CN102507832A - 一种测定板蓝根及其制剂的高效液相色谱特征指纹图谱的方法 - Google Patents

一种测定板蓝根及其制剂的高效液相色谱特征指纹图谱的方法 Download PDF

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石燕红
王峥涛
李医明
黄山君
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Abstract

本发明公开了一种测定板蓝根及其制剂的高效液相色谱特征指纹图谱的方法，包括：a)对待测的板蓝根及其制剂样品进行预处理：向待测样品中加入水，加热，摇匀，滤过，取续滤液；b)采用高效液相色谱法，测定经预处理后的待测的板蓝根及其制剂样品，获得特征指纹图谱。本发明方法首次应用同一高效液相色谱条件可对板蓝根、板蓝根颗粒、复方板蓝根颗粒和南板蓝根进行特征指纹图谱的检测与分析，具有简便快速、重复性好、分析成本低等优点，对板蓝根及其制剂进行品质评价和鉴别具有重要指导意义，可应用于新药研发质控等多个方面，有较强的实用性。

Description

一种测定板蓝根及其制剂的高效液相色谱特征指纹图谱的方法
技术领域
本发明是涉及一种测定板蓝根及其制剂的高效液相色谱特征指纹图谱的方法，属于中药分析技术领域。
背景技术
中药板蓝根，又称北板蓝根，自首载于《中国药典》1977年版，此后历版药典均有收载，为十字花科植物菘蓝Isatis indigotica Fort.的干燥根，具有清热解毒、凉血利咽之功效。十字花科植物中富含芥子苷类化合物，板蓝根中含有的主要芥子苷类化合物为R，S-告依春、原告依春、表原告依等，其中R，S-告依春为板蓝根的主要活性成分之一，且为板蓝根的特征性成分。目前对板蓝根的质量主要是根据R，S-告依春含量高低进行控制(2010版《中国药典》(一部)，国家医药科技出版社：191)。
南板蓝根为爵床科植物马兰Baphicacanthus eusia(Nees)Bremek.干燥根(2010版《中国药典》(一部)，国家医药科技出版社：229)。自《中国药典》1995年版将南板蓝根单列品种开始，便有北板蓝根、南板蓝根两种。南板蓝根中不含有R，S-告依春等芥子苷类化合物，不作为板蓝根使用，但目前市场上仍有南、北板蓝根混用的现象。
板蓝根颗粒和复方板篮根颗粒为常用的非处方药品，是以板蓝根为原料的最具代表性的制剂。板蓝根颗粒是由板蓝根经水煎醇沉加工制成，复方板蓝根颗粒是由板蓝根和大青叶经水煎醇沉加工制成，均具有清热解毒、凉血利咽、消肿之功效。但迄今为止，板蓝根颗粒以亮氨酸、精氨酸对照品作为TLC鉴别依据，无含量测定项(2010版《中国药典》(一部)，国家医药科技出版社：800)；复方板蓝根颗粒以氨基酸为对照进行TLC鉴别，以靛玉红、靛蓝为指标成分进行定量控制。上述质量控制方法缺乏专属性，且与现行板蓝根药材和饮片的标准不一致，无法保证板蓝根制剂的质量。
目前对板蓝根及其制剂的指纹图谱已有文献报道(参见闫峻等，复方板蓝根颗粒抗病毒成分HPLC-UV指纹图谱及LC-ESI-MSn研究[J]，化学学报，2011年，69(2)：204；肖雪等，中药板蓝根高效液相色谱法指纹图谱研究[J]，江西中医学院学报，2010年，22(3)：67；柏健等，板蓝根颗粒的HPLC指纹图谱研究[J]，中草药，2006年，37(1)：72)，但这些方法均为独立的指纹图谱研究方法，无法体现板蓝根药材与制剂的相关性，且不能与南板蓝根相区别。目前尚无在同一高效液相色谱条件下针对板蓝根、板蓝根颗粒、复方板蓝根颗粒和南板蓝根进行指纹图谱研究的方法。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明提供一种测定板蓝根及其制剂的高效液相色谱特征指纹图谱的方法。
本发明提供的测定板蓝根及其制剂的高效液相色谱特征指纹图谱的方法，包括如下步骤：
a)对待测的板蓝根及其制剂样品进行预处理：向待测样品中加入水，加热，摇匀，滤过，取续滤液；
b)采用高效液相色谱法，测定经预处理后的待测的板蓝根及其制剂样品，获得特征指纹图谱；所述的高效液相色谱法的色谱条件是采用反相十八烷基键合相硅胶色谱柱，流动相由A相和B相组成，A相为pH＝3.0、0.02％的磷酸水溶液，B相为乙腈，按照以下条件进行梯度洗脱：
0至10分钟，流动相A与流动相B的体积比由99∶1匀速变化至95∶5；
10至15分钟，流动相A与流动相B的体积比由95∶5匀速变化至93∶7；
15至30分钟，流动相A与流动相B的体积比为93∶7。
所述的待测的板蓝根样品是指板蓝根药材和板蓝根饮片，包括南板蓝根药材；待测的板蓝根制剂样品是指板蓝根颗粒和复方板蓝根颗粒，包括含蔗糖型和无蔗糖型。
进一步，待测的板蓝根样品的预处理方法如下：精密称取待测样品粉末，精密加入50倍重量的水，称重，煎煮2小时，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
进一步，待测的板蓝根制剂样品的预处理方法如下：取制剂待测样品，研细，混匀，精密称取，加入含蔗糖制剂样品的10倍重量的水，或加入无蔗糖制剂样品的20倍重量的水，水浴加热并振摇使其溶解，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
进一步，所述的高效液相色谱方法采用紫外检测器，采集范围为190～400nm，检测波长为245nm；反相十八烷基键合相硅胶色谱柱为Shiseido C18MG(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱；混合流动相的流速为1.0mL/min；进样量为10μl；柱温为30℃。
所述的特征指纹图谱是指高效液相色谱图中：保留时间tR为5.2分钟的1号胞苷峰，保留时间tR为8.2分钟的2号尿苷峰，保留时间tR为10.1分钟的3号腺苷峰，保留时间tR为11.6分钟的4号鸟苷峰，保留时间tR为18.4分钟的5号R，S-告依春峰。
板蓝根、板蓝根颗粒和复方板蓝根颗粒的特征峰是5号R，S-告依春峰，南板蓝根的高效液相色谱图中不含5号R，S-告依春峰。
本发明的优点是：
(1)本发明方法为首次应用同一高效液相色谱条件对板蓝根、板蓝根颗粒和复方板蓝根颗粒进行特征指纹图谱的检测与分析。该方法能够较全面体现整体化学信息，对板蓝根及其制剂进行品质评价具有重要指导意义，可应用于新药研发质控等多个方面。
(2)本发明方法为首次应用同一高效液相色谱条件对板蓝根和南板蓝根进行特征指纹图谱的检测与分析，对板蓝根和南板蓝根的鉴别和品质评价具有重要指导意义，可应用于新药研发质控等多个方面。
(3)本发明方法简便快速、重复性好，通过高效液相色谱法对板蓝根及其制剂进样分析，测定特征指纹图谱，分析成本低，有较强的实用性。
附图说明
图1为板蓝根药材的高效液相特征色谱图。
图2为板蓝根饮片的高效液相特征色谱图。
图3板蓝根颗粒(无蔗糖)的高效液相特征色谱图。
图4为板蓝根颗粒(含蔗糖)的高效液相特征色谱图。
图5为复方板蓝根颗粒(无蔗糖)的高效液相特征色谱图。
图6为复方板蓝根颗粒(含蔗糖)的高效液相特征色谱图。
图7为板蓝根和南板蓝根高效液相特征色谱比较图。
其中：1为胞苷峰，2为尿苷峰，3为腺苷峰，4为鸟苷峰，5为R，S-告依春峰；A为板蓝根，B为南板蓝根。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。这些实施例应理解为仅用于说明本发明而不是用于限制本发明的保护范围。在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等效变化和修饰同样落入本发明权利要求书所限定的范围。
实施例1：测定板蓝根药材的高效液相色谱特征指纹图谱
(1)供试品溶液的制备：取板蓝根药材粉末约1g，精密称定，置100ml圆底瓶中，精密加入水50ml，称定重量，煎煮2小时，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
(2)高效液相色谱条件：Shiseido C18MG(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱，流动相0.02％磷酸水溶液(A)-乙腈(B)梯度洗脱，0-10min，99％-95％A；10-15min，95％-93％A；15-30min，93％A；流速1.0mL/min；进样量10μl；柱温30℃；DAD检测器采集范围为190～400nm；检测波长245nm。
(3)板蓝根药材供试品溶液的高效液相色谱特征指纹图谱测定：将板蓝根药材供试品溶液进行高效液相色谱法测定，获得高效液相色谱指纹图谱，通过对照品对照，确认共有峰1-5，分别为胞苷、尿苷、腺苷、鸟苷和R，S-告依春，保留时间分别为5.239分钟，8.224分钟，10.157分钟，11.636分钟和18.459分钟，完成板蓝根药材的高效液相色谱特征指纹图谱测定，见图1所示图谱。
实施例2：测定板蓝根饮片的高效液相色谱特征指纹图谱
(1)供试品溶液的制备：取板蓝根饮片粉末约1g，精密称定，置100ml圆底瓶中，精密加入水50ml，称定重量，煎煮2小时，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
(2)高效液相色谱条件：Shiseido C18MG(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱，流动相0.02％磷酸水溶液(A)-乙腈(B)梯度洗脱，0-10min，99％-95％A；10-15min，95％-93％A；15-30min，93％A；流速1.0mL/min；进样量10μl；柱温30℃；DAD检测器采集范围为190～400nm；检测波长245nm。
(3)板蓝根饮片供试品溶液的高效液相色谱特征指纹图谱测定：将板蓝根饮片供试品溶液进行高效液相色谱法测定，获得高效液相色谱指纹图谱，通过对照品对照，确认共有峰1-5，分别为胞苷、尿苷、腺苷、鸟苷和R，S-告依春，保留时间分别是：5.233分钟，8.227分钟，10.220分钟，11.667分钟和18.493分钟，见图2所示图谱。
实施例3：测定板蓝根颗粒(无蔗糖)高效液相色谱特征指纹图谱
(1)供试品溶液的制备：取板蓝根颗粒(无蔗糖)样品适量，研细，混匀，取约1.0g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加入20mL水，水浴加热并振摇使其溶解，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
(2)高效液相色谱条件：Shiseido C18MG(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱，流动相0.02％磷酸水溶液(A)-乙腈(B)梯度洗脱，0-10min，99％-95％A；10-15min，95％-93％A；15-30min，93％A；流速1.0mL/min；进样量10μl；柱温30℃；DAD检测器采集范围为190～400nm；检测波长245nm。
(3)板蓝根颗粒(无蔗糖)供试品溶液的高效液相色谱特征指纹图谱测定：将板蓝根颗粒供试品溶液进行高效液相色谱法测定，获得高效液相色谱指纹图谱，通过对照品对照，确认共有峰1-5，分别为胞苷、尿苷、腺苷、鸟苷和R，S-告依春，保留时间分别是：5.169分钟，8.191分钟，10.074分钟，11.522分钟和18.388分钟，见图3所示图谱。
实施例4：测定板蓝根颗粒(含蔗糖)高效液相色谱特征指纹图谱
(1)供试品溶液的制备：取板蓝根颗粒(含蔗糖)样品适量，研细，混匀，取约1.0g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加入10mL水，水浴加热并振摇使其溶解，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
(2)高效液相色谱条件：Shiseido C18MG(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱，流动相0.02％磷酸水溶液(A)-乙腈(B)梯度洗脱，0-10min，99％-95％A；10-15min，95％-93％A；15-30min，93％A；流速1.0mL/min；进样量10μl；柱温30℃；DAD检测器采集范围为190～400nm；检测波长245nm。
(4)板蓝根颗粒(含蔗糖)供试品溶液的高效液相色谱特征指纹图谱测定：将板蓝根颗粒供试品溶液进行高效液相色谱法测定，获得高效液相色谱指纹图谱，通过对照品对照，确认共有峰1-5，分别为胞苷、尿苷、腺苷、鸟苷和R，S-告依春，保留时间分别是：5.192分钟，8.166分钟，10.059分钟，11.562分钟和18.305分钟，见图4所示图谱。
实施例5：测定复方板蓝根颗粒(无蔗糖)高效液相色谱特征指纹图谱
(1)供试品溶液的制备：取复方板蓝根颗粒(无蔗糖)样品适量，研细，混匀，取约1.0g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加入20mL水，水浴加热并振摇使其溶解，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
(2)高效液相色谱条件：Shiseido C18MG(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱，流动相0.02％磷酸水溶液(A)-乙腈(B)梯度洗脱，0-10min，99％-95％A；10-15min，95％-93％A；15-30min，93％A；流速1.0mL/min；进样量10μl；柱温30℃；DAD检测器采集范围为190～400nm；检测波长245nm。
(3)复方板蓝根颗粒(无蔗糖)供试品溶液的高效液相色谱特征指纹图谱测定：将复方板蓝根颗粒供试品溶液进行高效液相色谱法测定，获得高效液相色谱指纹图谱，通过对照品对照，确认共有峰1-5，分别为胞苷、尿苷、腺苷、鸟苷和R，S-告依春，保留时间分别是：5.164分钟，8.225分钟，10.116分钟，11.547分钟和18.408分钟，见图5所示图谱。
实施例6：测定复方板蓝根颗粒(含蔗糖)高效液相色谱特征指纹图谱
(1)供试品溶液的制备：取复方板蓝根颗粒(含蔗糖)样品适量，研细，混匀，取约1.0g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加入10mL水，水浴加热并振摇使其溶解，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
(2)高效液相色谱条件：Shiseido C18MG(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱，流动相0.02％磷酸水溶液(A)-乙腈(B)梯度洗脱，0-10min，99％-95％A；10-15min，95％-93％A；15-30min，93％A；流速1.0mL/min；进样量10μl；柱温30℃；DAD检测器采集范围为190～400nm；检测波长245nm。
(3)复方板蓝根颗粒(含蔗糖)供试品溶液的高效液相色谱特征指纹图谱测定：将复方板蓝根颗粒供试品溶液进行高效液相色谱法测定，获得高效液相色谱指纹图谱，通过对照品对照，确认共有峰1-5，分别为胞苷、尿苷、腺苷、鸟苷和R，S-告依春，保留时间分别是：5.141分钟，8.212分钟，10.125分钟，11.551分钟和18.396分钟，见图6所示图谱。
实施例7：测定南板蓝根高效液相色谱指纹图谱
(1)供试品溶液的制备：取南板蓝根粉末约1g，精密称定，置100ml圆底瓶中，精密加入水50ml，称定重量，煎煮2小时，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
(2)高效液相色谱条件：Shiseido C18MG(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱，流动相0.02％磷酸水溶液(A)-乙腈(B)梯度洗脱，0-10min，99％-95％A；10-15min，95％-93％A；15-30min，93％A；流速1.0mL/min；进样量10μl；柱温30℃；DAD检测器采集范围为190～400nm；检测波长245nm。
(3)南板蓝根药材供试品溶液的高效液相色谱指纹图谱测定：将南板蓝根药材供试品溶液进行高效液相色谱法测定，获得高效液相色谱指纹图谱，无R，S-告依春特征色谱峰，且与板蓝根高效液相色谱指纹图谱相似度差，直观观察即可区分，见图7所示图谱。

Claims (10)

1.一种测定板蓝根及其制剂的高效液相色谱特征指纹图谱的方法，其特征在于，包括如下步骤：
a)对待测的板蓝根及其制剂样品进行预处理：向待测样品中加入水，加热，摇匀，滤过，取续滤液；
b)采用高效液相色谱法，测定经预处理后的待测的板蓝根及其制剂样品，获得特征指纹图谱；所述的高效液相色谱法的色谱条件是采用反相十八烷基键合相硅胶色谱柱，流动相由A相和B相组成，A相为pH＝3.0、0.02％的磷酸水溶液，B相为乙腈，按照以下条件进行梯度洗脱：
0至10分钟，流动相A与流动相B的体积比由99∶1匀速变化至95∶5；
10至15分钟，流动相A与流动相B的体积比由95∶5匀速变化至93∶7；
15至30分钟，流动相A与流动相B的体积比为93∶7。
2.根据权利要求1所述的测定板蓝根及其制剂的高效液相色谱特征指纹图谱的方法，其特征在于，所述的待测的板蓝根样品是指板蓝根药材和板蓝根饮片，包括南板蓝根药材。
3.根据权利要求1或2所述的测定板蓝根及其制剂的高效液相色谱特征指纹图谱的方法，其特征在于，所述的待测的板蓝根样品的预处理方法如下：精密称取待测样品粉末，精密加入50倍重量的水，称重，煎煮2小时，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液。
4.根据权利要求1所述的测定板蓝根及其制剂的高效液相色谱特征指纹图谱的方法，其特征在于，所述的待测的板蓝根制剂样品是指板蓝根颗粒和复方板蓝根颗粒，包括含蔗糖型和无蔗糖型。
5.根据权利要求1或4所述的测定板蓝根及其制剂的高效液相色谱特征指纹图谱的方法，其特征在于，所述的待测的板蓝根制剂样品的预处理方法如下：取制剂待测样品，研细，混匀，精密称取，加入含蔗糖制剂样品的10倍重量的水，或加入无蔗糖制剂样品的20倍重量的水，水浴加热并振摇使其溶解，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液。
6.根据权利要求1所述的测定板蓝根及其制剂的高效液相色谱特征指纹图谱的方法，其特征在于，所述的高效液相色谱法采用紫外检测器，采集范围为190～400nm；检测波长为245nm。
7.根据权利要求1所述的测定板蓝根及其制剂的高效液相色谱特征指纹图谱的方法，其特征在于，所述的反相十八烷基键合相硅胶色谱柱为C18色谱柱。
8.根据权利要求1所述的测定板蓝根及其制剂的高效液相色谱特征指纹图谱的方法，其特征在于，流动相的流速为1.0mL/min；进样量为10μl；柱温为30℃。
9.根据权利要求1所述的测定板蓝根及其制剂的高效液相色谱特征指纹图谱的方法，其特征在于，所述的特征指纹图谱是指高效液相色谱图中：保留时间tR为5.2分钟的1号胞苷峰，保留时间tR为8.2分钟的2号尿苷峰，保留时间tR为10.1分钟的3号腺苷峰，保留时间tR为11.6分钟的4号鸟苷峰，保留时间tR为18.4分钟的5号R，S-告依春峰。
10.根据权利要求9所述的测定板蓝根及其制剂的高效液相色谱特征指纹图谱的方法，其特征在于，板蓝根、板蓝根颗粒和复方板蓝根颗粒的高效液相色谱图中具有5号R，S-告依春峰，南板蓝根的高效液相色谱图中不含5号R，S-告依春峰。
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