CN103969352B

CN103969352B - 一种大黄药材的指纹图谱的鉴别方法

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Publication number: CN103969352B
Application number: CN201310040432.0A
Authority: CN
Inventors: 果德安; 吴婉莹; 赵丙贤; 吕延英; 刘蓉霞; 姚帅; 王俊平; 赵兴; 蔡录影; 王丹丹; 侯晋军; 笪娟
Original assignee: Xi'an Shijishengkang Pharmaceutical Industry Co Ltd
Current assignee: Xi'an Shijishengkang Pharmaceutical Industry Co Ltd
Priority date: 2013-02-02
Filing date: 2013-02-02
Publication date: 2015-11-25
Anticipated expiration: 2033-02-02
Also published as: CN103969352A

Abstract

本发明提供了大黄药材的指纹图谱鉴别方法，包括供试品溶液的制备、指纹图谱的测定、对照指纹图谱的确定和大黄药材指纹图谱的鉴别。通过对大黄药材进行HPLC指纹图谱测定和分析，确定了9个大黄药材的特征峰，这些共有特征峰构成了大黄药材的指纹特征，可作为大黄药材的对照指纹图谱；对需要鉴别的大黄药材可以与对照指纹图谱进行比对，检查共有特征峰的情况，以鉴别质量。本发明具有方法简便、重现性好、特征峰明显、准确可靠等特点，有利于鉴别大黄药材的质量。

Description

一种大黄药材的指纹图谱的鉴别方法

技术领域

本发明涉及一种大黄药材指纹图谱的鉴别方法，具体地说是用高效液相色谱指纹图谱法来对大黄药材的有效成分进行质量控制的一种鉴别方法。

背景技术

大黄具有攻积滞、清湿热、泻火、凉血、祛瘀、解毒等功效，为《中华人民共和国药典2010版》一部收载品种。大黄为蓼科植物掌叶大黄Rheumpalmatum,L．、唐古特大黄Rheumtanguticum／Maxim.exBalf.或药用大黄RheumojflcinaleBaill.的干燥根和根茎。大黄药材中的主要成分是蒽醌苷及双蒽酮苷，其醌苷有：大黄酚-1-葡萄糖苷或大黄酚苷、大黄素-6-葡萄糖苷、芦荟大黄素-8-葡萄糖苷、大黄素甲醚葡萄糖苷、大黄酸-8-葡萄糖苷；掌叶大黄中还含有大黄素双葡萄糖苷、芦荟大黄素双葡萄糖苷、大黄酚双葡萄糖苷。双蒽酮苷有番泻苷A、B、C、D、E、F。游离型蒽醌类主要有：大黄酚、大黄素、大黄素甲醚、芦荟大黄素、大黄酸。大黄又含有大黄鞣酸及其相关物质,如没食子酸、儿茶素、大黄四聚素。此外，大黄尚含有脂肪酸、草酸钙、葡萄糖、果糖和淀粉。目前大黄药材的质量控制方法主要有：以芦荟大黄素(C₁₅H₁₀O₅)、大黄酸(C₁₅H₈0₆)、大黄素(C₁₅H₁₀0₅)、大黄酚(C₁₀H₁₀0₄)和大黄素甲醚(C16H1205)的总量测定作为含量测定方法《中华人民共和国药典2010版一部》；中药指纹图谱是指某些中药材或中药制剂经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示其化学特征的色谱图或光谱图。中药指纹图谱是一种综合的，可量化的鉴定手段，它是建立在中药化学成分系统研究的基础上，主要用于评价中药材以及中药制剂半成品质量的真实性、优良性和稳定性。“整体性”和“模糊性”为其显著特点。中国食品药品监督管理局于2000年颁布了《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求（暂行）》，要求中药注射剂必须进行指纹图谱的研究，并建立其相关的标准。规范了中药指纹图谱的研究，从而掀起了国内近几年来对指纹图谱的研究热潮。目前，对中药材质量控制较成熟的方法有单个成分含量测定或一类成分如总皂苷、总黄酮等的紫外分光光度测定法，不能对制剂进行全面直观的质量控制。采用指纹图谱技术除了能反映几乎全部成分的含量、种类外，尚能反映成分的比例、未知成分（含量测定方法中可能已被作为无效或干扰成分扣除）的产生，更多的是从药物稳定性、安全性上进行监测。

《中国药典》2010年版，采用薄层色谱法对大黄药材进行鉴别，由于薄层色谱法鉴别法本身受温度、湿度、薄层板厚度以及载样量等诸多因素影响，存在样品的化学成分体现不完全，可鉴别的成分数量较少，同一样品的重现性不佳的缺点，而已有文献报道的大黄指纹图谱技术，图谱中体现的化学成分较少，提供的信息量小，不能很好地代表大黄药材的整体质量，不能对大黄药材的质量进行有效的鉴别。而采用本发明方法则可充分展示大黄化学成分的指纹图谱，信息量丰富，方法重现性良好，可有效鉴别大黄药材的质量。

发明内容

本发明的目的是提供一种大黄药材的指纹图谱鉴别方法，通过指纹图谱测定对大黄药材进行全面而有效的鉴别。

本发明的目的是通过如下技术方案实现的。

本发明大黄药材的指纹图谱鉴别方法，该方法包括如下步骤：

(a)色谱条件与系统适应性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈或甲醇、乙腈甲醇混合溶剂为流动相A，以甲酸水溶液或冰醋酸水溶液、磷酸水溶液、三氟乙酸水溶液为流动相B。检测器为紫外检测器、示差检测器或蒸发光检测器；

(b)供试品溶液的制备取大黄药材粉末（过筛），精密称定，加水浸泡，加热回流，提取液离心，滤过，取滤液，加入乙醇，静置一夜。吸取上清液，热空气吹干，加水溶解，用微孔滤膜滤过，取续滤液，备用。

(c)测定法吸取供试品溶液适量，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，即得。

进一步优选的测定条件为：

(a)色谱条件与系统适应性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长10～25cm，内径3～5cm，粒径为1～10μm)；以乙腈为流动相A，以0.01～2%冰醋酸水溶液为流动相B；紫外检测器，检测波长200～400nm；柱温20～50℃，流速为每分钟0.2～2ml。

(b)供试品溶液的制备取大黄药材粉末（过30～50目筛）0.5～2g，精密称定，加水20～40ml浸泡20～40分钟，加热回流20～40分钟，提取液3000～5000rpm离心5～15min，滤过，取滤液5～15ml，加入80%～95%乙醇20～40ml，2～5℃静置一夜。吸取上清液0.5～5ml，50～70℃空气吹干，加水1～5ml溶解，用微孔滤膜（0.22～0.45μm）滤过，取续滤液，即得。

(c)测定法吸取供试品溶液5～40μl，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，即得。

最佳测定条件:

(a)色谱条件与系统适应性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱柱长为25cm，内径为4.6mm，粒径为5μm；以乙腈为流动相A，以0.25%冰醋酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为280nm；柱温25℃；流速为每分钟0.9ml。

(b)取大黄药材粉末（过40目筛）1.00g，精密称定，加水30ml浸泡30分钟，加热回流30分钟，提取液4000rpm离心10min，滤过，取滤液10ml，加入95%乙醇28ml，4℃静置一夜。吸取上清液2ml，60℃空气吹干，加水2ml溶解，用微孔滤膜（0.45μm）滤过，取续滤液，即得。

(c)测定法精密吸取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定，记录75分钟色谱图，即得。

供试品色谱图应与对照图谱基本一致，如建立的大黄药材对照图谱图1所示，有相对应的9个特征峰。按中药色谱指纹图谱相似度评价系统，供试品指纹图谱与对照指纹图谱经相似度计算，5分钟后的色谱峰，其相似度不得低于0.85。

相对保留时间

1号峰：0.132号峰：0.343号峰：0.664号峰：0.67

5号峰：0.796号峰：0.897号峰：0.998号峰（S）：1.00

9号峰：1.15

其中1号峰为没食子酸，2号峰为儿茶素，3号峰为大黄素-O-葡萄糖苷，4号峰为大黄素甲醚-8-O-葡萄糖苷，5号峰为番泻苷S8，6号峰为肉桂酰没食子酸葡萄糖，7号峰为大黄素-8-O-葡萄糖苷，9号峰为大黄酸。这9个峰峰面积比为：峰1（120～720）；峰2（100～920）；峰3（500～2000）；峰4（150～900）；峰5（300～1000）；峰6（150～700）；峰7（200～750）；峰8（700～1700）；峰9（50～500）。

本发明通过对大黄药材进行指纹图谱测定，能够对大黄药材进行有效的鉴别。

本发明与背景技术相比具有的有益效果

本发明与已公开的文献《肾康注射液中大黄药材指纹图谱研究》（《中国药业》2001年10期）中所述的方法相比较，不同之处和有益效果在于：

（a）供试品溶液制备方法不同

本发明优选出最佳的供试品溶液制备方法为：取大黄药材粉末（过40目筛）1.00g，精密称定，加水30ml浸泡30分钟，加热回流30分钟，提取液过滤，取滤液10ml，加入95%乙醇28ml，4℃静置一夜。吸取上清液2ml，60℃空气吹干，加水2ml溶解，用微孔滤膜（0.45μm）滤过，取续滤液，即得。

文献报到的供试品溶液制备方法为：精密称取大黄5g,加水250ml,微沸煎煮1h,滤过，滤液浓缩至约10ml,加6倍量乙醇，充分搅拌，静置过夜，滤过，滤液蒸干，残渣加水溶解，置100ml量瓶中，用水稀释至刻度。精密吸取上述溶液5ml,加水至20ml,精密加入2ml盐酸、20ml氯仿，水浴回流1h，分取氯仿层，水层用20ml氯仿提取，合并氯仿液，蒸干，残渣加甲醇适量，至10ml量瓶中，并用甲醇稀释至刻度。

（b）色谱条件不同

本发明优选出最佳的色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱柱长为25cm，内径为4.6mm，粒径为5μm；以乙腈为流动相A，以0.25%冰醋酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为280nm；柱温25℃；流速为每分钟0.9ml。

测定法精密吸取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定，记录75分钟色谱图，即得。

而文献中的色谱条件和测定方法为：以甲醇-1%冰醋酸（77:23）为流动相，采用等度洗脱，检测波长：430nm；柱温35℃；流速为每分钟1.1ml，记录60分钟色谱图，即得。

可以看出对比文件技术方案与本发明的实验方法有明显的区别。本发明实验方法更能全面系统地对大黄药材所含成分进行鉴别。而对比文献报告中将样品加盐酸水解然后用氯仿萃取，产物仅仅是到了水解后的苷元，因此图谱中体现成分较少，不能代表大黄药材整体质量。而本发明的方法，操作简单，供试品不经盐酸水解，直接进样分析，并按照梯度洗脱程序，将大黄药材中的化学成分根据极性差异进行分离，提供的信息量更加丰富，能够在最大程度上体现大黄药材的整体质量，这一点从两者的图谱上能清楚的体现。

采用本发明方法得到的大黄药材色谱图如图2所示。

文献报道方法得到的大黄药材色谱图如图3所示。

（c）发明人未见有关本发明使用的流动相比例的报道。本发明流动相的特点是：流动相中A（乙腈）所占的比例随时间逐渐升高，流动相B（0.25%冰醋酸）比例随时间逐渐下降，采用梯度洗脱的方式，使得流动相的极性随时间变化，针对大黄药材中各种成分极性不同的特点，从而实现良好的分离。

附图说明

图1是大黄药材的对照指纹图谱。其中从左到右分别标出了其共有特征峰1至9号。

图2是本发明提供的大黄药材色图谱。其中从左到右分别标出了其共有特征峰1至9号。

图3是文献报道方法得到的大黄药材色谱图。

图4是本发明提供的大黄药材的对照指纹图谱。其中从左到右分别标出了其共有特征峰1至9号。

实施例一：大黄药材指纹图谱测定

1、仪器：Agilent1260型高效液相色谱仪，G1311C四元泵，柱温箱，G1316A，G1315D，DAD检测器，AgilentZorbaxSBC18色谱柱（4.6×250mm，5μm）。质谱仪器系统为ESI-MSn质谱仪（Bruker公司）。

试剂：乙腈为色谱纯（Burdick&Jackson,HoneywellInternationalInc.,USA）、冰醋酸色谱纯（TediacompanyInc.,USA）、水（Millipore,Bedford,MA,USA)，其它试剂均为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）。大黄酸对照品购自中国生物制品有限公司。

2、色谱条件以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，AgilentZorbaxSBC18色谱柱（柱长为25cm，内径为4.6mm，粒径为5μm）；以乙腈为流动相A，以0.25%冰醋酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为280nm；柱温25℃；流速为每分钟0.9ml。

梯度洗脱时间

3、供试品溶液的制备取本品粉末（过40目筛）1.0g，精密称定，加水30ml浸泡30分钟，加热回流30分钟，提取液过滤，取滤液10ml，加入95%乙醇28ml，4℃静置一夜。吸取上清液2ml，60℃空气吹干，加水2ml溶解，用微孔滤膜（0.45μm）滤过，取续滤液，即得。

4、测定法精密吸取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，记录75分钟色谱图。

供试品溶液的色谱图应与对照图谱基本一致，主要的色谱峰应在75分钟以内出完，分离良好，具有代表意义的9个共有峰，不应有缺峰现象。

5、大黄药材样品指纹图谱测定结果

表大黄药材指纹图谱测定结果

以12批大黄药材建立的对照图谱如图4所示。

相对保留时间

6方法学考察

6.1仪器精密度考察

取批号为DH20110704样品，按照前述供试品溶液制备方法制备，连续进样6次，考察指纹图谱精密度。将精密度实验色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》，计算相似度，结果有较高的相似度（相似度在0.99以上，见表2），表明仪器精密度较高。

表2大黄药材HPLC指纹图谱精密度相似度

6.2指纹图谱重复性试验

供试品制备和分析方法如前所述，取同一批号大黄药材（批号DH20110704），平行制备6份供试品，考察指纹图谱的变化情况。将重复性实验色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》，计算相似度，如表3所示，结果表明有较高的相似度（相似度均在0.99以上）。

表3大黄药材HPLC指纹图谱重复性相似度

6.3指纹图谱稳定性试验

按照前述方法制备大黄药材（批号DH20110704）供试品一份，于常温下保存，分别在0、4、8、12、16、24小时测定供试品溶液，考察稳定性，相似度计算结果见表4。显然，大黄药材供试品溶液在24小时内稳定。

表4大黄药材HPLC指纹图谱稳定性相似度

实施例二：大黄药材指纹图谱测定

2、色谱条件以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，AgilentZorbaxSBC18色谱柱（柱长为25cm，内径为4.6mm，粒径为5μm）；以乙腈为流动相A，以0.25%冰醋酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为230nm；柱温20℃；流速为每分钟0.5ml。

梯度洗脱时间

5、大黄药材样品指纹图谱测定见表5

表512批大黄药材相似度结果

实施例三：大黄药材指纹图谱测定

2、色谱条件以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，AgilentZorbaxSBC18色谱柱（柱长为25cm，内径为4.6mm，粒径为5μm）；以乙腈为流动相A，以0.25%冰醋酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为380nm；柱温45℃；流速为每分钟1.8ml。

梯度洗脱时间

5、大黄药材样品指纹图谱测定见表6

表612批大黄药材相似度结果

实验证实，采用本发明的方法，可有效的鉴别大黄药材的质量。

Claims

1.大黄药材的指纹图谱鉴别方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）供试品溶液的制备：取大黄药材粉末0.5～2g，过30～50目筛，加水20～40ml浸泡20～40分钟，加热回流20～40分钟，提取液3000～5000rpm离心5～15min，滤过，取滤液5～15ml，加入80%～95%乙醇20～40ml，2～5℃静置一夜，吸取上清液0.5～5ml，50～70℃空气吹干，加水1～5ml溶解，用微孔滤膜滤过，取续滤液，备用；

（2）指纹图谱测定：取供试品溶液适量，注入高效液相色谱仪，记录75分钟以内的色谱图，得到由其共有特征峰构成的大黄药材对照高效液相指纹图谱；其中高效液相色谱分析的条件如下：用十八烷基键合硅胶为填充剂；AgilentZorbaxEclipseXDBC18色谱柱4.6×250mm；乙腈-0.01%～2%冰醋酸为流动相梯度洗脱，梯度程序为：0min→5min→30min→45min→60min→62min→75min：对应流动相：乙腈：2%→7%→15%→20%→35%→50%→50%；0.01-2%冰醋酸：98%→93%→85%→80%→65%→50%→50%，检测波长为200nm-400nm；流速为0.2ml/min-2ml/min；柱温为20℃-50℃；所得到的大黄药材的对照指纹图谱有9个共有特征峰，其相对保留时间分别为：1号峰：0.13，2号峰：0.34，3号峰：0.66，4号峰：0.67，5号峰：0.79，6号峰：0.89，7号峰：0.99，8号峰（S）：1.00，9号峰：1.15。

2.根据权利要求1所述的大黄药材的指纹图谱鉴别方法，其特征在于：大黄药材粉末过40目筛，加水30ml浸泡30分钟，加热回流30分钟，提取液4000rpm离心10min，滤过，取滤液10ml，加入95%乙醇28ml，4℃静置一夜，吸取上清液2ml，60℃空气吹干，加水2ml溶解，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液。

3.根据权利要求1所述的大黄药材的指纹图谱鉴别方法，其特征在于：其中所述的检测波长为280nm；流速为0.9ml/min；柱温为25℃。

4.根据权利要求1所述的大黄药材的指纹图谱鉴别方法，其特征在于：其中的流动相乙腈-0.01%～2%冰醋酸用乙腈-0.03%磷酸溶液或乙腈-0.03%甲酸溶液代替。