保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

Claims (10)

1.一种鸡冠花HPLC特征指纹图谱的构建方法，其特征在于，包含如下步骤：

（1）精密称取鸡冠花药材，制备得到鸡冠花供试品溶液；

（2）将鸡冠花供试品溶液采用高效液相色谱仪分析，得到鸡冠花药材HPLC特征指纹图谱。

2.根据权利要求1所述的鸡冠花HPLC特征指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述高效液相色谱仪分析的色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱温为28~32℃；以乙腈为流动相A，以体积分数0.18~0.22%的磷酸水溶液为流动相B进行梯度洗脱；流速为0.9~1.1ml/min；检测波长为254~365nm；进样量为8~15μl；所述磷酸水溶液含体积分数为0.15~0.25%的三乙胺。

3.根据权利要求1所述的鸡冠花HPLC特征指纹图谱的构建方法，其特征在于，梯度洗脱条件为：0~5min，流动相A的体积分数变化为13~18%，流动相B的体积分数变化为87~82%；5~6min，流动相A的体积分数变化为18~20%，流动相B的体积分数变化为82~80%；6~18min，流动相A的体积分数变化为20%，流动相B的体积分数变化为80%；18~23min，流动相A的体积分数变化为20~38%，流动相B的体积分数变化为80~62%；23~32min，流动相A的体积分数变化为38%，流动相B的体积分数变化为62%；32~38min，流动相A的体积分数变化为38~55%，流动相B的体积分数变化为62~45%；38~43min，流动相A的体积分数变化为55%，流动相B的体积分数变化为45%。

4.根据权利要求1所述的鸡冠花HPLC特征指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述的供试品溶液通过包含如下步骤的方法制备得到：取鸡冠花药材粉末0.08~0.12g，精密加入混合溶液40~60ml，加热55~65分钟，放冷，再称定重量，用混合溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

所述的混合溶液由乙醇、水和盐酸组成，所述的乙醇、水和盐酸的体积比为45~65：20~30：15~25。

5.一种鸡冠花药材中黄酮类成分的含量测定方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）吸取不同浓度的混合对照品溶液注入高效液相色谱仪，以进样浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标绘制标准曲线，确定线性回归方程；

（2）将待测鸡冠花样品溶液注入高效液相色谱仪，测定相应峰面积；

（3）通过线性回归方程计算，即得。

6.根据权利要求5所述的鸡冠花药材中黄酮类成分的含量测定方法，其特征在于，所述黄酮类成分为山柰素、异鼠李素、山奈酚-4'-O-甲醚。

7.根据权利要求5所述的鸡冠花药材中黄酮类成分的含量测定方法，其特征在于，所述混合对照品溶液通过如下方法制备得到：加有机溶剂制成每1ml含山柰素15~25μg、异鼠李素1~3μg、山奈酚-4'-O-甲醚1~3μg的混合对照品溶液，即得。

8.根据权利要求5所述的鸡冠花药材中黄酮类成分的含量测定方法，其特征在于，所述高效液相色谱仪分析的色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱温为28~32℃；以乙腈为流动相A，以体积分数0.18~0.22%的磷酸水溶液为流动相B进行梯度洗脱；流速为0.9~1.1ml/min；检测波长为，300~400nm；进样量为8~15μl；所述磷酸水溶液含体积分数为0.15~0.25%的三乙胺。

9.根据权利要求5所述的鸡冠花药材中黄酮类成分的含量测定方法，其特征在于，梯度洗脱条件为：0~15min，流动相A的体积分数为35%，流动相B的体积分数变化为65%；15~20min，流动相A的体积分数变化为35~63%，流动相B的体积分数变化为65~37%；20~28min，流动相A的体积分数为63%，流动相B的体积分数为37%。

10.根据权利要求5所述的鸡冠花药材中黄酮类成分的含量测定方法，其特征在于，所述的待测鸡冠花样品溶液通过包含如下步骤的方法制备得到：取待测鸡冠花药材粉末0.18~0.22g，精密加入混合溶液40~60ml，加热55~65分钟，放冷，再称定重量，用混合溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

所述的混合溶液由乙醇、水和盐酸组成，所述的乙醇、水和盐酸的体积比为：45~65：20~30：15~25。