CN103969356A - 一种丹参药材的指纹图谱的鉴别方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了丹参药材的指纹图谱鉴别方法，包括供试品溶液的制备、指纹图谱的测定、对照指纹图谱的确定和丹参药材指纹图谱的鉴别。通过对丹参药材进行HPLC指纹图谱测定和分析，确定了5个丹参药材的特征峰，这些共有特征峰构成了丹参药材的指纹特征，可作为丹参药材的对照指纹图谱；对需要鉴别的丹参药材可以与对照指纹图谱进行比对，检查共有特征峰的情况，以鉴别质量。本发明具有方法简便、重现性好、特征峰明显、准确可靠等特点，有利于鉴别丹参药材的质量。

Description

一种丹参药材的指纹图谱的鉴别方法

技术领域

本发明涉及一种丹参药材指纹图谱的鉴别方法，具体地说是用高效液相色谱指纹图谱法来对丹参药材的有效成分进行质量控制的一种鉴别方法。

背景技术

丹参具有活血调经，祛瘀止痛，凉血消痈，清心除烦，养血安神的功效，为《中华人民共和国药典2010版》一部收载品种。丹参为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根和根茎。丹参主要含结晶性菲醌类化合物：丹参酮I、IIA、IIB，异丹参酮I、异丹参酮Ⅱ，隐丹参酮，异隐丹参酮、羟基丹参酮ⅡA、丹参新酮、左旋二氢丹参酮I、丹参酚等。此外，尚含原儿茶醛、原儿茶酸、琥珀酸、熊果酸、乳酸、维生素E等。目前丹参药材的质量控制方法主要有：以丹参酮ⅡA(C19H1803)、丹酚酸B(C36H30016)的含量测定作为含量测定方法《中华人民共和国药典2010版一部》；杨树声采用HPLC法同时测定丹参类药材中水溶性活性成分的含量（甘肃中医学院学报 ，2008年 06期）; 王伟采用反相高效液相色谱法同时测定丹参药材中丹参素(Ⅰ)、迷迭香酸(Ⅱ)、紫草酸(Ⅲ)、丹酚酸B(Ⅳ)的含量（安徽医药, Anhui Medical and Pharmaceutical Journal， 2010年 11期）。

中药指纹图谱是指某些中药材或中药制剂经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示其化学特征的色谱图或光谱图。中药指纹图谱是一种综合的，可量化的鉴定手段，它是建立在中药化学成分系统研究的基础上，主要用于评价中药材以及中药制剂半成品质量的真实性、优良性和稳定性。“整体性”和“模糊性”为其显著特点。中国食品药品监督管理局于2000年颁布了《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求（暂行）》，要求中药注射剂必须进行指纹图谱的研究，并建立其相关的标准。规范了中药指纹图谱的研究，从而掀起了国内近几年来对指纹图谱的研究热潮。目前，对中药材质量控制较成熟的方法有单个成分含量测定或一类成分如总皂苷、总黄酮等的紫外分光光度测定法，不能对制剂进行全面直观的质量控制。采用指纹图谱技术除了能反映几乎全部成分的含量、种类外，尚能反映成分的比例、未知成分（含量测定方法中可能已被作为无效或干扰成分扣除）的产生，更多的是从药物稳定性、安全性上进行监测。《中国药典》2010年版，采用薄层色谱法对丹参进行鉴别，由于薄层鉴别法本身受温度、湿度、薄层板厚度以及载样量等诸多因素影响，存在样品的化学成分体现不完全，可鉴别的成分数量较少，同一样品的重现性不佳的缺点。而已有文献报道的丹参指纹图谱技术，图谱中体现的化学成分较少，提供的信息量小，不能很好地代表丹参药材的整体质量，不能对丹参药材的质量进行有效的鉴别。而采用本发明方法则可充分展示丹参化学成分的指纹图谱，信息量丰富，方法重现性良好，可有效鉴别丹参药材的质量。

发明内容

本发明的目的是提供一种丹参药材的指纹图谱鉴别方法，通过指纹图谱测定对丹参药材进行全面而有效的鉴别。

本发明的目的是通过如下技术方案实现的。

本发明丹参药材的指纹图谱鉴别方法，该方法包括如下步骤：

(a)色谱条件与系统适应性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈或甲醇、乙腈甲醇混合溶剂为流动相A，以甲酸水溶液或冰醋酸水溶液、磷酸水溶液、三氟乙酸水溶液为流动相B。检测器为紫外检测器、示差检测器或蒸发光检测器；

(b)供试品溶液的制备 取丹参药材粉末（过筛），精密称定，加水浸泡，加热回流，提取液滤过，取滤液，加入乙醇，静置一夜。吸取上清液，热空气吹干，加水溶解，备用。

(c)测定法 吸取供试品溶液适量，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，即得。

进一步优选的测定条件为：

(a)色谱条件与系统适应性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长10~25cm，内径3~5cm，粒径为1~10μm)；以乙腈为流动相A，以0.01~2%冰醋酸水溶液为流动相B；紫外检测器，检测波长200~400nm；柱温20~50℃，流速为每分钟0.2~2ml。

(b)供试品溶液的制备：取丹参药材粉末（过30~50目筛）0.2~1g，精密称定，加水20~40ml，浸泡20~40分钟，加热回流1~3小时，提取液滤过，取滤液5~15ml，加入80%~100%乙醇20~40ml，2~5℃静置一夜。吸取上清液0.5~5ml，50~70℃空气吹干，加水1~5ml溶解，备用。

(c)测定法 吸取供试品溶液5~40μl，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，即得。

最佳测定条件:

(a)色谱条件与系统适应性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱柱长为25cm，内径为4.6mm，粒径为5μm；以乙腈为流动相A，以0.3%冰醋酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为280nm；柱温30℃；流速为每分钟0.9ml。

(b) 供试品溶液的制备： 取丹参药材粉末（过40目筛）0.50g，精密称定，加水30ml浸泡30分钟，加热回流2小时，提取液过滤，取滤液10ml，加入95%乙醇28ml，4℃静置一夜。吸取上清液2ml，60℃空气吹干，加水2ml溶解，即得。

(c) 测定法 精密吸取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，记录75分钟色谱图。供试品色谱图应与对照图谱基本一致，有相对应的5个特征峰。其中峰1为丹参素；峰2为原儿茶醛；峰3为迷迭香酸；峰4为紫草酸 ；峰5为丹酚酸B。

按中药色谱指纹图谱相似度评价系统，供试品指纹图谱与对照指纹图谱经相似度计算，5分钟后的色谱峰，其相似度不得低于0.90，建立的丹参药材指纹图谱如图1所示。

相对保留时间

1号峰：0.19 2号峰：0.31 3号峰：0.92 4号峰：0.95 5号S峰：1.00

这5个峰峰面积比为：峰1（100~200）：峰2（100~300）：峰3（50~200）：峰4（50~200）：峰5（800~2000）

本发明通过对丹参药材进行指纹图谱测定，能够对丹参药材进行有效的鉴别。

本发明与背景技术相比具有的有益效果

1.研究表明，丹参药材中的水溶性成分的药理作用广泛,具有改善微循环、抗血栓、促进组织恢复等多种活性。总酚酸类成分具有很强的抗脂质过氧化和清除自由基等作用,其中含量最高的2个成分丹酚酸A和B活性最强,对脂质过氧化引起的细胞膜损伤有明显的保护作用。（李朝霞、王 地，丹参水溶性成分的研究进展，北京中医2004年6月第23卷第3期：176-178）。因此，对丹参药材水溶性成分建立了对照高效液相指纹图谱，完善了现有技术的不足，使之更具有科学性。

2.本发明针对丹参药材水溶性提取物进行检测，而绝大多数水溶性成分在280nm处均表现出了良好的吸收，故选用280nm作为其检测波长，可以充分反映其化学信息。

3.本发明与已公开的文献《丹参药材水溶性成分的高效液相色谱指纹图谱研究》（《色谱》2005年03期））中所述的方法相比较，不同之处和有益效果在于：二者的供试品溶液制备方法、色谱条件都不相同。

本发明优选出最佳的供试品溶液制备方法为：取丹参药材粉末（过40目筛）0.50g，精密称定，加水30ml浸泡30分钟，加热回流2小时，提取液过滤，取滤液10ml，加入95%乙醇28ml，4℃静置一夜。吸取上清液2ml，60℃空气吹干，加水2ml溶解，即得。

文献报到的供试品溶液制备方法为：称取丹参药材20g粉碎,过40目筛,于60℃减压干燥2h。精密称取约2g,置于索氏提取器中,用100ml水作提取溶剂,提取16h。将提取液过滤,放冷,定容,摇匀,即得供试品溶液。二者相比，本发明供试品溶液制备方法，具有取样量小、操作简便的特点。同时药材提取液经过在4℃低温下经95%乙醇沉淀处理，可有效除去药材中的糖类、黏液质等大分子杂质，减小杂质对图谱的干扰，并防止大分子杂质堵塞色谱柱，大大节约了成本和时间。

4.本发明使用的流动相比例未见报道。其特点是：流动相中A（乙腈）所占的比例随时间由低逐渐升高，流动相B（0.3%冰醋酸）比例随时间逐渐下降，采用梯度洗脱的方式，使得流动相的极性随时间变化，针对丹参药材中各种成分极性不同的特点，从而实现良好的分离。

附图说明

图1是丹参药材的对照指纹图谱。其中从左到右分别标出了其共有特征峰1至5号。

图2是本发明提供的丹参药材的对照指纹图谱。其中从左到右分别标出了其共有特征峰1至5号。

实施例一：丹参药材指纹图谱测定

1、仪器：Agilent 1260 型高效液相色谱仪，G1311C四元泵，柱温箱，G1316A ，G1315D，DAD检测器， Agilent Zorbax Eclipse XDB C18色谱柱（4.6×250mm，5μm）。质谱仪器系统为ESI-MSn质谱仪（Bruker公司）。

[0025 试剂：乙腈为色谱纯（Burdick&Jackson, Honeywell International Inc., USA）、冰醋酸色谱纯（Tedia company Inc.,USA）、水（Millipore, Bedford, MA, USA)，其它试剂均为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）。丹参素、原儿茶醛、丹酚酸B对照品购自中国生物制品有限公司。丹酚酸A、丹酚酸E、丹酚酸D为本实验室自制。所有样品留样保存在中国科学院上海药物研究所中药现代化中心样品室。

2、色谱条件 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，Agilent Zorbax Eclipse XDB C18色谱柱（柱长为25cm，内径为4.6mm，粒径为5μm）；以乙腈为流动相A，以0.3%冰醋酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为280nm；柱温25℃；流速为每分钟0.9ml。

梯度洗脱时间

3、供试品溶液的制备 取本品粉末（过40目筛）0.5g，精密称定，加水30ml浸泡30分钟，加热回流2小时，提取液滤过，取滤液10ml，加入95%乙醇28ml，4℃静置一夜。吸取上清液2ml，60℃空气吹干，加水2ml溶解，即得。

测定法 精密吸取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，记录75分钟色谱图。

供试品溶液的色谱图应与对照谱基本一致，主要的色谱峰应在75分钟以内出完，分离良好，具有代表意义的5个共有峰，不应有缺峰现象。

4、丹参药材样品测定结果

表 1丹参药材指纹图谱相似度结果

结果显示，11批丹参药材计算相似度，结果相似度均大于0.99，建立的丹参药材的对照指纹图谱如图2所示。

6方法学考察

6.1仪器精密度考察

取批号为DS20110502样品，按照前述供试品溶液制备方法制备，连续进样6次，考察指纹图谱精密度。将精密度实验色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》，计算相似度，结果表明有较高的相似度（相似度在0.99以上，见表2）。结果表明仪器精密度较高。

表2 丹参药材 HPLC指纹图谱精密度相似度

6.2指纹图谱重复性试验

供试品制备和分析方法如前所述，取同一批号丹参药材（批号DS20110502），平行制备6份供试品，考察指纹图谱的变化情况。将重复性实验色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》，计算相似度，如表3所示，结果表明有较高的相似度（相似度均在0.99以上）。

表3 丹参药材HPLC指纹图谱重复性相似度

6.3指纹图谱稳定性试验

按照前述方法制备丹参药材（DS20110502）供试品一份，于常温下保存，分别在0、4、8、12、16、24小时测定供试品溶液，考察稳定性，指纹图谱如图21所示，相似度计算结果见表4。显然，丹参药材供试品溶液在24小时内稳定。

表4 丹参药材HPLC指纹图谱稳定性相似度

实施例二：丹参药材指纹图谱测定

1. 仪器：Agilent 1260 型高效液相色谱仪，G1311C四元泵，柱温箱，G1316A ，G1315D，DAD检测器， Agilent Zorbax Eclipse XDB C18色谱柱（4.6×250mm，5μm）。质谱仪器系统为ESI-MSn质谱仪（Bruker公司）。

试剂：乙腈为色谱纯（Burdick&Jackson, Honeywell International Inc., USA）、冰醋酸色谱纯（Tedia company Inc.,USA）、水（Millipore, Bedford, MA, USA)，其它试剂均为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）。丹参素、原儿茶醛、丹酚酸B对照品购自中国生物制品有限公司。丹酚酸A、丹酚酸E、丹酚酸D为本实验室自制。所有样品留样保存在中国科学院上海药物研究所中药现代化中心样品室。

供试品溶液的制备 取本品粉末（过40目筛）0.5g，精密称定，加水30ml浸泡30分钟，加热回流2小时，提取液滤过，取滤液10ml，加入95%乙醇28ml，4℃静置一夜。吸取上清液2ml，60℃空气吹干，加水2ml溶解，即得。

测定法：精密吸取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，记录75分钟色谱图。

供试品溶液的色谱图应与对照谱基本一致，主要的色谱峰应在75分钟以内出完，分离良好，具有代表意义的5个共有峰，不应有缺峰现象。

2、色谱条件 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，Agilent Zorbax Eclipse XDB C18色谱柱（柱长为25cm，内径为4.6mm，粒径为5μm）；以乙腈为流动相A，以0.3%冰醋酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为230nm；柱温20℃；流速为每分钟0.5ml。

梯度洗脱时间

3.测定结果见表5

表5 11批丹参药材相似度结果

实施例三：丹参药材指纹图谱测定

1. 仪器：Agilent 1260 型高效液相色谱仪，G1311C四元泵，柱温箱，G1316A ，G1315D，DAD检测器， Agilent Zorbax Eclipse XDB C18色谱柱（4.6×250mm，5μm）。质谱仪器系统为ESI-MSn质谱仪（Bruker公司）。

试剂：乙腈为色谱纯（Burdick&Jackson, Honeywell International Inc., USA）、冰醋酸色谱纯（Tedia company Inc.,USA）、水（Millipore, Bedford, MA, USA)，其它试剂均为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）。丹参素、原儿茶醛、丹酚酸B对照品购自中国生物制品有限公司。丹酚酸A、丹酚酸E、丹酚酸D为本实验室自制。所有样品留样保存在中国科学院上海药物研究所中药现代化中心样品室。

供试品溶液的制备：取本品粉末（过40目筛）0.5g，精密称定，加水30ml浸泡30分钟，加热回流2小时，提取液滤过，取滤液10ml，加入95%乙醇28ml，4℃静置一夜。吸取上清液2ml，60℃空气吹干，加水2ml溶解，即得。

测定法：精密吸取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，记录75分钟色谱图。供试品溶液的色谱图应与对照谱基本一致，主要的色谱峰应在75分钟以内出完，分离良好，具有代表意义的5个共有峰，不应有缺峰现象。

2.色谱条件 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，Agilent Zorbax Eclipse XDB C18色谱柱（柱长为25cm，内径为4.6mm，粒径为5μm）；以乙腈为流动相A，以0.3%冰醋酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为380nm；柱温45℃；流速为每分钟1.8ml。

梯度洗脱时间

3.测定结果见表6

表6 11批丹参药材相似度结果

实验证实，采用本发明的方法，可有效的鉴别丹参药材的质量。

Claims (4)

1.丹参药材的指纹图谱鉴别方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）供试品溶液的制备：取丹参药材粉末（过30~50目筛）0.2~1g，精密称定，加水20~40ml，浸泡20~40分钟，加热回流1~3小时，提取液滤过，取滤液5~15ml，加入80%~95%乙醇20~40ml，2~5℃静置一夜，吸取上清液0.5~5ml，50~70℃空气吹干，加水1~5ml溶解，备用；

（2）指纹图谱测定：取供试品溶液适量，注入高效液相色谱仪，记录75分钟以内的色谱图，得到由其共有特征峰构成的丹参药材对照高效液相指纹图谱；其中高效液相色谱分析的条件如下：用十八烷基键合硅胶为填充剂；Agilent Zorbax Eclipse XDB C18色谱柱4.6×250mm；乙腈-0.01-2%冰醋酸为流动相梯度洗脱，梯度程序为：0min→5min→30min→45min→60min→62min→75min：对应流动相：乙腈：2%→7%→15%→20%→35%→50%→50%；0.01-2%冰醋酸：98%→93%→85%→80%→65%→50%→50%，检测波长为200nm-400nm；流速为0.2ml/min-2ml/min；柱温为20℃-50℃，所得到的丹参药材的对照指纹图谱有5个共有特征峰，其相对保留时间分别为：1号峰：0.19 , 2号峰：0.31 , 3号峰：0.92 , 4号峰：0.95，5号峰（S）：1.00。

2.根据权利要求1所述的丹参药材的指纹图谱鉴别方法，其特征在于：取丹参药材粉末（过40目筛）0.50g，精密称定，加水30ml浸泡30分钟，加热回流2小时，提取液滤过，取滤液10ml，加入95%乙醇28ml，4℃静置一夜，吸取上清液2ml，60℃空气吹干，加水2ml溶解，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液。

3.根据权利要求1所述的丹参药材的指纹图谱鉴别方法，其特征在于：其中所述的检测波长为280nm；流速为0.9ml/min；柱温为25℃。

4.根据权利要求1所述的丹参药材的指纹图谱鉴别方法，其特征在于：其中的流动相乙腈-0.01-2%冰醋酸用乙腈-0.03%磷酸溶液或乙腈-0.03%甲酸溶液代替。