CN109932437B - 一种药物组合物的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种药物组合物的检测方法，所述的药物组合物为含有玄参提取物、麦冬提取物、甘草提取物或桔梗提取物的组合物，利用高效液相色谱法对其进行检测。所述液相色谱检测条件为：色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填料；流动相A为磷酸溶液，流动相B为乙腈，采用梯度洗脱及双波长切换进行检测。该方法具有快速、高效、稳定、准确等有效，能够快速、有效地对药物组合物的多个指标成分进行同时检测。

Description

一种药物组合物的检测方法

技术领域

本发明涉及药物检测领域，具体涉及一种药物组合物的检测方法。

背景技术

玄麦甘桔胶囊、颗粒等成方制剂均收载于《中国药典》2015年版一部，由玄参、麦冬、甘草、桔梗四味中药组成。具有清热滋阴，祛痰利咽，用于阴虚火旺，虚火上浮，口鼻干燥，咽喉肿痛。由于玄麦甘桔胶囊同时包含了玄参、麦冬、甘草和桔梗四味药材的多种化学成分，包括：环烯醚萜类化合物哈巴俄苷、苯丙素类化合物肉桂酸、黄酮类成分甘草苷、皂苷类成分甘草酸、皂苷类粗皂苷麦冬皂苷Ra、桔梗皂苷D等母核结构相近、性质相似，在定性和定量检测中常常互相干扰，要利用HPLC方法准确将目标物质同其他杂质有效分离并且定量分析存在较大难度，成方制剂的质量控制更为困难。

现有技术《中国药典》2015年版、郭文婷等【RP-HPLC梯度洗脱法测定玄麦甘桔胶囊中哈巴俄苷与肉桂酸含量，中药材2008年8月第31卷第8期】、蒋华科等【高效液相色谱法测定玄麦甘桔颗粒中甘草酸的含量，中南药学2012年2月第10卷第2期】或胥秀英等【HPLC法同时测定麦冬药材中麦冬皂苷Ra和慈溪麦冬皂苷A的含量，中国药房2010年第2l卷第39期】等所介绍的高效液相色谱检测方法均仅检测玄麦甘桔胶囊中特定药材的特定成分，而无法有效对玄麦甘桔成方制剂中多味药材的有效成分进行准确定性和定量分析。而张萍、郭亚东等所介绍的高效液相色谱检测方法【RP-HPLC法测定玄麦甘桔颗粒中甘草苷、甘草酸、哈巴俄苷和肉桂酸的含量，药物分析杂志，2008，28(5)】虽然采用双波长检测方法检测出玄麦甘桔有效成分甘草苷、甘草酸、哈巴俄苷及肉桂酸，但无法检测出桔梗和麦冬的有效成分桔梗皂苷D、麦冬皂苷Ra，且甘草苷峰处包裹有杂峰，出现后拖尾现象，且整个基线过高，干扰较为严重，无法对玄麦甘桔成方制剂的有效成分进行准确定性和定量分析。

因此，建立一种简单、有效、灵敏度高的多成分高效液相色谱检测方法，对于玄麦甘桔成方制剂的质量控制和检测来说具有十分重要的意义。

发明内容

本发明解决的技术问题之一是针对含有玄参、麦冬、甘草或桔梗药物组合物，如何快速、有效且能准确的检测有效成分，从而更好的控制药物组合物质量，为了解决上述技术问题，本发明提供了下述技术方案：

本发明一方面提供一种药物组合物检测方法，该方法包括以下步骤：取适量药物组合物制备成供试品溶液，利用液相色谱法对其进行检测，其中所述液相色谱的色谱条件为：色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填料；流动相A为磷酸溶液，流动相B为乙腈，采用梯度洗脱及检测波长切换进行检测；其中所述药物组合物含有玄参提取物、麦冬提取物、甘草提取物或桔梗提取物中的一种或多种提取物药。

本发明提供的药物组合物的检测方法，其所述的梯度洗脱条件为：

所述检测波长为276nm和210nm，检测波长切换条件为在梯度洗脱6-16分钟内的任意时间点将检测波长276nm切换至210nm，优选为在梯度洗脱第8分钟时，将检测波长276nm切换至210nm。

本发明提供的药物组合物的检测方法，其中所述液相色谱检测条件中磷酸溶液浓度为0.05％-0.5％，优选为0.1％。

本发明提供的药物组合物的检测方法，其中所述液相色谱检测条件中，柱温为25℃-40℃，优选为35℃；流速为0.8ml/min-1.2ml/min，优选为1.0ml/min。

本发明提供的药物组合物的检测方法，其中所述供试品溶液的制备方法优选为，取适量药物组合物，用含醇溶液溶解，提取，过滤，即得；其中所述含醇溶液为含有20-80％的甲醇或乙醇的溶液；更优选为50％乙醇溶液；所述提取方法优选为超声提取。

本发明提供的药物组合物的检测方法，其中所述供试品溶液的制备方法优选为，取装量差异下的本品内容物，混匀，研细，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％乙醇20ml，称定重量，超声处理，放冷，再称定重量，用50％乙醇补足减失的重量，离心，滤过，取续滤液，即得。

上述对照品溶液的制备方法优选含有如下步骤：取甘草苷、甘草酸、桔梗皂苷D、哈巴俄苷、肉桂酸、麦冬皂苷Ra对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含甘草酸60μg；甘草苷、哈巴俄苷、肉桂酸各20μg；桔梗皂苷D、麦冬皂苷Ra各5μg的混合溶液，即得(甘草酸重量＝甘草酸铵重量/1.0207)。

上述药物组合物中活性成分优选为含有玄参提取物、麦冬提取物、甘草提取物和桔梗提取物的组合物，更优选为玄麦甘桔胶囊。

本发明所使用的色谱柱为常规的以十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱，如

C18(2)5um 250×4.6mm、SHI MaDzu VP-ODS(250×4.6mm,5μm)、Agilent HC-C18(2)(250×4.6mm,5μm)、Phenomenex Luna C18(250×4.6mm,5μm)、Phenomenex LunaC18(250×4.6mm,5μm)等,以规格250×4.6mm,5μm效果更优。

本发明通过考察二极管阵列检测器(DAD检测器检测)检测含有玄参提取物、麦冬玄参提取物、甘草玄参提取物和桔梗提取物的药物组合物(如玄麦甘桔胶囊内容物)时，获知甘草苷在276nm左右附近均出现吸收峰值，且基线漂移小，但桔梗皂苷D、麦冬皂苷Ra在该处波长276nm下没有吸收，因此无法检测出这2个成分。而麦冬皂苷Ra、桔梗皂苷D为皂苷类成分，在210nm处有吸收，且甘草酸、肉桂酸、哈巴俄苷在波长为210nm左右也有吸收，致使哈巴俄苷与桔梗皂苷D、甘草酸与麦冬皂苷Ra的保留时间过于接近，分离度太小，无法进行有效分离与定量分析。本发明申请人经过大量摸索试验，发现在特定洗脱条件下，梯度洗脱6-16分钟内任意时间点将检测波长由276nm切换至210nm时，不但能同时检测玄麦甘桔胶囊6个指标成分，而且其杂质峰对目标峰的干扰较小，分离度良好，出峰结果稳定，尤其是在梯度洗脱第8分钟将波长276nm切换至210nm时，检测效果最佳。

本发明申请人考察了柱温对含有玄参提取物、麦冬提取物、甘草提取物和桔梗提取物的药物组合物(如玄麦甘桔胶囊内容物)检测效果的影响，包括25℃、30℃、35℃、40℃等不同温度，结果显示30℃、35℃均能达到较好的分离效果，35℃的分离效果最佳。

本发明申请人考察流速对药物组合物(如玄麦甘桔胶囊内容物)检测效果的影响，包括0.8ml/min、1.0ml/min、1.2ml/min等不同流速，结果显示，各目标物质峰均能达到较好的分离效果，其中流速为1.0ml/min的分离效果最优。

本发明药物组合物在制备成供试品溶液时，其提取方式可以采用常规提取方法如：超声、回流、振摇等提取方式，其中超声提取效果更优。针对提取液考察发现含醇溶液如甲醇、20％甲醇、80％甲醇、50％甲醇、乙醇、20％乙醇、80％乙醇、50％乙醇溶液用以提取药物组合物(如玄麦甘桔胶囊内容物)，都能达到提取效果，其中50％乙醇溶液提取的效果更好。

本发明申请人还进一步考察了当药物组合物为0.5g时，提取溶剂量对提取所述药物组合物(如玄麦甘桔胶囊内容物)的影响，当利用10ml、20ml、25ml、50ml、100ml的50％乙醇溶液时，结果显示，上述提取溶剂量均能实现提取目的，其中提取溶剂用量为20-100ml时[即所述药物组合物与含醇溶液的质量体积比(g/ml)为0.5:20-100]提取效果更优；当提取溶剂用量为20ml[即所述药物组合物与含醇溶液的质量体积比(g/ml)为0.5:20提取效果最好。

本发明更进一步提供一种药物组合物的检测方法，其包含以下步骤：

1)供试品溶液的制备：取玄麦甘桔胶囊内容物，研细，称取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％乙醇20ml，称定重量，超声处理，放冷，再称定重量，用50％乙醇补足减失的重量，离心，滤过，取续滤液，即得；

2)对照品溶液的制备：取甘草苷、甘草酸、桔梗皂苷D、哈巴俄苷、肉桂酸、麦冬皂苷Ra对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含甘草酸60μg；甘草苷、哈巴俄苷、肉桂酸各20μg；桔梗皂苷D、麦冬皂苷Ra各5μg的混合溶液，即得(甘草酸重量＝甘草酸铵重量/1.0207)。

3)含量检测：取对照品和供试品溶液各10μl注入液相色谱柱，进行检测，其中，色谱条件为：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，规格为250×4.6mm,5μm；流动相A为0.1％磷酸，流动相B为乙腈，按照下列梯度洗脱及检测波长切换条件进行检测：

本发明所提供的药物组合物检测方法，能够检测出药物组合物中的6种主要成分哈巴俄苷、肉桂酸、桔梗皂苷D、甘草苷、甘草酸、麦冬皂苷Ra，并对其进行定量。与现有技术相比具有以下显著优势：

1、能针对含有玄参提取物、麦冬提取物、甘草提取物或桔梗提取物中的一种或多种提取物的混合物中在同一色谱条件下的烯醚萜类、苯丙素类、黄酮类、皂苷类化合物6个成分进行准确的定性和定量，有效克服了现有检测方法无法同时检测玄麦甘桔成方制剂哈巴俄苷、肉桂酸、甘草苷、甘草酸、桔梗皂苷D、麦冬皂苷Ra等6种主要成分，无法涵盖玄麦甘桔成方制剂中各味药材有效成分的技术难题，能较全面真实反映药物组合物的内在质量特征，有利于从整体上评价药物组合物的质量，确保其临床疗效；

2、检测时间合理，目标物质峰出峰时间短，大大提高了样品的检测效率；

3、各目标成分分离度好，基线波动小，背景干扰小，能够准确检测供试样品中的成分；

4、通过对该药物组合物检测方法重复性、回收率、线性等因素考察，结果显示该检测方法稳定性高，重复性好，线性好，回收率高。

附图说明

图1对比例1中供试品玄麦甘桔胶囊的高效液相色谱图；

图2对比例2供试品玄麦甘桔颗粒的高效液相色谱图；

图3对比例3供试品玄麦甘桔颗粒的高效液相色谱图；

图4对比例4供试品玄麦甘桔颗粒的高效液相色谱图；

图5对比例5供试品玄麦甘桔颗粒的高效液相色谱图；

图6对比例6供试品玄麦甘桔颗粒的高效液相色谱图；

图7试验四混合对照品、样品、缺药材阴性对照品的高效液相色谱图

图8实施例1供试品的高效液相色谱图；

图9实施例2供试品的高效液相色谱图；

图10实施例3供试品的高效液相色谱图；

图11实施例4供试品的高效液相色谱图；

图12实施例5供试品的高效液相色谱图；

图13实施例6供试品的高效液相色谱图；

图中所述1为甘草苷，2为哈巴俄苷，3为桔梗皂苷D，4为肉桂酸，5为甘草酸，6为麦冬皂苷Ra；

具体实施方式

本发明通过以下实施例对本发明的内容作进一步的详细说明，该说明并不能用于限制本发明的保护范围。

本发明采用的试剂皆为普通市售品，皆可于市场购得。其中，高效液相色谱仪，(Agilent1100、Agilent 1200，美国安捷伦公司)；

Agilent Chemstation化学工作站；

十万分之一电子天平(BP-211D，德国赛多利斯sartorius)；

超声波清洗器(KQ250DE，昆山市仪器有限公司)；

超纯水机(UPHW-Ⅱ-90T，四川优普超纯水科技有限公司)；

乙腈，色谱级，美国Fisher公司；超纯水

磷酸等试剂为分析纯，成都科龙化学试剂有限公司；

对照品：甘草苷，供含量测定用，93.1％，批号111610-201607；哈巴俄苷，供含量测定用，96.0％，批号111730-201508；肉桂酸，供含量测定用，98.8％，批号110786-201604；甘草酸铵，供含量测定用，93.0％，批号110731-201609；桔梗皂苷D，供含量测定用，批号111851-201607，麦冬皂苷Ra，供含量测定用，99.8％，批号PS000662，上述对照品甘草苷、哈巴俄苷、肉桂酸、甘草酸、桔梗皂苷D铵均购自于中国食品药品检定研究院；麦冬皂苷Ra购于成都普思生物科技股份有限公司。

样品：玄麦甘桔胶囊由成都康弘制药有限公司和四川济生堂药业有限公司提供，其中玄麦甘桔胶囊批号(150501、150801、151101、160101、160301、160901、161201、170901、170902、170903)，玄参提取物1、2购于陕西昌岳植化技术有限公司，麦冬提取物1、2购于陕西浩洋生物科技有限公司，甘草提取物1、2购于陕西中鑫生物技术有限公司，桔梗提取物1、2购于陕西西安冠宇生物科技有限公司。

分离度(R)检测方法：

分离度(R)为相邻两峰的保留时间之差与平均峰宽的比值。也叫分辨率，表示相邻两峰的分离程度。R越大，表明相邻两组分分离越好。一般说当R<1时，两峰有部分重叠；当R＝1.0时，分离度可达98％；当R＝1.5时，分离度可达99.7％。通常用R＝1.5作为相邻两组分已完全分离的标志。当R＝1时，称为4σ分离，两峰基本分离，裸露峰面积为95.4％，内侧峰基重叠约2％。R＝1.5时，称为6σ分离，裸露峰面积为99.7％。R≥1.5称为完全分离。根据《中国药典》规定，R应大于1.5。

分离度(R)计算公式如下：

R＝2(tR2-tR1)/(W1+W2)

tR2:相邻两峰中后一峰的保留时间；

tR1:相邻两峰中前一峰的保留时间；

W1、W2:此相邻两峰的峰宽

基线漂移值检测方法：

参照王成宇主编《最新色谱分析检测方法及应用技术实用手册》，取30分钟基线,从低电平点P作水平线，从高电平点Q作垂直线，相交得到交点O，基线漂移值为D＝OQ/OP，单位为mV。D值越小，检测基线越平稳，含量检测难度越低，准确性更高，D值越大，检测基线波动越大，背景干扰越大，目标峰保留时间重现性越差，含量检测难度越高，准确性更低。

对比例1

色谱条件：色谱柱为GraceSmart-RP18柱(250mm×4.6mm，5μm)，乙腈-2％醋酸溶液二元梯度洗脱；0-20min，乙腈(％)：28→39，2％醋酸溶液(％)：72→61；流速为1.0ml/min，检测波长278nm，柱温为室温；

1)供试品溶液制备：取装量差异下的本品内容物，混匀，研细，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％乙醇20ml，称定重量，超声处理，放冷，再称定重量，用50％乙醇补足减失的重量，离心，滤过，取续滤液，即得；

2)对照品溶液制备：取甘草苷、甘草酸、桔梗皂苷D、哈巴俄苷、肉桂酸、麦冬皂苷Ra对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含甘草酸60μg；甘草苷、哈巴俄苷、肉桂酸20μg；桔梗皂苷D、麦冬皂苷Ra5μg的混合溶液，即得(甘草酸重量＝甘草酸铵重量/1.0207)。

按照上述方法进行高效液相色谱检测，精密吸取对照品溶液和供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定，即得，结果如图1所示。

根据图1结果可知，无法检测出桔梗皂苷D和麦冬皂苷Ra，甘草苷、哈巴俄苷的分离度为1.23、1.35，小于1.5，达不到分离要求，且整个检测基线波动大，背景干扰强，各指标成分目标峰保留时间重现性差，各指标成分定量分析的准确性差，达不到检测效果要求。

对比例2

色谱条件：AgilentC18(250mm×4.6mm，5μm，Agilent公司)；柱温：室温；流动相：甲醇0.2mol/L-醋酸铵溶液-冰醋酸(65：35：1)；流速1mL/min；检测波长：250nm。进样量20μl。

供试品溶液和对照品溶液制备如对比例1。

按照上述方法进行高效液相色谱检测，结果如图2所示。

根据图2结果可知，检测不出桔梗皂苷D和麦冬皂苷Ra，且甘草苷、哈巴俄苷、肉桂酸与相邻杂质峰未完全分离，分离度明显小于1.5，达不到分离要求。甘草酸峰有拖尾现象，干扰较大。

对比例3

色谱条件：色谱柱LiChrospher C₁₈(250nm×4.6nm,5μm)；乙腈-1.2％甲酸溶液梯度洗脱：0-20min(20:80-32:68)；流速为1ml/min；进样体积为5μL；柱温：30℃，检测波长：254nm，理论板数按甘草酸色谱峰计算，应不少于3000；

供试品溶液和对照品溶液制备如对比例1。

按照上述方法进行高效液相色谱检测，结果如图3所示。

根据图3结果可知，未检测出目标成分甘草酸、桔梗皂苷D和麦冬皂苷Ra，且整个检测基线波动大，背景干扰强，各指标成分目标峰保留时间重现性差，各指标成分定量分析的准确性差，达不到检测效果要求。

对比例4

色谱条件：色谱柱LiChrospher RP-C₁₈(250mm×4.6mm,5μm)；流动相：乙腈-水(含1％甲酸)，梯度洗脱(0-20min，流动相比例20：80-50：50)；流速为1mL/min；进样量10μL；柱温：25℃；检测波长：278nm(0-18min，测定甘草苷、哈巴俄苷及肉桂酸)，254nm(18-20min，测定甘草酸)。

供试品溶液和对照品溶液制备如对比例1。

按照上述方法进行高效液相色谱检测，结果如图4所示。

根据图4结果可知，无法检测出桔梗皂苷D和麦冬皂苷Ra，且甘草苷与相邻杂质峰未完全分离，分离度明显小于1.5，达不到分离要求，且整个检测基线波动大，背景干扰强，各指标成分目标峰保留时间重现性差，各指标成分定量分析的准确性差，达不到检测效果要求。

对比例5

色谱条件：色谱柱为WatersC₁₈(150mm×4.6mm，5μm)，流动相为乙腈-水(35：65)，流速为1.0mL/min，检测波长为208nm，柱温为室温。

供试品溶液制备和对照品溶液制备如对比例1。

按照上述方法进行高效液相色谱检测，结果如图5所示。

根据图5结果可知，检测不出肉桂酸和桔梗皂苷D，甘草苷和哈巴俄苷与相邻杂峰的分离度小于1.5，达不到分离要求，且整个检测基线波动较大，背景干扰较大，各指标成分定量分析的准确性较差。

对比例6

供试品溶液和对照品溶液制备：同对比例1。

色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.05％磷酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为237nm。理论板数按甘草苷峰计算应不低于5000。

按照上述方法进行高效液相色谱检测，结果如图6所示。

根据图6结果可知，无法检测出桔梗皂苷D和麦冬皂苷Ra，肉桂酸、甘草酸与相邻杂峰的分离度小于1.5，达不到分离要求，且整个检测基线波动较大，背景干扰较大，影响目标指标成分含量测定的准确性。

为了能更全面、更有效的进行含有玄麦甘桔药物组合物的质量控制，建立一个快速、简便、准确可靠的分析方法，以用于含有含有玄参提取物、麦冬提取物、甘草提取物和桔梗提取物的组合物中多种指标成分的同时定性和定量分析。本发明通过对检测条件进行了大量摸索实验研究，其摸索实验及考察结果如下：

实验一：不同洗脱条件、检测波长的液相色谱条件对检测结果的影响

供试品溶液制备：取玄麦甘桔胶囊内容物，混匀，研细，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％乙醇(含水的甲醇乙醇溶液,20％～80％范围)20ml，称定重量，超声处理，放冷，再称定重量，用50％乙醇补足减失的重量，离心，滤过，取续滤液，即得；

对照品溶液制备：取甘草苷、甘草酸、桔梗皂苷D、哈巴俄苷、肉桂酸、麦冬皂苷Ra对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含甘草酸60μg；甘草苷、哈巴俄苷、肉桂酸20μg；桔梗皂苷D、麦冬皂苷Ra5μg的混合溶液，即得(甘草酸重量＝甘草酸铵重量/1.0207)。

含量检测：取对照品溶液和供试品溶液各10μl注入液相色谱仪进行检测。其中，色谱条件：色谱柱为Agient HC-C₁₈(250×4.6mm,5μm)；以0.1％磷酸为流动相A，乙腈为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；柱温35℃，流速为1ml/min。取混合提取物样品溶液进样检测，对不同梯度洗脱及检测波长的液相色谱条件进行考察，结果见表1：

表1不同梯度洗脱及检测波长切换条件的液相色谱条件对检测结果的影响

实验二：不同的酸性体系对检测结果的影响。

供试品溶液和对照品溶液制备：同实验一。

含量测定：分别吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl注入液相色谱仪进行测定。色谱条件以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，流动相B为不同酸性体系，按下列梯度洗脱及检测波长切换条件进行检测；柱温35℃，流速为1.0ml/min。

取混合提取物样品溶液进样检测，对不同酸性体系进行考察，结果见表2：

表2不同酸对检测结果的影响

实验三：磷酸溶液浓度对检测结果的影响

供试品溶液和对照品溶液制备：同实验一。

含量测定：分别吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl注入液相色谱仪进行检测。其中，色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以下表3不同浓度的磷酸为流动相B，按下列梯度洗脱及检测波长切换条件进行检测；柱温35℃，流速为1.0ml/min。

取混合提取物样品溶液进样检测，对磷酸酸的不同浓度进行考察，结果见表3：

表3不同磷酸浓度对检测结果的影响

结果显示，流动相B为水时甘草酸出现严重拖尾，达不到检测要求的效果,当为0.05％磷酸至0.5％磷酸时，6个指标成分的分离度均大于1.5，且基线漂移值D均小于5mAU/30min均能达到检测效果。当磷酸浓度为0.1％时，其基线移值D最低，检测基线最为平稳，背景干扰最小，目标峰保留时间重现性最佳，各指标成分的含量检测难度最低，准确性最高。

试验四：验证实验

对本发明所提供的药物组合物检测方法进行了以下方法学实验验证。以下方法学验证中相对标准偏差(RSD)表示分析测试结果的精密度，其计算公式为：RSD％＝标准偏差(SD)/计算结果的算术平均值(X)该值通常用来表示分析测试结果的精密度，其中标准偏差(SD):

供试品溶液和对照品溶液制备：同实验1。

含量检测：取对照品溶液和供试品溶液各10μl注入液相色谱仪进行检测，其检测条件如下：色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填料；流动相A为0.1％磷酸，流动相B为乙腈，按照如下梯度洗脱条件及检测波长切换条件进行检测：

线性关系：

取甘草苷、甘草酸、哈巴俄苷、桔梗皂苷D、肉桂酸、麦冬皂苷Ra混合对照品溶液(甘草苷浓度0.53mg/ml、甘草酸浓度0.95mg/ml、哈巴俄苷0.51mg/ml、桔梗皂苷D浓度0.12mg/ml、肉桂酸浓度为0.84mg/ml、麦冬皂苷Ra浓度为0.10mg/ml，精密量取0.1ml、1ml、2.5ml、5ml、10ml到10ml容量瓶中，加甲醇稀释到刻度，摇匀。按上述色谱条件，分别吸取10μl注入液相色谱仪，测定峰面积。以甘草苷、甘草酸、哈巴俄苷、桔梗皂苷D、肉桂酸、麦冬皂苷Ra的进样量(μg)为横坐标，分别以峰面积(A)为纵坐标，进行线性回归，分别得甘草苷、甘草酸、哈巴俄苷、桔梗皂苷D、肉桂酸、麦冬皂苷Ra的标准曲线。结果表明，各成分在相应浓度范围呈良好线性关系，线性范围、回归方程、相关系数参见表4。

表4线性关系及相关系数表

重复性：

取同一批玄麦甘桔胶囊样品(批号：170901)，精密称定，按上述供试品溶液制备项下方法平行制备供试品溶液6份，按上述色谱条件，进样测定，记录色谱图，计算甘草苷、甘草酸、哈巴俄苷、桔梗皂苷D、肉桂酸、麦冬皂苷Ra含量的RSD分别为0.85％、1.12％、0.15％、1.30％、1.74％、0.92％，均小于2.0％，表明该方法重复性良好。

稳定性：

取本品(批号:170901)按供试品制备方法制备供试品溶液；分别置不同时间0、2、4、8、12、24h，进样10μl，注入液相色谱仪，分别测定供试品溶液的甘草苷、甘草酸、哈巴俄苷、桔梗皂苷D、肉桂酸、麦冬皂苷Ra的峰面积。计算RSD。甘草苷、哈巴俄苷、桔梗皂苷D、肉桂酸、甘草酸、麦冬皂苷Ra含量的RSD分别为1.38％、1.02％、0.97％、1.57％、1.13％、1.68％，均小于2.0％，表明该方法稳定性良好。

加样回收率:

取已知含量的玄麦甘桔胶囊样品(批号为170901,每粒装0.35g)，共6份，每份约0.25g,精密称定，置具塞锥形瓶中，分别加入甘草苷、甘草酸、哈巴俄苷、桔梗皂苷D、肉桂酸、麦冬皂苷Ra对照品适量，按上述供试品溶液制备方法，制备加样回收供试品溶液，按上述色谱条件，进样测定，记录色谱图，计算甘草苷、甘草酸、哈巴俄苷、桔梗皂苷D、肉桂酸、麦冬皂苷Ra的加样回收率，结果见表5。

表5回收率测定(n＝6)

以上表看出，样品各个成分的加样回收率在95.0％-105.0％之间，RSD％均小于3.0％，试验结果表明加样回收率良好。

专属性：

取已知含量的玄麦甘桔胶囊样品(批号为170901)和缺玄参、麦冬、甘草和桔梗药材的阴性样品各0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，按上述混合对照品溶液制备方法制成混合对照品溶液，按上述供试品溶液制备方法制成分别样品溶液和缺玄参、麦冬、甘草或桔梗阴性样品溶液。吸取混合对照品溶液、供试样品溶液、缺药材阴性样品溶液各10μl注入液相色谱仪，结果见图7及表6。

表6缺药材阴性对照品及检测结果

试验结果表明：从混合对照品溶液、供试样品溶液以及缺药材阴性样品的色谱图对比可得，缺玄参、麦冬、甘草或桔梗的样品及辅料无干扰，专属性强。

实施例1：

玄参提取物、麦冬提取物、甘草提取物、桔梗提取物按照下列常规提取工艺制备：

玄参提取物：取玄参药材，加水煎煮3次，每次1小时，合并煎液，滤过，静置12小时，浓缩置密度为1.10(65～80℃)的清膏，干燥得浸膏粉，即得玄参提取物。

麦冬提取物：取麦冬药材，加水煎煮3次，每次1小时，合并煎液，滤过，静置12小时，浓缩置密度为1.10(65～80℃)的清膏，干燥得浸膏粉，即得麦冬提取物。

甘草提取物：取甘草药材，加水煎煮3次，每次1小时，合并煎液，滤过，静置12小时，浓缩置密度为1.10(65～80℃)的清膏，干燥得浸膏粉，即得甘草提取物。

桔梗提取物：取桔梗药材，加水煎煮3次，每次1小时，合并煎液，滤过，静置12小时，浓缩置密度为1.10(65～80℃)的清膏，干燥得浸膏粉，即得桔梗提取物。

混合物：取玄参提取物、麦冬提取物、甘草提取物和桔梗提取物刺和适量辅料，按需要的比例混合均匀，即得；

供试品溶液制备：取混合物，研细，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％乙醇20ml，称定重量，超声处理，放冷，再称定重量，用50％乙醇补足减失的重量，离心，滤过，取续滤液，即得；

对照品溶液制备：取甘草苷、甘草酸、桔梗皂苷D、哈巴俄苷、肉桂酸、麦冬皂苷Ra对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含甘草酸60μg；甘草苷、哈巴俄苷、肉桂酸各20μg；桔梗皂苷D、麦冬皂苷Ra各5μg的混合溶液，即得(甘草酸重量＝甘草酸铵重量/1.0207)。

含量检测：取对照品溶液和供试品溶液各10μl注入液相色谱仪进行检测，其检测条件如下：色谱柱十八烷基硅烷键合硅胶为填料；流动相A为0.1％磷酸，流动相B为乙腈，按照下列梯度洗脱及检测波长切换条件进行检测；

按照上述方法进行高效液相色谱检测，结果如图8，该组合物6个指标成分的色谱峰保留时间适中，分离度均大于1.5，基线漂移值D为4.0mAU/30min，达到检测效果。

实施例2

供试品溶液制备与对照品溶液制备同实施例1；

含量检测：取对照品溶液和供试品溶液各10μl注入液相色谱仪进行检测，其检测条件如下：以0.05％磷酸为流动相B，其余检测条件同实施例1；

按照上述方法进行高效液相色谱检测，结果如图9所示。根据图9所示，6个指标成分保留时间适中，分离度均大于1.5，基线漂移值D为5.0mAU/30min，达到检测效果。

实施例3

供试品溶液制备与对照品溶液制备同实施例2；

含量检测：取对照品溶液和供试品溶液各10μl注入液相色谱仪进行检测，其检测条件如下：以0.2％磷酸为流动相B，其余检测条件同实施例1。

按照上述方法进行高效液相色谱检测，结果如图10所示。根据图10所示，6个指标成分保留时间适中，分离度均大于1.5，且基线漂移值D为4.8mAU/30min，达到检测效果。

实施例4

供试品溶液制备与对照品溶液制备同实施例2；

含量检测：取对照品溶液和供试品溶液各10μl注入液相色谱仪进行检测，其检测条件如下：以0.5％磷酸为流动相B，其余检测条件同实施例1。

按照上述方法进行高效液相色谱检测，结果如图11所示。根据图11所示，6个指标成分保留时间适中，分离度均大于1.5，基线漂移值D为4.9mAU/30min，达到检测效果。

实施例5

供试品溶液制备与对照品溶液制备同实施例2；

含量检测：取对照品溶液和供试品溶液各10μl注入液相色谱仪进行检测，其检测条件中的检测波长切换条件如下：

其余检测条件同实施例1。

按照上述方法进行高效液相色谱检测，结果如图12所示。根据图12所示，6个指标成分保留时间适中，分离度均大于1.5，达到检测效果，但基线漂移值D为15.3mAU/30min，其中甘草苷基线漂移较大，背景干扰较强。

实施例6

供试品溶液制备与对照品溶液制备同实施例2；

含量检测：取对照品溶液和供试品溶液各10μl注入液相色谱仪进行检测，其检测条件中的检测波长切换条件如下：

其余检测条件同实施例1。

按照上述方法进行高效液相色谱检测，结果如图13所示。

根据图13所示，6个指标成分保留时间适中，分离度均大于1.5，达到检测效果，但基线漂移值D为5.2mAU/30min，哈巴俄苷和桔梗皂苷D基线存在漂移，背景存在一定干扰。

实施例7

取10批玄麦甘桔胶囊样品(150501、150801、151101、160101、160301、160901、161201、170901、170902、170903)。取市售玄参提取物、麦冬提取物、甘草提取物和桔梗提取物各2批次，按照实施例1进行样品测定，测定含量结果如下表7及表8：

表7多个批次样品成分含量测定结果

表8市售玄参、麦冬、甘草及桔梗提取物成分含量测定结果

以上表看出，本发明检测方法可在30min内对含有玄参提取物、麦冬提取物、甘草提取物以及桔梗提取物中的一种或多种的药物组合物中的甘草苷、甘草酸、哈巴俄苷、桔梗皂苷D、肉桂酸、麦冬皂苷Ra等6种指标成分进行定性和定量，各目标成分色谱峰分离好，重现性好，基线平稳，背景无明显干扰。

Claims (14)

1.一种药物组合物的检测方法，其特征在于取适量药物组合物制成供试品溶液，利用液相色谱法对其进行检测，所述液相色谱检测条件为：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶为填料；流动相A为磷酸溶液，流动相B为乙腈，采用梯度洗脱及检测波长切换进行检测；所述药物组合物为 含有玄参提取物、麦冬提取物、甘草提取物和桔梗提取物的药物组合物;所述药物组合物的主要成分为甘草苷、甘草酸、桔梗皂苷D、哈巴俄苷、肉桂酸、麦冬皂苷Ra；所述液相色谱检测条件中的梯度洗脱条件为：

，

所述检测波长为276nm和210nm，切换条件为在梯度洗脱6-16分钟内的任意时间点，将检测波长276nm切换至210nm。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述检测波长切换条件优选为在梯度洗脱第8分钟时，将检测波长276nm切换至210nm。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述液相色谱检测条件中磷酸溶液浓度为0.05％-0.5％；柱温为25℃ -40℃；流速为0.8ml/min-1.2ml/min。

4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述液相色谱检测条件中磷酸溶液浓度为0 .1％。

5.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，柱温为35℃。

6.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，流速为1.0ml/min。

7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述色谱柱规格优选为250× 4.6mm,5μm。

8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述供试品溶液的制备方法包括以下步骤：取适量药物组合物，用含醇溶液溶解，提取，过滤，即得，所述含醇溶液为含有20-80％的甲醇或乙醇的溶液，所述提取方法为超声提取。

9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述含醇溶液为含有50％的乙醇的溶液。

10.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述药物组合物与含醇溶液的质量体积为0.5:20-100。

11.根据权利要求10所述的检测方法，其特征在于，所述药物组合物与含醇溶液的质量体积为0.5:20。

12.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述药物组合物优活性成分为玄麦甘桔胶囊。

13.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述供试品溶液的制备方法如下：取玄麦甘桔胶囊内容物，研细，称取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％乙醇20ml，称定重量，超声处理，放冷，再称定重量，用50％乙醇补足减失的重量，离心，滤过，取续滤液，即得。

14.根据权利要求1-13中任一项所述的检测方法，其特征在于包含以下步骤：

1)供试品溶液的制备：取玄麦甘桔胶囊内容物，研细，称取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％乙醇20ml，称定重量，超声处理，放冷，再称定重量，用50％乙醇补足减失的重量，离心，滤过，取续滤液，即得；

2)对照品溶液的制备：取甘草苷、甘草酸、桔梗皂苷D、哈巴俄苷、肉桂酸、麦冬皂苷Ra对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含甘草酸60μg；甘草苷、哈巴俄苷、肉桂酸各20μg；桔梗皂苷D、麦冬皂苷Ra各5μg的混合溶液，即得；

3)含量检测：取对照品和供试品溶液各10μl注入液相色谱柱，进行检测，其中，色谱条件为：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料,规格为250×4.6mm,5μm；流动相A为0.1％磷酸，流动相B为乙腈，按照如下梯度洗脱及检测波长切换条件进行检测：

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