CN104215698B - 裸花紫珠药材、中间体及其制剂的指纹图谱检测方法和标准指纹图谱 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种裸花紫珠药材、中间体及其制剂的指纹图谱检测方法。方法包括：（a）对照品溶液的制备；（b）供试品溶液的制备；（c）色谱条件；（d）以异毛蕊花糖苷为参照峰的标准指纹图谱的制定；（e）指纹图谱的质量控制。该方法对各供试品的前处理方法简单，特征性成分保留完整，重复性、稳定性良好，精密度高，具一定的专属性；所得指纹图谱中各特征峰分离效果较好，裸花紫珠药材、中间体、制剂的指纹图谱具有较好的相关性；可用于鉴别裸花紫珠药材的伪劣，增加裸花紫珠制剂生产过程的可控性，有利于保证裸花紫珠制剂的质量稳定和临床疗效。本发明还公开了根据上述指纹图谱检测方法得到的裸花紫珠药材、中间体及其制剂的标准指纹图谱。
Description
技术领域
本发明属于药物质量控制技术领域，特别涉及一种裸花紫珠、中间体及其制剂的指纹图谱检测方法，并由此得到其标准指纹图谱。
背景技术
裸花紫珠为马鞭草科植物裸花紫珠（Callicarpa nudiflora Hook.et Arn.）的干燥叶。分布广东、广西、海南等地，生长于海拔1200米的地区。裸花紫珠主要成分为黄酮甙、缩合鞣酸、中性树脂、酚类、多糖、羟基化合物及镁、钙、铁盐等。现代研究表明其有效成分具有止血、抗菌、收敛、解毒、镇痛、以及促进愈合的作用。其抗菌、抗病毒作用，尤其对金葡萄球菌、伤寒杆菌、肺炎双球菌等均有不同的抑制作用，其中对金葡萄球菌，伤寒杆菌抑菌作用最强。裸花紫珠还可抑制毛细血管的通透性，对早期的炎症渗出、肿胀有明显的抗炎性反应作用，同时可明显缩短出、凝血时间，止血效果显著。目前，市场上裸花紫珠制剂主要有颗粒剂、胶囊剂、片剂、栓剂、合剂等。
裸花紫珠制剂作为中成药，其药效是多种活性成分共同作用的结果。针对裸花紫珠药材或制剂的质量检测方法已公开了不少方法，如CN102955010A记载了一种中药裸花紫珠制剂的质量检测方法，其以木犀草苷为对照品，建立的指纹图谱具有5个共有峰，以木犀草苷为参照峰；中成药2011年第33卷第3期《HPLC法测定裸花紫珠片中毛蕊花糖苷及连翘酯苷的含量》记载了一种测定裸花紫珠片中毛蕊花糖苷及连翘酯苷的含量的HPLC方法。但是现有技术中尚无较好的质量控制方法来准确的反映现有中药材、中间体及成品的质量状况，也无法用于生产过程中、以及产品质量的有效控制，不能较好地保证其临床疗效。因此，建立裸花紫珠药材、中间体及其制剂的指纹图谱检测方法和标准指图谱具有非常重要的意义。
发明内容
的花紫珠02] 本发明的目的就是针对裸花紫珠药材、中间体及其制剂的质量控制现状，提供一种基于高效液相色谱法的裸花紫珠药材、中间体及其制剂的指纹图谱检测方法及根据该方法建立得到的裸花紫珠药材、中间体及其制剂的高效液相色谱指纹图谱，有利于对其原料药材、中间体及其终产品质量的有效控制及保证其临床疗效。
裸花紫珠药材、中间体及其制剂的指纹图谱检测方法，包括下述主要步骤：
（1）对照品溶液的制备：
称取异毛蕊花糖苷对照品，置于容量瓶中，加50%~95%乙醇溶解并定容至刻度，摇匀，制成对照品溶液；
（2）供试品溶液的制备：
裸花紫珠药材供试品溶液的制备：称取裸花紫珠药材粉末，置锥形瓶中，加水或50%~95%乙醇，称重，回流提取或超声处理30~90min，放冷，再称定重量，用同种溶剂补重，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液，即得裸花紫珠药材供试品溶液；
裸花紫珠中间体供试品溶液的制备：称取裸花紫珠中间体，置锥形瓶中，加水或50%~95%乙醇，称重，回流提取或超声处理30~90min，放冷，再称定重量，用同种溶剂补重，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液，即得裸花紫珠中间体供试品溶液；
裸花紫珠制剂供试品溶液的制备：取裸花紫珠制剂，置锥形瓶中，加水或50%~95%乙醇，称重，回流提取或超声处理30~90min，放冷，再称定重量，用同种溶剂补重，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液，即得裸花紫珠制剂供试品溶液；
（3）HPLC检测：
分别吸取步骤（2）所得的裸花紫珠对照品溶液和裸花紫珠药材、中间体、制剂供试品溶液，分别注入高效液相色谱仪中，记录色谱图；
其中，色谱条件为：色谱柱为C18 反相色谱柱；DAD检测器；柱温为30~35℃；检测波长为320~340nm；流动相A为乙腈，流动相B为0.1~0.5%磷酸溶液，总流速为0.8~1.2ml/min；分析时间25分钟；
采用下述梯度洗脱方式洗脱：0~15分钟时，流动相A:流动相B=16:84~25:75；15~25分钟时，流动相A:流动相B=25:75~39.7:60.3；
（4）以异毛蕊花糖苷为参照峰的标准指纹图谱的制定
吸取步骤（2）所得的裸花紫珠对照品溶液和裸花紫珠药材、中间体、制剂供试品溶液各10μl，分别注入高效液相色谱仪中，照高效液相色谱法测定，记录色谱图；依据所得的10批裸花紫珠药材、中间体、制剂的指纹图谱，制定标准指纹图谱；其中所述标准指纹图谱具有14个特征峰，其中7号峰为连翘酯苷B，9号峰为毛蕊花糖苷，11号峰为异毛蕊花糖苷；
（5）指纹图谱的质量控制
将裸花紫珠药材、中间体、制剂指纹图谱与步骤（4）制定的标准指纹图谱进行比较，计算相似度，识别所具有的共同吸收峰的数量，确定相似度。
所述步骤（2）供试品溶液的制备优选为下述方法进行：
裸花紫珠药材供试品溶液的制备：称取裸花紫珠药材粉末0.5~3.0g，置锥形瓶中，加水或50%~95%乙醇25~100ml，称重，回流提取或超声处理30~90min，放冷，再称定重量，用同种溶剂补重，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液，即得裸花紫珠药材供试品溶液；
裸花紫珠中间体供试品溶液的制备：称取裸花紫珠浸膏0.25~1.0g，置锥形瓶中，加水或50%~95%乙醇25~100ml，称重，回流提取或超声处理30~90min，放冷，再称定重量，用同种溶剂补重，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液，即得裸花紫珠中间体供试品溶液；
裸花紫珠制剂供试品溶液的制备：根据裸花紫珠制剂剂型不同，选择下述方法之一制备裸花紫珠制剂供试品溶液——
a、若裸花紫珠制剂为片剂、胶囊剂、颗粒剂、栓剂：取裸花紫珠制剂内容物，研细，称取0.1~3.0g，置锥形瓶中，加水或50%~95%乙醇25~100ml，称重，回流提取或超声处理30~90min，放冷，再称定重量，用同种溶剂补重，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液，即得裸花紫珠制剂供试品溶液。
b、若裸花紫珠制剂为合剂、口服液：取裸花紫珠制剂混匀，量取5~10ml，置锥形瓶中，加水或50%~95%乙醇25~100ml，称重，回流提取或超声处理30~90min，放冷，再称定重量，用同种溶剂补重，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液，即得裸花紫珠制剂供试品溶液。
所述步骤（3）中的色谱柱优选柱长为250mm的C18 反相色谱柱。
所述步骤（3）中检测波长优选为327nm。
所述步骤（3）中流动相B优选为0.4%磷酸溶液。
所述步骤（3）中总流速优选为1ml/min。
所述步骤（5）中所述的确定相似度是指将裸花紫珠药材、中间体、制剂指纹图谱与步骤（4）制定的标准指纹图谱进行比对，其相似度为0.90~1.00，共有峰有14个，共有峰峰面积总和占总峰面积的90%以上，以11号峰异毛蕊花糖苷为参照峰，计算相对保留时间和相对峰面积；
计算结果如下所示：
裸花紫珠药材包括14个共有峰：各峰的相对保留时间分别为：（1）0.202~0.214、（2）0.266~0.282、（3）0.330~0.355、（4）0.499~0.518、（5）0.561~0.577、（6）0.631~0.642、（7）0.680~0.688、（8）0.788~0.818、（9）0.827~0.860、（10）0.873~0.914、（S）1.000、（12）1.442~1.481、（13）1.503~1.536、（14）1.854~1.889；各峰的相对峰面积分别为：（1）0.320~1.754、（2）0.251~1.468、（3）0.069~0.749、（4）0.190~0.995、（5）0.122~3.073、（6）0.162~1.882、（7）0.123~0.745、（8）0.102~2.079、（9）3.572~12.508、（10）0.118~2.177、（S）1.000、（12）0.225~1.730、（13）0.055~0.376、（14）0.103~1.180；
裸花紫珠中间体包括14个共有峰：各峰的相对保留时间分别为：（1）0.215~0.223、（2）0.278~0.295、（3）0.338~0.356、（4）0.470~0.489、（5）0.547~0.560、（6）0.620~0.637、（7）0.680~0.694、（8）0.806~0.821、（9）0.854~0.863、（10）0.879~0.899、（S）1.000、（12）1.179~1.192、（13）1.339~1.357、（14）1.454~1.477；各峰的相对峰面积分别为：（1）0.089~0.594、（2）0.143~1.017、（3）0.033~0.199、（4）0.025~1.041、（5）0. 156~0.885、（6）0.177~0.930、（7）0.035~0.667、（8）0.395~1.514、（9）0.787~4.493、（10）0.141~0.723、（S）1.000、（12）0.177~0.925、（13）0.094~0.483、（14）0.127~0.795；
裸花紫珠制剂包括14个共有峰：各峰的相对保留时间分别为：（1）0.204~0.211、（2）0.268~0.281、（3）0.346~0.352、（4）0.470~0.483、（5）0.561~0.575、（6）0.632~0.649、（7）0.686~0.703、（8）0.815~0.831、（9）0.859~0.874、（10）0.887~0.896、（S）1.000、（12）1.183~1.192、（13）1.270~1.286、（14）1.445~1.463；各峰的相对峰面积分别为：（1）0.063~0.490、（2）0.054~0.370、（3）0.013~0.090、（4）0.019~0.075、（5）0.039~0.138、（6）0.039~0.095、（7）0.211~1.343、（8）0.055~0.238、（9）0.571~1.452、（10）0.036~0.108、（S）1.000、（12）0.022~0.113、（13）0.016~0.072、（14）0.023~0.117。
根据本发明所述的裸花紫珠药材的指纹图谱检测方法建立的一种裸花紫珠药材的标准指纹图谱，所述的标准指纹图谱在327nm检测波长下，标准指纹图谱具有14个特征峰，其中7号峰为连翘酯苷B，9号峰为毛蕊花糖苷，11号峰为异毛蕊花糖苷；各峰的相对保留时间分别为：（1）0.202~0.214、（2）0.266~0.282、（3）0.330~0.355、（4）0.499~0.518、（5）0.561~0.577、（6）0.631~0.642、（7）0.680~0.688、（8）0.788~0.818、（9）0.827~0.860、（10）0.873~0.914、（S）1.000、（12）1.442~1.481、（13）1.503~1.536、（14）1.854~1.889；各峰的相对峰面积分别为：（1）0.320~1.754、（2）0.251~1.468、（3）0.069~0.749、（4）0.190~0.995、（5）0.122~3.073、（6）0.162~1.882、（7）0.123~0.745、（8）0.102~2.079、（9）3.572~12.508、（10）0.118~2.177、（S）1.000、（12）0.225~1.730、（13）0.055~0.376、（14）0.103~1.180。
根据本发明所述的裸花紫珠中间体的指纹图谱检测方法建立的一种裸花紫珠中间体的标准指纹图谱，所述的标准指纹图谱在327nm检测波长下，标准指纹图谱具有14个特征峰，其中7号峰为连翘酯苷B，9号峰为毛蕊花糖苷，11号峰为异毛蕊花糖苷；各峰的相对保留时间分别为：（1）0.215~0.223、（2）0.278~0.295、（3）0.338~0.356、（4）0.470~0.489、（5）0.547~0.560、（6）0.620~0.637、（7）0.680~0.694、（8）0.806~0.821、（9）0.854~0.863、（10）0.879~0.899、（S）1.000、（12）1.179~1.192、（13）1.339~1.357、（14）1.454~1.477；各峰的相对峰面积分别为：（1）0.089~0.594、（2）0.143~1.017、（3）0.033~0.199、（4）0.025~1.041、（5）0. 156~0.885、（6）0.177~0.930、（7）0.035~0.667、（8）0.395~1.514、（9）0.787~4.493、（10）0.141~0.723、（S）1.000、（12）0.177~0.925、（13）0.094~0.483、（14）0.127~0.795。
根据本发明所述的裸花紫珠制剂的指纹图谱检测方法建立的一种裸花紫珠制剂的标准指纹图谱，其特征在于所述的标准指纹图谱在327nm检测波长下，标准指纹图谱具有14个特征峰，其中7号峰为连翘酯苷B，9号峰为毛蕊花糖苷，11号峰为异毛蕊花糖苷；各峰的相对保留时间分别为：（1）0.204~0.211、（2）0.268~0.281、（3）0.346~0.352、（4）0.470~0.483、（5）0.561~0.575、（6）0.632~0.649、（7）0.686~0.703、（8）0.815~0.831、（9）0.859~0.874、（10）0.887~0.896、（S）1.000、（12）1.183~1.192、（13）1.270~1.286、（14）1.445~1.463；各峰的相对峰面积分别为：（1）0.063~0.490、（2）0.054~0.370、（3）0.013~0.090、（4）0.019~0.075、（5）0.039~0.138、（6）0.039~0.095、（7）0.211~1.343、（8）0.055~0.238、（9）0.571~1.452、（10）0.036~0.108、（S）1.000、（12）0.022~0.113、（13）0.016~0.072、（14）0.023~0.117。
本发明所述裸花紫珠制剂为：片剂、胶囊剂、颗粒剂、栓剂、合剂、口服液。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
（1）、本发明裸花紫珠药材、中间体及其制剂的指纹图谱检测方法对各供试品的前处理方法简单，特征性成分保留完整，且供试品溶液稳定；
（2）、该高效液相色谱方法的精密度较高、重现性良好，分析时间较短，具有一定的专属性；所得指纹图谱中各特征峰分离效果较好，且裸花紫珠药材指纹图谱和中间体指纹图谱和制剂指纹图谱具有较好的相关性；
（3）、本发明所建立的标准指纹图谱有14个共有峰，信息量较大，较完整的保留了供试液中的化学成分；
（4）、本发明指认了3个特征峰，经比较采用保留时间适中，分离度较好，峰面积较大的异毛蕊花糖苷对照品作为参照峰；
（5）、裸花紫珠药材指纹图谱可用于鉴别裸花紫珠药材的伪劣，裸花紫珠中间体指纹图谱的应用可增加裸花紫珠制剂生产过程的可控性，裸花紫珠制剂指纹图谱的应用则有利于保证裸花紫珠制剂的质量稳定和临床疗效，本发明提供的方法有利地保障了从原料到终端制剂的全程质量控制。
附图说明
图1检测波长3D图；
图2对照品叠加色谱图；
图3为裸花紫珠药材标准指纹图谱；
图4为10批裸花紫珠药材指纹图谱；
图5为裸花紫珠中间体标准指纹图谱；
图6为10批裸花紫珠中间体指纹图谱；
图7为裸花紫珠片标准指纹图谱；
图8为10批裸花紫珠片指纹图谱；
图9为裸花紫珠胶囊标准指纹图谱；
图10为10批裸花紫珠胶囊指纹图谱；
图11为裸花紫珠颗粒标准指纹图谱；
图12为10批裸花紫珠颗粒指纹图谱；
图13为裸花紫珠口服液标准指纹图谱；
图14为10批裸花紫珠口服液标准指纹图谱；
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步说明，这些实施例仅用于说明本发明，并不限制本发明的范围。
实施例1 裸花紫珠药材指纹图谱的建立。
（1）药材的来源
为使药材具有足够的代表性，收集不同产地的药材或不同采收季节的药材作为供试品。见表1。
表1 裸花紫珠药材来源
（2）仪器与试药
Agilent 1200高效液相色谱仪，ChemStation色谱工作站；色谱柱：ZORBAX SB C18柱(4.6mm×250mm，5µm，美国安捷伦公司)； KQ 3200 DE型数控超声波清洗器(昆山市仪器有限公司)；Milli-Q纯水系统(美国Millipore公司)；BS110S电子天平(北京赛多利斯天平有限公司)。
（3）色谱条件的选择
①流动相的选择
选择乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.4%磷酸溶液、乙腈-0.5%磷酸溶液、乙腈-1.0%磷酸溶液、甲醇-水等为流动相进行试验，结果表明，乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.4%磷酸溶液、乙腈-0.5%磷酸溶液为流动相时，色谱峰的峰形好，各峰分离较完全，其中乙腈-0.4%磷酸溶液为流动相时效果最好，故选用乙腈-0.4%磷酸溶液作为最佳流动相。
由于样品中成分复杂，在恒流条件下，样品中的各个成分分离度差，较难体现指纹图谱的整体特性；流动相以如下梯度运行，样品中各组分均有较好的分离，基线平稳，故选用为流动相。
表2 梯度运行表
流速1.0ml/min较为合适，在此条件下，各峰分离较好。
②检测波长的选择
应用DAD检测器对供试品进行了全波长测定比较，结果在327nm所测指纹图谱中主要色谱峰的响应值较大，各色谱峰特征突出，故确定最大吸收波长为327nm。见图1。
③色谱柱的选择
通过比较ZORBAX SB-C18（5μm，4.6×250mm），ZORBAX SB-C18（5μm，4.6×150mm），Eclispe XDB-C18（5μm，4.6×150mm）3 种不同型号规格的色谱柱，结果表明，型号为ZORBAXSB-C18（5μm，4.6×250mm）色谱柱保留时间适中，峰数目较多，分离度更好。
④柱温的选择
考察了不同柱温25℃、30℃、35℃、40℃时对同一样品的分离效果。结果表明，不同温度对色谱峰的分离具有一定的影响，以30℃-35℃时分离效果较好，30℃分离效果最好，所以优选30℃为检测柱温。
⑤不同流速的选择
在其他色谱条件相同的情况下，分别考察流速为0.8 ml/min、1.0 ml/min、1.2ml/min对同一样品色谱峰分离的影响。结果表明，当υ=1.0ml/min时，色谱峰保留时间适中，分离度最好，重复性最好。
（4）对照品溶液的制备
称取异毛蕊花糖苷对照品，置于容量瓶中，加50%乙醇溶解并稀释制成每1ml含0.02mg的溶液，摇匀，即得对照品溶液。见图2。
（5）供试品溶液的制备
取裸花紫珠药材粉末0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%乙醇50ml，密塞，称定重量，加热回流90分钟，放冷，再称定重量，用50%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得裸花紫珠药材供试品溶液。
（6）分析时间
在上述色谱条件下进样考察120分钟，结果表明，在25分钟内，样品中所有峰均可被完全洗脱出，故分析时间确定为25分钟。
（7）方法学考察
①稳定性试验
取同一供试品溶液，在上述液相色谱条件下，分别在0、2、4、6、12、24小时进行检测，每次进样10μl，考察主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的一致性。结果主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD＜3%，表明供试品溶液24小时内较稳定。
②精密度试验
取同一份供试品溶液，在上述液相色谱条件下，重复进样6次，每次进样10μl，考察主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的一致性。结果主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD＜3%，表明仪器精密度良好。
③重复性试验
取同一批样品，按供试品制备方法制备6份供试品溶液，在上述液相色谱条件下，进样分析，考察主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的一致性。结果主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD＜3%，表明该方法重复性好。
（8）裸花紫珠药材标准指纹图谱的制定。
精密吸取上述对照品溶液和供试品溶液各10μl，分别注入高效液相色谱仪中，照高效液相色谱法测定，记录色谱图；依据所得的10批裸花紫珠药材的指纹图谱，制定标准指纹图谱。见图3、4。
比较裸花紫珠药材色谱图，确定14个峰为共有峰，其中11号峰为异毛蕊花糖苷峰，依据《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求》，制定裸花紫珠药材的标准指纹图谱。以异毛蕊花糖苷峰为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。
各峰的相对保留时间：（1）0.202~0.214、（2）0.266~0.282、（3）0.330~0.355、（4）0.499~0.518、（5）0.561~0.577、（6）0.631~0.642、（7）0.680~0.688、（8）0.788~0.818、（9）0.827~0.860、（10）0.873~0.914、（S）1.000、（12）1.442~1.481、（13）1.503~1.536、（14）1.854~1.889；各峰的相对峰面积：（1）0.320~1.754、（2）0.251~1.468、（3）0.069~0.749、（4）0.190~0.995、（5）0.122~3.073、（6）0.162~1.882、（7）0.123~0.745、（8）0.102~2.079、（9）3.572~12.508、（10）0.118~2.177、（S）1.000、（12）0.225~1.730、（13）0.055~0.376、（14）0.103~1.180。
（9）相似度评价。
表3 10批裸花紫珠药材HPLC指纹图谱相似度评价结果表
实施例2 裸花紫珠中间体指纹图谱的建立。
（1）仪器与试药
Agilent 1200高效液相色谱仪，ChemStation色谱工作站；色谱柱：ZORBAX SB C18柱(4.6mm×250mm，5µm，美国安捷伦公司)； KQ 3200 DE型数控超声波清洗器(昆山市仪器有限公司)；Milli-Q纯水系统(美国Millipore公司)；BS110S电子天平(北京赛多利斯天平有限公司)。
（2）色谱条件
色谱柱为C18 反相色谱柱；柱温为30℃；检测波长为327nm；流动相A为乙腈，流动相B为0.4%磷酸溶液，总流速为1.0ml/min；分析时间25分钟；
表4梯度运行表
（3）对照品溶液的制备
称取异毛蕊花糖苷对照品，置于容量瓶中，加95%乙醇溶解并稀释制成每1ml含0.02mg的溶液，摇匀，即得对照品溶液。
（4）供试品溶液的制备
取裸花紫珠中间体1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入95%乙醇100ml，密塞，称定重量，超声30分钟，放冷，再称定重量，用95%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得裸花紫珠中间体供试品溶液。
（5）方法学考察
①稳定性试验
取同一供试品溶液，在上述液相色谱条件下，分别在0、2、4、6、12、24小时进行检测，每次进样10μl，考察主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的一致性。结果主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD＜3%，表明供试品溶液24小时内较稳定。
②精密度试验
取同一份供试品溶液，在上述液相色谱条件下，重复进样6次，每次进样10μl，考察主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的一致性。结果主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD＜3%，表明仪器精密度良好。
③重复性试验
取同一批样品，按供试品制备方法制备6份供试品溶液，在上述液相色谱条件下，进样分析，考察主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的一致性。结果主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD＜3%，表明该方法重复性好。
（6）裸花紫珠中间体标准指纹图谱的制定。
精密吸取上述对照品溶液和供试品溶液各10μl，分别注入高效液相色谱仪中，照高效液相色谱法测定，记录色谱图；依据所得的10批裸花紫珠中间体的指纹图谱，制定标准指纹图谱。见图5、6。
比较裸花紫珠中间体色谱图，确定14个峰为共有峰，其中11号峰为异毛蕊花糖苷峰，依据《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求》，制定裸花紫珠中间体的标准指纹图谱。以异毛蕊花糖苷峰为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。
各峰的相对保留时间：（1）0.215~0.223、（2）0.278~0.295、（3）0.338~0.356、（4）0.470~0.489、（5）0.547~0.560、（6）0.620~0.637、（7）0.680~0.694、（8）0.806~0.821、（9）0.854~0.863、（10）0.879~0.899、（S）1.000、（12）1.179~1.192、（13）1.339~1.357、（14）1.454~1.477；各峰的相对峰面积：（1）0.089~0.594、（2）0.143~1.017、（3）0.033~0.199、（4）0.025~1.041、（5）0. 156~0.885、（6）0.177~0.930、（7）0.035~0.667、（8）0.395~1.514、（9）0.787~4.493、（10）0.141~0.723、（S）1.000、（12）0.177~0.925、（13）0.094~0.483、（14）0.127~0.795；
（7）相似度评价。
表5 10批裸花紫珠中间体HPLC指纹图谱相似度评价结果表
实施例3 裸花紫珠制剂指纹图谱的建立（以裸花紫珠片为例）。
（1）仪器与试药
Agilent 1200高效液相色谱仪，ChemStation色谱工作站；色谱柱：ZORBAX SB C18柱(4.6mm×250mm，5µm，美国安捷伦公司)； KQ 3200 DE型数控超声波清洗器(昆山市仪器有限公司)；Milli-Q纯水系统(美国Millipore公司)；BS110S电子天平(北京赛多利斯天平有限公司)。
（2）色谱条件
色谱柱为C18 反相色谱柱；柱温为30℃；检测波长为327nm；流动相A为乙腈，流动相B为0.4%磷酸溶液，总流速为1.0ml/min；分析时间25分钟；
表6梯度运行表
（3）对照品溶液的制备
称取异毛蕊花糖苷对照品，置于容量瓶中，加75%乙醇溶解并稀释制成每1ml含0.02mg的溶液，摇匀，即得对照品溶液。
（4）供试品溶液的制备
取裸花紫珠片粉末0.25g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入75%乙醇50ml，密塞，称定重量，超声30分钟，放冷，再称定重量，用75%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得裸花紫珠片供试品溶液。
（5）方法学考察
①稳定性试验
取同一供试品溶液，在上述液相色谱条件下，分别在0、2、4、6、12、24小时进行检测，每次进样10μl，考察主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的一致性。结果主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD＜3%，表明供试品溶液24小时内较稳定。
②精密度试验
取同一份供试品溶液，在上述液相色谱条件下，重复进样6次，每次进样10μl，考察主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的一致性。结果主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD＜3%，表明仪器精密度良好。
③重复性试验
取同一批样品，按供试品制备方法制备6份供试品溶液，在上述液相色谱条件下，进样分析，考察主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的一致性。结果主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD＜3%，表明该方法重复性好。
（6）裸花紫珠制剂标准指纹图谱的制定。
精密吸取上述对照品溶液和供试品溶液各10μl，分别注入高效液相色谱仪中，照高效液相色谱法测定，记录色谱图；依据所得的10批裸花紫珠制剂的指纹图谱，制定标准指纹图谱。见图7、8。
比较裸花紫珠制剂色谱图，确定14个峰为共有峰，其中11号峰为异毛蕊花糖苷峰，依据《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求》，制定裸花紫珠制剂的标准指纹图谱。以异毛蕊花糖苷峰为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。
各峰的相对保留时间：（1）0.204~0.211、（2）0.268~0.281、（3）0.346~0.352、（4）0.470~0.483、（5）0.561~0.575、（6）0.632~0.649、（7）0.686~0.703、（8）0.815~0.831、（9）0.859~0.874、（10）0.887~0.896、（S）1.000、（12）1.183~1.192、（13）1.270~1.286、（14）1.445~1.463；各峰的相对峰面积：（1）0.063~0.490、（2）0.054~0.370、（3）0.013~0.090、（4）0.019~0.075、（5）0.039~0.138、（6）0.039~0.095、（7）0.211~1.343、（8）0.055~0.238、（9）0.571~1.452、（10）0.036~0.108、（S）1.000、（12）0.022~0.113、（13）0.016~0.072、（14）0.023~0.117。
（7）相似度评价。
表7 10批裸花紫珠片HPLC指纹图谱相似度评价结果表
实施例4 裸花紫珠制剂指纹图谱的建立（以裸花紫珠胶囊为例）。
（1）仪器与试药
Agilent 1200高效液相色谱仪，ChemStation色谱工作站；色谱柱：ZORBAX SBC18柱(4.6mm×250mm，5µm，美国安捷伦公司)； KQ 3200 DE型数控超声波清洗器(昆山市仪器有限公司)；Milli-Q纯水系统(美国Millipore公司)；BS110S电子天平(北京赛多利斯天平有限公司)。
（2）色谱条件
色谱柱为C18 反相色谱柱；柱温为30℃；检测波长为327nm；流动相A为乙腈，流动相B为0.4%磷酸溶液，总流速为1.0ml/min；分析时间25分钟；
表8 梯度运行表
（3）对照品溶液的制备
称取异毛蕊花糖苷对照品，置于容量瓶中，加75%乙醇溶解并稀释制成每1ml含0.02mg的溶液，摇匀，即得对照品溶液。
（4）供试品溶液的制备
取裸花紫珠胶囊粉末1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入75%乙醇50ml，密塞，称定重量，加热回流30分钟，放冷，再称定重量，用75%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得裸花紫珠胶囊供试品溶液。
（5）方法学考察
①稳定性试验
取同一供试品溶液，在上述液相色谱条件下，分别在0、2、4、6、12、24小时进行检测，每次进样10μl，考察主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的一致性。结果主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD＜3%，表明供试品溶液24小时内较稳定。
②精密度试验
取同一份供试品溶液，在上述液相色谱条件下，重复进样6次，每次进样10μl，考察主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的一致性。结果主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD＜3%，表明仪器精密度良好。
③重复性试验
取同一批样品，按供试品制备方法制备6份供试品溶液，在上述液相色谱条件下，进样分析，考察主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的一致性。结果主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD＜3%，表明该方法重复性好。
（6）裸花紫珠制剂标准指纹图谱的制定。
精密吸取上述对照品溶液和供试品溶液各10μl，分别注入高效液相色谱仪中，照高效液相色谱法测定，记录色谱图；依据所得的10批裸花紫珠制剂的指纹图谱，制定标准指纹图谱。见图9、10。
比较裸花紫珠制剂色谱图，确定14个峰为共有峰，其中11号峰为异毛蕊花糖苷峰，依据《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求》，制定裸花紫珠制剂的标准指纹图谱。以异毛蕊花糖苷峰为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。
各峰的相对保留时间：（1）0.201~0.218、（2）0.271~0.281、（3）0.324~0.363、（4）0.465~0.492、（5）0.568~0.574、（6）0.625~0.633、（7）0.692~0.721、（8）0.808~0.824、（9）0.863~0.885、（10）0.876~0.883、（S）1.000、（12）1.173~1.186、（13）1.274~1.289、（14）1.453~1.472；各峰的相对峰面积：（1）0.105~0.596、（2）0.085~0.461、（3）0.052~0.120、（4）0.023~0.120、（5）0.041~0.178、（6）0.056~0.128、（7）0.186~1.657、（8）0.063~0.312、（9）0.554~1.674、（10）0.063~0.156、（S）1.000、（12）0.053~0.174、（13）0.028~0.120、（14）0.025~0.145。
（7）相似度评价。
表9 10批裸花紫珠胶囊HPLC指纹图谱相似度评价结果表
实施例5 裸花紫珠制剂指纹图谱的建立（以裸花紫珠颗粒为例）。
（1）仪器与试药
Agilent 1200高效液相色谱仪，ChemStation色谱工作站；色谱柱：ZORBAX SBC18柱(4.6mm×250mm，5µm，美国安捷伦公司)； KQ 3200 DE型数控超声波清洗器(昆山市仪器有限公司)；Milli-Q纯水系统(美国Millipore公司)；BS110S电子天平(北京赛多利斯天平有限公司)。
（2）色谱条件
色谱柱为C18 反相色谱柱；柱温为30℃；检测波长为327nm；流动相A为乙腈，流动相B为0.4%磷酸溶液，总流速为1.0ml/min；分析时间25分钟；
表10 梯度运行表
（3）对照品溶液的制备
称取异毛蕊花糖苷对照品，置于容量瓶中，加75%乙醇溶解并稀释制成每1ml含0.02mg的溶液，摇匀，即得对照品溶液。
（4）供试品溶液的制备
取裸花紫珠颗粒粉末3.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入75%乙醇100ml，密塞，称定重量，超声处理60分钟，放冷，再称定重量，用75%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得裸花紫珠颗粒供试品溶液。
（5）方法学考察
①稳定性试验
取同一供试品溶液，在上述液相色谱条件下，分别在0、2、4、6、12、24小时进行检测，每次进样10μl，考察主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的一致性。结果主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD＜3%，表明供试品溶液24小时内较稳定。
②精密度试验
取同一份供试品溶液，在上述液相色谱条件下，重复进样6次，每次进样10μl，考察主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的一致性。结果主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD＜3%，表明仪器精密度良好。
③重复性试验
取同一批样品，按供试品制备方法制备6份供试品溶液，在上述液相色谱条件下，进样分析，考察主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的一致性。结果主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD＜3%，表明该方法重复性好。
（6）裸花紫珠颗粒标准指纹图谱的制定。
精密吸取上述对照品溶液和供试品溶液各10μl，分别注入高效液相色谱仪中，照高效液相色谱法测定，记录色谱图；依据所得的10批裸花紫珠制剂的指纹图谱，制定标准指纹图谱。见图11、12。
比较裸花紫珠颗粒色谱图，确定14个峰为共有峰，其中11号峰为异毛蕊花糖苷峰，依据《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求》，制定裸花紫珠制剂的标准指纹图谱。以异毛蕊花糖苷峰为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。
各峰的相对保留时间：（1）0.207~0.222、（2）0.265~0.278、（3）0.319~0.335、（4）0.460~0.484、（5）0.562~0.581、（6）0.617~0.629、（7）0.688~0.705、（8）0.797~0.819、（9）0.854~0.871、（10）0.868~0.870、（S）1.000、（12）1.167~1.184、（13）1.260~1.294、（14）1.449~1.459；各峰的相对峰面积：（1）0.113~0.612、（2）0.101~0.523、（3）0.062~0.136、（4）0.041~0.146、（5）0.062~0.187、（6）0.045~0.143、（7）0.184~1.587、（8）0.074~0.379、（9）0.562~1.706、（10）0.089~0.173、（S）1.000、（12）0.068~0.191、（13）0.052~0.137、（14）0.063~0.150。
（7）相似度评价。
表11 10批裸花紫珠颗粒HPLC指纹图谱相似度评价结果表
实施例6 裸花紫珠制剂指纹图谱的建立（以裸花紫珠口服液为例）。
（1）仪器与试药
Agilent 1200高效液相色谱仪，ChemStation色谱工作站；色谱柱：ZORBAX SBC18柱(4.6mm×250mm，5µm，美国安捷伦公司)； KQ 3200 DE型数控超声波清洗器(昆山市仪器有限公司)；Milli-Q纯水系统(美国Millipore公司)；BS110S电子天平(北京赛多利斯天平有限公司)。
（2）色谱条件
色谱柱为C18 反相色谱柱；柱温为30℃；检测波长为327nm；流动相A为乙腈，流动相B为0.4%磷酸溶液，总流速为1.0ml/min；分析时间25分钟；
表12 梯度运行表
（3）对照品溶液的制备
称取异毛蕊花糖苷对照品，置于容量瓶中，加95%乙醇溶解并稀释制成每1ml含0.02mg的溶液，摇匀，即得对照品溶液。
（4）供试品溶液的制备
取裸花紫珠口服液5ml，置具塞锥形瓶中，精密加入95%乙醇100ml，密塞，称定重量，超声处理60分钟，放冷，再称定重量，用95%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得裸花紫珠口服液供试品溶液。
（5）方法学考察
①稳定性试验
取同一供试品溶液，在上述液相色谱条件下，分别在0、2、4、6、12、24小时进行检测，每次进样10μl，考察主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的一致性。结果主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD＜3%，表明供试品溶液24小时内较稳定。
②精密度试验
取同一份供试品溶液，在上述液相色谱条件下，重复进样6次，每次进样10μl，考察主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的一致性。结果主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD＜3%，表明仪器精密度良好。
③重复性试验
取同一批样品，按供试品制备方法制备6份供试品溶液，在上述液相色谱条件下，进样分析，考察主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的一致性。结果主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD＜3%，表明该方法重复性好。
（6）裸花紫珠口服液标准指纹图谱的制定。
精密吸取上述对照品溶液和供试品溶液各10μl，分别注入高效液相色谱仪中，照高效液相色谱法测定，记录色谱图；依据所得的10批裸花紫珠制剂的指纹图谱，制定标准指纹图谱。见图13、14。
比较裸花紫珠口服液色谱图，确定14个峰为共有峰，其中11号峰为异毛蕊花糖苷峰，依据《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求》，制定裸花紫珠制剂的标准指纹图谱。以异毛蕊花糖苷峰为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。
各峰的相对保留时间：（1）0.202~0.226、（2）0.255~0.269、（3）0.310~0.331、（4）0.452~0.478、（5）0.553~0.574、（6）0.609~0.621、（7）0.680~0.691、（8）0.787~0.805、（9）0.845~0.858、（10）0.852~0.871、（S）1.000、（12）1.153~1.176、（13）1.254~1.285、（14）1.444~1.462；各峰的相对峰面积：（1）0.105~0.653、（2）0.112~0.556、（3）0.068~0.152、（4）0.051~0.158、（5）0.065~0.196、（6）0.052~0.167、（7）0.194~1.596、（8）0.087~0.389、（9）0.554~1.728、（10）0.097~0.169、（S）1.000、（12）0.075~0.189、（13）0.067~0.165、（14）0.057~0.146。
（7）相似度评价。
表13 10批裸花紫珠口服液HPLC指纹图谱相似度评价结果表
Claims (8)
1.裸花紫珠药材、中间体及其制剂的指纹图谱检测方法，包括如下步骤：
(1)对照品溶液的制备：
称取异毛蕊花糖苷对照品，置于容量瓶中，加50％～95％乙醇溶解并定容至刻度，摇匀，制成对照品溶液；
(2)供试品溶液的制备：
裸花紫珠药材供试品溶液的制备：称取裸花紫珠药材粉末，置锥形瓶中，加水或50％～95％乙醇，称重，回流提取或超声处理30～90min，放冷，再称定重量，用同种溶剂补重，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液，即得裸花紫珠药材供试品溶液；
裸花紫珠中间体供试品溶液的制备：称取裸花紫珠中间体，置锥形瓶中，加水或50％～95％乙醇，称重，回流提取或超声处理30～90min，放冷，再称定重量，用同种溶剂补重，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液，即得裸花紫珠中间体供试品溶液；
裸花紫珠制剂供试品溶液的制备：取裸花紫珠制剂，置锥形瓶中，加水或50％～95％乙醇，称重，回流提取或超声处理30～90min，放冷，再称定重量，用同种溶剂补重，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液，即得裸花紫珠制剂供试品溶液；
(3)HPLC检测：
分别吸取步骤(1)(2)所得的裸花紫珠对照品溶液和裸花紫珠药材、中间体、制剂供试品溶液，分别注入高效液相色谱仪中，记录色谱图；
其中，色谱条件为：色谱柱为C18反相色谱柱；DAD检测器；柱温为30～35℃；检测波长为320～340nm；流动相A为乙腈，流动相B为0.1～0.5％磷酸溶液，总流速为0.8～1.2ml/min；分析时间25分钟；
采用下述梯度洗脱方式洗脱：0～15分钟时，流动相A:流动相B＝16:84～25:75；15～25分钟时，流动相A:流动相B＝25:75～39.7:60.3；
(4)以异毛蕊花糖苷为参照峰的标准指纹图谱的制定
吸取步骤(1)(2)所得的裸花紫珠对照品溶液和裸花紫珠药材、中间体、制剂供试品溶液各10μl，分别注入高效液相色谱仪中，照高效液相色谱法测定，记录色谱图；依据所得的10批裸花紫珠药材、中间体、制剂的指纹图谱，制定标准指纹图谱；其中所述标准指纹图谱具有14个特征峰，其中7号峰为连翘酯苷B，9号峰为毛蕊花糖苷，11号峰为异毛蕊花糖苷；
(5)指纹图谱的质量控制
将裸花紫珠药材、中间体、制剂指纹图谱与步骤(4)制定的标准指纹图谱进行比较，计算相似度，识别所具有的共同吸收峰的数量，确定相似度。
2.根据权利要求1所述的裸花紫珠药材、中间体及其制剂的指纹图谱检测方法，其特征在于：所述步骤(2)供试品溶液的制备按照下述方法进行：
裸花紫珠药材供试品溶液的制备：称取裸花紫珠药材粉末0.5～3.0g，置锥形瓶中，加水或50％～95％乙醇25～100ml，称重，回流提取或超声处理30～90min，放冷，再称定重量，用同种溶剂补重，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液，即得裸花紫珠药材供试品溶液；
裸花紫珠中间体供试品溶液的制备：称取裸花紫珠浸膏0.25～1.0g，置锥形瓶中，加水或50％～95％乙醇25～100ml，称重，回流提取或超声处理30～90min，放冷，再称定重量，用同种溶剂补重，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液，即得裸花紫珠中间体供试品溶液；
裸花紫珠制剂供试品溶液的制备：
a、裸花紫珠制剂为片剂、胶囊剂、颗粒剂、栓剂：取裸花紫珠制剂内容物，研细，称取0.1～3.0g，置锥形瓶中，加水或50％～95％乙醇25～100ml，称重，回流提取/超声处理30～90min，放冷，再称定重量，用同种溶剂补重，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液，即得裸花紫珠制剂供试品溶液；
b、裸花紫珠制剂为合剂、口服液：取裸花紫珠制剂混匀，量取5～10ml，置锥形瓶中，加水或50％～95％乙醇25～100ml，称重，回流提取/超声处理30～90min，放冷，再称定重量，用同种溶剂补重，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液，即得裸花紫珠制剂供试品溶液。
3.根据权利要求1或2所述的裸花紫珠药材、中间体及其制剂的指纹图谱检测方法，其特征在于：所述步骤(3)中的色谱柱是柱长为250mm的C18反相色谱柱。
4.根据权利要求1或2所述的裸花紫珠药材、中间体及其制剂的指纹图谱检测方法，其特征在于：所述步骤(3)中检测波长为327nm。
5.根据权利要求1或2所述的裸花紫珠药材、中间体及其制剂的指纹图谱检测方法，其特征在于：所述步骤(3)中流动相B为0.4％磷酸溶液。
6.根据权利要求1或2所述的裸花紫珠药材、中间体及其制剂的指纹图谱检测方法，其特征在于：所述步骤(3)中总流速为1ml/min。
7.根据权利要求1或2所述的裸花紫珠药材、中间体及其制剂的指纹图谱检测方法，其特征在于：
所述步骤(1)对照品溶液的制备：称取异毛蕊花糖苷对照品，置于容量瓶中，加95％乙醇溶解并稀释制成每1ml含0.02mg的溶液，摇匀，即得对照品溶液；
所述步骤(2)供试品溶液的制备：
裸花紫珠药材供试品溶液的制备：取裸花紫珠药材粉末0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％乙醇50ml，密塞，称定重量，加热回流90分钟，放冷，再称定重量，用50％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得裸花紫珠药材供试品溶液；
裸花紫珠中间体供试品溶液的制备：取裸花紫珠中间体1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入95％乙醇100ml，密塞，称定重量，超声30分钟，放冷，再称定重量，用95％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得裸花紫珠中间体供试品溶液；
裸花紫珠制剂供试品溶液的制备：取裸花紫珠片粉末0.25g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入75％乙醇50ml，密塞，称定重量，超声30分钟，放冷，再称定重量，用75％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得裸花紫珠片供试品溶液；
所述步骤(3)HPLC检测：
分别吸取步骤(1)(2)所得的裸花紫珠对照品溶液和裸花紫珠药材、中间体、制剂供试品溶液，分别注入高效液相色谱仪中，记录色谱图；
其中，色谱条件为：色谱柱为C18反相色谱柱；DAD检测器；柱温为30℃；检测波长为327nm；流动相A为乙腈，流动相B为0.4％磷酸溶液，总流速为1.0ml/min；分析时间25分钟；
采用下述梯度洗脱方式洗脱：0～15分钟时，流动相A:流动相B＝16:84～25:75；15～25分钟时，流动相A:流动相B＝25:75～39.7:60.3；
所述步骤(4)以异毛蕊花糖苷为参照峰的标准指纹图谱的制定：
吸取步骤(1)(2)所得的裸花紫珠对照品溶液和裸花紫珠药材、中间体、制剂供试品溶液各10μl，分别注入高效液相色谱仪中，照高效液相色谱法测定，记录色谱图；依据所得的10批裸花紫珠药材、中间体、制剂的指纹图谱，制定标准指纹图谱；其中所述标准指纹图谱具有14个特征峰，其中7号峰为连翘酯苷B，9号峰为毛蕊花糖苷，11号峰为异毛蕊花糖苷；
所述步骤(5)指纹图谱的质量控制：将裸花紫珠药材、中间体、制剂指纹图谱与步骤(4)制定的标准指纹图谱进行比较，计算相似度，识别所具有的共同吸收峰的数量，确定相似度为0.90～1.00，共有峰有14个，共有峰峰面积总和占总峰面积的90％以上，以11号峰异毛蕊花糖苷为参照峰，计算相对保留时间和相对峰面积；
计算结果如下所示：
裸花紫珠药材包括14个共有峰：各峰的相对保留时间分别为：(1)0.202～0.214、(2)0.266～0.282、(3)0.330～0.355、(4)0.499～0.518、(5)0.561～0.577、(6)0.631～0.642、(7)0.680～0.688、(8)0.788～0.818、(9)0.827～0.860、(10)0.873～0.914、(S)1.000、(12)1.442～1.481、(13)1.503～1.536、(14)1.854～1.889；各峰的相对峰面积分别为：(1)0.320～1.754、(2)0.251～1.468、(3)0.069～0.749、(4)0.190～0.995、(5)0.122～3.073、(6)0.162～1.882、(7)0.123～0.745、(8)0.102～2.079、(9)3.572～12.508、(10)0.118～2.177、(S)1.000、(12)0.225～1.730、(13)0.055～0.376、(14)0.103～1.180；
裸花紫珠中间体包括14个共有峰：各峰的相对保留时间分别为：(1)0.215～0.223、(2)0.278～0.295、(3)0.338～0.356、(4)0.470～0.489、(5)0.547～0.560、(6)0.620～0.637、(7)0.680～0.694、(8)0.806～0.821、(9)0.854～0.863、(10)0.879～0.899、(S)1.000、(12)1.179～1.192、(13)1.339～1.357、(14)1.454～1.477；各峰的相对峰面积分别为：(1)0.089～0.594、(2)0.143～1.017、(3)0.033～0.199、(4)0.025～1.041、(5)0.156～0.885、(6)0.177～0.930、(7)0.035～0.667、(8)0.395～1.514、(9)0.787～4.493、(10)0.141～0.723、(S)1.000、(12)0.177～0.925、(13)0.094～0.483、(14)0.127～0.795；
裸花紫珠制剂包括14个共有峰：各峰的相对保留时间分别为：(1)0.204～0.211、(2)0.268～0.281、(3)0.346～0.352、(4)0.470～0.483、(5)0.561～0.575、(6)0.632～0.649、(7)0.686～0.703、(8)0.815～0.831、(9)0.859～0.874、(10)0.887～0.896、(S)1.000、(12)1.183～1.192、(13)1.270～1.286、(14)1.445～1.463；各峰的相对峰面积分别为：(1)0.063～0.490、(2)0.054～0.370、(3)0.013～0.090、(4)0.019～0.075、(5)0.039～0.138、(6)0.039～0.095、(7)0.211～1.343、(8)0.055～0.238、(9)0.571～1.452、(10)0.036～0.108、(S)1.000、(12)0.022～0.113、(13)0.016～0.072、(14)0.023～0.117。
8.根据权利要求1所述的裸花紫珠药材、中间体及其制剂的指纹图谱检测方法，其特征在于，其中裸花紫珠制剂包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、栓剂、合剂、口服液。
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