CN102192958A - 一种同时测定正品大黄中13个化学成分含量的hplc方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种HPLC-DAD法同时测定大黄中13个化学成分含量的方法，该方法包括样品提取和液相分离两个步骤：首先，取干燥的大黄药材粉末0.200g(60mesh)，精密称定，置10ml茶色容量瓶中，加入10ml甲醇，室温浸泡2h后超声30min，重复3次，合并提取液并过滤回收溶剂后用甲醇溶解并转移至25ml茶色容量瓶，定容并摇匀，作为供试品溶液；然后，进行高效液相色谱分析，色谱柱：Zorbax Eclipse XDB-C18色谱柱(5μm，250mm×4.6mm，Agilent)；流动相：甲醇(A)-0.05％磷酸水溶液(B)，梯度洗脱，流速：1.0ml/min，检测波长：280nm，232nm，柱温：30℃。本发明的方法经方法学验证准确可靠，可用于大黄药材的多指标成分的定量分析。

Description

一种同时测定正品大黄中13个化学成分含量的HPLC方法

技术领域

本发明涉及一种HPLC-DAD法同时测定大黄中13个化学成分含量的方法，可同时对三种正品大黄中的13个化学成分进行定量测定的HPLC-DAD方法。

背景技术

大黄是我国著名的特产药材，药用历史悠久。大黄味苦，性寒，归胃、大肠、脾、肝经，具攻下导滞、泻火解毒、祛瘀止血等作用。《神农本草经》载“其主下淤血、血闭、寒热、破症瘕积聚、留饮宿食、荡涤肠胃、推陈致新、通利水谷、调中化食、安合五脏”。2005版中国药典收载的正品大黄为蓼科植物掌叶大黄Rheum palmatum L.、唐古特大黄Rheum tanguticum Maxim.ex Balf.或药用大黄Rheum officinale Baill.的干燥根及根茎。掌叶大黄和唐古特大黄主要分布于青海、甘肃、四川等地，二者商品均称“西大黄”、“北大黄”；药用大黄主产于四川、贵州、湖北等地，商品称“南大黄”、“川大黄”。临床和药理学研究表明：大黄中蒽醌类成分有抗菌、抗病毒、抗肿瘤的作用；蒽酮类成分主要有泻下的作用；二苯乙烯苷类成分主要有扩张毛细血管、降血压、抗氧化的作用；鞣质类成分主要有止血、抗氧化、抗病毒、促进氮代谢、改善肾功能、治疗精神病的作用；苯丁酮类成分主要有抗炎镇痛的作用。因此，大黄中多种活性成分的定量分析对于大黄药材的质量评价具有十分重要的意义。文献[91]报道中对大黄中化学成分的分析多采用少数几个指标成分的含量测定。本发明建立了一个对大黄中13个主要活性成分同时进行含量测定的简单准确的方法，并应用该方法分别分析了这13中活性成分在唐古特大黄(15批次)、掌叶大黄(18批次)及药用大黄(13批次)中的含量，进而比较不同基源正品大黄在化学成分组成和含量上的异同，为临床上大黄的应用提供更好的理论指导。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中只能测定大黄中少数几个指标成分的含量的缺陷，提供一种简单、快速、准确的HPLC-DAD方法，该方法旨在建立同时测定大黄中13个化合物的含量，进而比较不同基源正品大黄在化学成分组成和含量上的异同，为临床上大黄的应用提供更好的理论指导。本方法操作简单，结果可靠灵敏，适用于大黄药材的多指标成分质量控制。

本发明的技术方案：一种同时检测大黄中13个化学成分的HPLC-DAD测定方法，包括样品提取和液相分离两个步骤，其特征在于对大黄中的被测成分的充分提取和13个化合物的良好分离，采用Zorbax EclipseXDB-C18色谱柱分离，以甲醇-0.05％磷酸水溶液为流动相作梯度洗脱。

(1).标准溶液的配置

分别称取13个对照品适量，精密称定，加甲醇制成CA(0.596mg/ml)，RG(0.611mg/ml)，ECG(0.360mg/ml)，RGG(0.368mg/ml)，LI(0.386mg/ml)，SB(0.350mg/ml)，HMG(0.607mg/ml)，SA(0.388mg/ml)，AE(0.329mg/ml)，RH(0.430mg/ml)，EM(0.290mg/ml)，CH(0.390mg/ml)，PH(0.320mg/ml)的混和对照品溶液作为储备液，密封4℃保存。

(2).供试品溶液的制备

取干燥的大黄药材粉末0.200g(60mesh)，精密称定，置10ml茶色容量瓶中，加入10ml甲醇，室温浸泡2h后超声30min，重复3次，合并提取液并过滤，回收溶剂后用甲醇溶解并转移至25ml茶色容量瓶，定容并摇匀，经微孔滤膜(0.45μm)滤过，HPLC分析。

(3).液相色谱分离

色谱柱：Zorbax Eclipse XDB-C18色谱柱(5μm，250mm×4.6mm，Agilent)

流动相：甲醇(A)-0.05％磷酸水溶液(B)，梯度洗脱，见Table 3-2

流速：1.0ml/min

检测波长：280nm，232nm

柱温：30℃

进样体积：10μl

Mobile-phase gradient

含量计算方法

13个被测化合物在标准曲线线性范围内呈良好的线性(r²＞0.9985)。日内精密度和日间精密度的相对标准偏差分别为0.15-0.90％和0.98-2.39％；该方法方法的回收率在96.41-103.87％范围内。色谱中13个化学成分的确认通过与对照品的紫外图谱和保留时间相比较来确认，按标准曲线法以峰面积计算大黄中13个化学成分的含量。

本发明的有益成果

1、样品提取方法简单，被测成分可被充分提取；

2、该方法准确、快速、灵敏度高，各项方法学指标均可满足实际检测的需要。

附图说明

图1 13个被测化合物的标准曲线

图2混合对照品溶液(A)唐古特大黄(B)、掌叶大黄(C)和药用大黄(D)的HPLC谱图

具体实施方式

一、实验部分

1.仪器与试剂

高效液相色谱仪：Waters 2695高效液相色谱仪(美国Waters公司)；Waters 2996 PDA二级管阵列检测器(美国Waters公司)；Empower色谱工作站(美国Waters公司)；METTLER AB135-S(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)；分析用甲醇为色谱纯(Burdick&Jackon)；

其余试剂为分析纯(北京化学试剂厂)；水为双蒸水由Millipore纯水系统制备(Millipore，Milford，MA，USA)；大黄酚(Chrysophanol)，(+)-儿茶素((+)-Catechin)，莲花掌苷(Lindleyin)，6-羟基酸模素-8-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(6-Hydroxymusizin-8-O-β-D-glucopyranoside)，白黎芦醇4′-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(Resveratrol 4′-O-β-D-glucopyranoside)，白黎芦醇4′-O-β-D-(6″-O-没食子酰)-吡喃葡萄糖苷(Resveratrol 4′-O-β-D-(6″-O-galloyl)-glucopyranoside)等对照品由作者从唐古特大黄中分离得到并经过波谱鉴定；大黄素(Emodin，批号：110756-200110)，大黄素甲醚(Physcion，批号：110758-200610)，芦荟大黄素(Aloe-emodin，批号：110795-200806)，大黄酸(Rhein，批号：110757-200206)等对照品由中国药品生物制品鉴定所提供；番泻苷A(Sennoside A)，番泻苷B(Sennoside B)，表儿茶素-3-没食子酸酯((-)-Epicatechin3-O-gallate)等对照品由四川维克奇生物科技有限公司提供，以上13种对照品经HPLC分析其纯度均大于98％。

大黄药材由作者采集，经白志川教授鉴定为唐古特大黄Rheum tanguticum Maxim.ex Balf.，掌叶大黄Rheum palmatum L.，药用大黄Rheum officinale Baill.。

2.液相色谱条件

色谱柱：Zorbax Eclipse XDB-C₁₈色谱柱(5μm，250mm×4.6mm，Agilent)

流动相：甲醇(A)-0.05％磷酸水溶液(B)，梯度洗脱，见Table 1

流速：1.0ml/min

检测波长：280nm，232nm

柱温：30℃

进样体积：10μl

Table 1 Mobile-phase gradient

3.对照品溶液的制备

分别称取13个对照品适量，精密称定，加甲醇制成CA(0.596mg/ml)，RG(0.611mg/ml)，ECG(0.360mg/ml)，RGG(0.368mg/ml)，LI(0.386mg/ml)，SB(0.350mg/ml)，HMG(0.607mg/ml)，SA(0.388mg/ml)，AE(0.329mg/ml)，RH(0.430mg/ml)，EM(0.290mg/ml)，CH(0.390mg/ml)，PH(0.320mg/ml)的混和对照品溶液作为储备液，密封4℃保存。

4供试品溶液的制备

取干燥的大黄药材粉末0.200g(60mesh)，精密称定，置10ml茶色容量瓶中，加入10ml甲醇，室温浸泡2h后超声30min，重复3次，合并提取液并过滤，回收溶剂后用甲醇溶解并转移至25mL茶色容量瓶，定容并摇匀，经微孔滤膜(0.45μm)滤过，HPLC分析。

二、结果与讨论

1.提取方法的选择

为了最大程度的提取主要成分，试验中以13个被测成分为指标，比较了提取溶剂、提取方法、提取次数对提取率的影响。首先比较了不同提取溶剂50％甲醇、80％甲醇和甲醇对提取率的影响，结果显示甲醇提取效率高，基线平，重现好，故选择甲醇作为提取溶剂；随后比较了不同提取方法冷浸12h、冷浸24h、浸泡lh后超声30min、浸泡2h后超声30min、浸泡3h后超声30min对对提取率的影响，结果显示浸泡2h后超声30min的提取效率最佳，因此随后的试验都采用浸泡2h后超声30min；然后比较了不同提取次数1次、2次、3次、4次对提取率的影响，结果表明提取3次即可将被测成分完全提取。

2.色谱条件的优化

为了得到一个理想的色谱条件即在尽量短的时间内使得被分析物的峰与相邻峰之间达到基线分离，试验中对色谱柱(phenomenex C₁₈ 5μm，250mm×4.6mm；Zorbax Eclipse XDB-C₁₈ 5μm，250mm×4.6mm；Alltima C₁₈ 5μm，250mm×4.6mm)，流动相(甲醇-水，乙腈-水，甲醇-乙酸-水，甲醇-甲酸-水，甲醇-磷酸-水)，柱温(25，30，35℃)等主要影响因素进行了考察。结果表明在2条件下，各被测成分之间的分离效果最佳。大黄中化学成分复杂，有高极性化合物，定量成分极性范围大，需要梯度洗脱，且开始梯度变化速率要缓慢，后期需要迅速变化。摸索了多种流动相梯度后，选定的梯度洗脱条件见Table 1。

3.标准曲线、检测限和定量限

将混和对照品储备液逐步稀释得到一系列对照品溶液，以10μl进样测定峰面积值，制备标准曲线，通过峰面积和对照品量作线性回归，计算线性回归和相关系数，结果(Table 2)显示13个化合物在标准曲线线性范围内呈良好的线性(r²＞0.9985)。最低检测限是信噪比为3时样品的量，将信噪比为10时样品的量作为定量限。结果见Table 2。

Table 2 Detection wavelength(λ)，regression data，LODs and LOQs for the 13 analytes of the assay

^ay refers to peak area，x is quantity of the standard substances(μg)，r2 is the correlation coefficient of the equation.

^bLOD(the limit of detection，S/N＝3)and LOQ(limit of quantitation，S/N＝10).

CA：(+)-Catechin；RG：Resveratrol 4′-O-β-D-glucopyranoside ECG：(-)-Epicatechin 3-O-gallate；LI：Lindleyin；RGG：Resveratrol 4′-O-β-D-(6″-O-galloyl)-glucopyranoside；SB：Sennoside B；HMG：6-Hydroxymusizin-8-O-β-D-glucopyranoside；SA：Sennoside A；AE：Aloe-emodin；RH：Rhein；EM：Emodin；CH：Chrysophanol；PH：Physcion

4.精密度、重复性和稳定性试验

精密度的考察为测定对照品溶液的日内、日间精密度。日内精密度是在同一天内对同一对照品溶液连续测定6次，而日间精密度则是对同一对照品溶液每天测定一次，连续3天。结果如表Table 3所示，日内精密度和日间精密度的相对标准偏差分别为0.15-0.90％和0.98-2.39％，说明本实验建立的方法具有良好的重现性。

取同一大黄药材6份，按上述方法平行操作、分析、计算，以相对标准偏差来评价该方法的重复性。结果(Table 3)显示13个化合物的相对标准偏差在1.09-2.86％的范围内，说明建立的方法重复性良好。取大黄药材按照上述方法制备样品溶液，分别在0、2、4、6、8、12、16、24h测定，以相对标准偏差来评价稳定性。结果如表Table 3所示，表明样品在24h内具有良好的稳定性。

Table 3 Precision，repeatability，and stability of the 13 analytes

Note：All the abbreviations see in Table 2

5回收率试验

回收率试验用来进一步评价方法的准确性。同一大黄样品，按上述方法制备相同浓度的6份样品(样品取样量减半，以1∶1比例加入对照品)，通过计算测定的理论值和真实值的比率来计算回收率。结果见表Table 4，方法的回收率在96.41-103.87％范围内，表明该方法具有良好的可靠性和准确性。

Table 4 Recovery of the 13 analytes(n＝6)

^aRecovery(％)＝(amount_determined-amount_original)/amount_spiked×100.

Note：All the abbreviations see in Table 2

6样品分析

应用所建立的方法，对三种正品大黄中的13个化学成分进行了同时测定。色谱图中13个化学成分的确认通过与对照品的紫外图谱和保留时间相比较来确认。13个化学成分的含量测定结果见表Table 5。

Table 5 Contents of 13 analytes in official Rhubarb samples(mean，n＝3)(mg/g)

“tr”：below the linear range of calibration，“n．d”：not detect

Note：All the abbreviations see in Table 2

Claims (3)

1.HPLC-DAD法同时测定大黄中13个化学成分含量的方法，包括样品提取和液相分离两个步骤，其特征在于对大黄中的13个被测成分的充分提取和良好分离，采用Zorbax Eclipse XDB-C18色谱柱分离，以甲醇-0.05％磷酸水溶液为流动相作梯度洗脱。

(1).标准溶液的配置

分别称取13个对照品适量，精密称定，加甲醇制成CA，RG，ECG，RGG，LI，SB，HMG，SA，AE，RH，EM，CH，PH的混和对照品溶液作为储备液，密封4℃保存。

(2).供试品溶液的制备

取干燥的大黄药材粉末0.200g(60mesh)，精密称定，置10ml茶色容量瓶中，加入10ml甲醇，室温浸泡2h后超声30min，重复3次，合并提取液并过滤，回收溶剂后用甲醇溶解并转移至25mL茶色容量瓶，定容并摇匀，经微孔滤膜(0.45μm)滤过，HPLC分析。

(3).液相色谱分离

色谱柱：Zorbax Eclipse XDB-C18色谱柱(5μm，250mm×4.6mm，Agilent)

流动相：甲醇(A)-0.05％磷酸水溶液(B)，梯度洗脱，见Table 3-2

流速：1.0ml/min

检测波长：280±5nm，232±5nm

柱温：30℃

进样体积：10μl

Mobile-phase gradien

2.权利1所要求的测定方法，其特征在于取大黄药材粉末0.200g，加入10ml甲醇，室温浸泡2h后超声30min，重复3次。

3.权利1所要求的测定方法，其特征在于甲醇-0.05％磷酸水溶液梯度洗脱。

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