CN111912919B - 一种基于水提工艺的咽康含片的质量测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于中药质量评价技术领域，公开了一种基于水提工艺的咽康含片的质量测定方法，包括：采用甲醇回流提取4小时；分别进行供试品溶液的制备和混合对照品溶液的制备；色谱条件选择；以230nm作为咽康含片成分含量测定检测波长并同时作为指纹图谱的检测波长；方法学考察：指纹图谱稳定性试验、指纹图谱精密度试验、指纹图谱重复性试验。本发明采用HPLC梯度洗脱法建立含片的指纹图，建立HPLC同时测定咽康含片中4种成分的方法，提高了咽康含片的质量可控性，增强产品的市场竞争力，为咽康含片的质量控制与综合评价提供科学的参考依据；在工业生产中可以此为参考建立经济、高效并且适合生产过程的指纹图谱质量控制方案。

Description

一种基于水提工艺的咽康含片的质量测定方法

技术领域

本发明属于中药质量评价技术领域，尤其涉及一种基于水提工艺的咽康含片的质量测定方法。

背景技术

咽康含片，由冬凌草、玄参、甘草、麦冬、薄荷脑等多味药材加工而成的复方制剂，具有清热解毒，养阴利咽之功效，临床用于急慢性咽喉炎治疗。咽康含片现行质量标准(WS-10001-(HD-1136)-2002)的含量测定项目只对薄荷脑进行定量控制，难以全面反映制剂的化学成分特征。经检索，未见有关咽康含片定量控制的文献报道。

同时，咽康含片的质量标准也存在问题，现有质量控制标准较为简单，仅局限于二项性状鉴别和对薄荷脑的含量测定，其测定方法的专属性较差，缺乏对制剂主药的定性定量控制，难以全面评价制剂的内在质量，已无法满足中药现代化的发展需要。

通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：

(1)现有技术中关于咽康含片中主药定量控制的方法尚未见报道。

(2)现有咽康含片的质量控制标准较为简单，仅局限于二项性状鉴别和对薄荷脑的含量测定，其测定方法的专属性较差，缺乏对制剂主药的定性定量控制，难以全面评价制剂的内在质量，已无法满足中药现代化的发展需要。

解决以上问题及缺陷的难度为：现有技术无法针对主药冬凌草进行测定,难以知道咽康含片中有效成分冬凌草甲素的含量。

解决以上问题及缺陷的意义为：本发明不仅能准确地测定咽康含片中有效成分冬凌草甲素的含量,还能以指纹图谱确保咽康含片的专属性,以防假冒。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种基于水提工艺的咽康含片的质量测定方法。

本发明是这样实现的，一种基于水提工艺的咽康含片的质量测定方法，所述基于水提工艺的咽康含片的质量测定方法包括：

步骤一，提取方法选择：经试验比较，采用甲醇回流提取4小时。

步骤二，分别进行供试品溶液的制备和混合对照品溶液的制备。

步骤三，色谱条件选择：采用HPLC对咽康含片指纹图谱和多指标成分含量测定进行质量评价。

步骤四，含量测定检测波长和指纹图谱检测波长的选择：以230nm作为咽康含片成分含量测定检测波长并同时作为指纹图谱的检测波长。

步骤五，方法学考察：指纹图谱稳定性试验、指纹图谱精密度试验、指纹图谱重复性试验。

进一步，步骤二中，所述供试品溶液的制备方法包括：

(I)取咽康含片粉末8g，精密称定，精密加入甲醇50ml，称定重量；

(II)加热回流提取4小时，放冷再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过；

(III)取续滤液25ml，浓缩至近干，残渣加甲醇溶解并定容至5ml，摇匀，用0.2μm滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液，即得。

进一步，步骤二中，所述混合对照品溶液的制备方法包括：

1)取甘草苷对照品5.33mg、甘草酸铵对照品9.90mg、哈巴俄苷对照品9.36mg和迷迭香酸对照品9.70mg，分别置于10ml容量瓶中，精密称定；

2)加甲醇溶解并稀释至刻度，得储备液1、储备液2、储备液3和储备液4；

3)分别精密吸取储备液1、2、3、4各1ml于5ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，得混合对照品标准溶液。

进一步，步骤三中，所述色谱条件选择包括：

采用HPLC对咽康含片指纹图谱和多指标成分含量测定进行质量评价，以5u C₁₈(250×4.6mm，5μm)为色谱柱，流动相为80％乙腈-0.05％磷酸，流速1mL·min^-1，梯度洗脱，柱温40℃，进样10μl。

进一步，步骤五中，所述方法学考察包括：

(1)指纹图谱稳定性试验

照供试品溶液制备方法制备供试品溶液，按0、2、4、6、8、24小时分别进样，测定各指标成分峰面积，结果供试品溶液在24小时内稳定。

(2)指纹图谱精密度试验

取同一供试品溶液10μl，连续进样6次，测定峰面积，结果6次进样峰面积平均值的RSD％在0.18～0.65之间，说明精密度良好。

(3)指纹图谱重复性试验

取同一批号(20130624)的咽康含片6份，每份8g，精密称定，照供试品溶液制备方法制备供试品溶液，分别测定个指标成分，计算各指标含量。RSD％在0.2～0.7之间，表明试验的重复性良好。

结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明提供的基于水提工艺的咽康含片的质量测定方法，按照《中药、天然药物研究技术指导原则》和《中药新药质量标准研究的技术要求》，建立了HPLC同时测定咽康含片中原来无法控制的冬凌草甲素、甘草苷、甘草酸铵、迷迭香酸4种成分的方法，进一步提高了咽康含片的质量可控性，增强产品的市场竞争力，为咽康含片的质量控制与综合评价提供科学的参考依据。

本发明采用HPLC梯度洗脱法建立含片的指纹图，对本品的质量控制提升起到推动作用，在工业生产中可以此为参考建立经济、高效并且适合生产过程的指纹图谱质量控制方案。

附图说明

图1是本发明实施例提供的基于水提工艺的咽康含片的质量测定方法流程图。

图2是本发明实施例提供的两种提取方法光谱图与其对照品光谱比较图；

图2中：A.索氏提取方法；B.回流提取方法；C.混合对照品；1.甘草苷；2.迷迭香酸；3.冬凌草甲素；4.甘草酸铵。

图3是本发明实施例提供的各定量成分色谱峰与混合对照品比较图；

图3中：A.混合对照品；B.咽康含片(215nm)；C.咽康含片(230nm)；1.甘草苷；2.迷迭香酸；3.冬凌草甲素；4.哈巴俄苷；5甘草酸铵。

图4是本发明实施例提供的缺冬凌草样品各定量成分色谱峰与其对照品比较示意图；

图4中：A.缺冬凌草样品(215nm)；B.缺冬凌草样品(230nm)；C.混合对照品；1.甘草苷；2.迷迭香酸；3.冬凌草甲素；4.哈巴俄苷；5.甘草酸铵。

图5是本发明实施例提供的缺甘草样品各定量成分色谱峰与其对照品比较示意图；

图5中：A.缺甘草样品(215nm)；B.缺甘草样品(230nm)；C.混合对照品；1.甘草苷；2.迷迭香酸；3.冬凌草甲素；4.哈巴俄苷；5.甘草酸铵。

图6是本发明实施例提供的缺玄参样品各定量成分色谱峰与其对照品比较示意图；

图6中：A.缺冬凌草样品(215nm)；B.缺冬凌草样品(230nm)；C.混合对照品；1.甘草苷；2.迷迭香酸；3.冬凌草甲素；4.哈巴俄苷；5.甘草酸铵。

图7是本发明实施例提供的指纹图谱稳定性考察(215nm)示意图。

图8是本发明实施例提供的指纹图谱定稳定性考察(230nm)示意图。

图9是本发明实施例提供的指纹图谱精密度试验(215nm)示意图。

图10是本发明实施例提供的指纹图谱精密度试验(230nm)示意图。

图11是本发明实施例提供的重复性试验(215nm)示意图。

图12是本发明实施例提供的重复性试验(230nm)示意图。

图13是本发明实施例提供的代表咽康含片样品的HPLC指纹图谱。

图14是本发明实施例提供的批咽康含片样品指纹图谱。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种基于水提工艺的咽康含片的质量测定方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。

如图1所示，本发明实施例提供的基于水提工艺的咽康含片的质量测定方法包括以下步骤：

S101，提取方法选择：经试验比较，采用甲醇回流提取4小时。

S102，分别进行供试品溶液的制备和混合对照品溶液的制备。

S103，色谱条件选择：采用HPLC对咽康含片指纹图谱和多指标成分含量测定进行质量评价。

S104，含量测定检测波长和指纹图谱检测波长的选择：以230nm作为咽康含片成分含量测定检测波长并同时作为指纹图谱的检测波长。

S105，方法学考察：指纹图谱稳定性试验、指纹图谱精密度试验、指纹图谱重复性试验。

下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步的描述。

一、咽康含片质控标准

咽康含片处方来源于中华人民共和国卫生部中成药地方标准上升国家标准部分(儿科口腔科肿瘤科分册)WS-11503(ZD-1503)-2002“咽康含片”，冬凌草、玄参、麦冬、桔梗、甘草、薄荷脑、冰片、艾纳香油。辅料为：香兰素、甜蜜素、柠檬酸、蔗糖。具有清热解毒，养阴利咽，用于肺经风热所致急慢性咽炎。

1、处方分析

按照现行《方剂学》教材的定义，君药是指针对主病或主证起主要治疗作用的药物。臣药有两种含义：①辅助君药加强治疗主病或主证作用的药物；②针对重要的兼病或兼证起主要治疗作用的药物。佐药有3种含义：①佐助药，即配合君、臣药以加强治疗作用，或直接治疗次要兼证的药物；②佐制药，即用以消除或减弱君、臣药的毒性，或能制约君、臣药峻烈之性的药物；③反佐药，即病重邪甚可能拒药时，配用与君药性味相反而又能在治疗中起治疗作用的药物，以防止药病格拒。使药有两种含义：①引经药，即能引领方中诸药至特定病所的药物；②调和药，即具有调和方中诸药作用的药物。处方中冬凌草味甘苦，性微寒，具有清热解毒、消炎止痛、健胃活血和抗肿瘤的功效为君药。玄参具有清热凉血，滋阴降火，解毒散结的作用，用于热入营血，温毒发斑，热病伤阴，舌绛烦渴，津伤便秘，骨蒸劳嗽，目赤，咽痛，白喉，瘰疬，痈肿疮毒等病症；臣药有三味是麦冬、玄参、桔梗，麦冬，其味甘、微苦，性微寒，归心、肺、胃经，有养阴生津，润肺清心的功效，用于肺燥干咳、虚痨咳嗽、津伤口渴、心烦失眠、内热消渴、肠燥便秘、咽白喉；桔梗，味苦、辛，性平，归肺经，有开宣肺气，祛痰排脓之功效，用于治疗外感咳嗽，咽喉肿痛，肺痈吐痰，胸满胁痛，痢疾腹痛等病。佐药兼顾使药的是甘草性味甘平，归心、肺、胃经。具补脾益气，润肺止咳，缓急止痛，缓和药性，清火解毒之功、薄荷脑，性凉味辛，归肺、肝经，广泛用于驱风、防腐、消炎，镇痛、止痒、健胃等、冰片，昧辛苦、微寒，归心、脾、肺经。有开窍醒神、通诸窍等作用。在许多中成药中常作为“药引”，以增加其它药物的治疗效果，即中医昕谓的“芳香走窜，引药上行”，“独行则势弱，佐使刚有功”；艾纳香油，辛、苦，微寒，清热解毒，消肿止痛。用于咽喉肿痛等。辅料为：香兰素、甜蜜素、柠檬酸、蔗糖。本方具有清热解毒，养阴利咽，用于肺经风热所致急慢性咽炎。

2、制备工艺研究

冬凌草粉碎成粗粉，加乙醇回流提取二次，第一次3小时，第二次1.5小时，合并乙醇液，回收乙醇并浓缩至相对密度为1.31～1.35(80℃)稠膏，备用；玄参、麦冬、桔梗、甘草加水煎煮二次，第一次3小时，第二次2小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.10～1.20(60℃)的清膏，加入上述稠膏及香兰素、甜蜜素、柠檬酸、淀粉、糊精、胭脂红、蔗糖，混匀，制成颗粒，75～85℃干燥，整粒，取薄荷脑、冰片、艾纳香油，加乙醇适量使溶解，喷入上述颗粒中，加入硬脂酸镁，混匀，压片，即得。本品为淡红色片；气清香，味甜、微苦。

3、含量测定

3.1照气相色谱法

《中国药典》2015年版四部0521项下测定，色谱条件与系统适用性试验以聚乙二醇(PEG)-20M为固定相，涂布浓度为10％；柱温为150℃。

3.2校正因子测定

理论板数按水杨酸甲酯峰计算应不低于2000(试验未设计该部分是否保留)；取水杨酸甲酯0.15ml，置250ml量瓶中，加氯仿至刻度，摇匀，作为内标溶液。另取薄荷脑对照品适量，加甲醇制成每1ml含4mg的溶液，作为对照品溶液。精密量取内标溶液2ml、对照品溶液0.2ml和水5ml，密塞，剧烈振摇1分钟，离心，取下层溶液2ul，注入气相色谱仪，计算校正因子。

1.3.4测定法

取重量差异项下的本品，研细，取1g，精密称定，置具塞离心管中，加水5ml，浸渍20分钟，精密加入内标溶液2ml，密塞，剧振摇2分钟，超声处理(功率250W，频率25kHz)10分钟，再强烈振摇1分钟，离心，取下层溶液2ul注入气相色谱仪，测定。

3.3含量测定结果

本品每片含薄荷脑(C₁₀H₂₀O)不得少于0.76mg。

咽康含片生产工艺中存在的问题，原生产工艺中君药冬凌草的醇提、臣药麦冬、玄参、桔梗的水提工艺，未明确提取分离过程中所需要精准参数，如溶媒的用量、加热搅拌方式、药材体积大小等等，更缺乏可靠的检验方法和指标对生产过程进行有效的控制。

咽康含片的质量标准存在的问题，现有质量控制标准较为简单仅局限于二项性状鉴别和对薄荷脑的含量测定，其测定方法的专属性较差，缺乏对制剂主药的定性定量控制，难以全面评价制剂的内在质量，已无法满足中药现代化的发展需要。为进一步提高咽康含片的质量可控性，增强产品的市场竞争力，本发明按照《中药、天然药物研究技术指导原则》和《中药新药质量标准研究的技术要求》，对醇提这一工艺进行优化。目前对咽康含片生产工艺的优化研究较少，未明确提取分离过程中所需要精准参数，如溶媒的用量、加热搅拌方式、药材体积大小等等，更缺乏可靠的检验方法和指标对生产过程进行有效的控制。

随着中药现代化的发展，为能真实有效的控制咽康含片的质量，一方面需要需要寻找合理的质量控制点和先进的质量控制方法，提升咽康含片的质量标准，从而有效控制咽康含片的质量；另一方面，要继续深入研究咽康含片的药理和药效，寻找其有效部位、有效组份或有效成分，研究咽康含片的指纹图谱，从而为咽康含片的二次开发奠定良好基础。

二、咽康含片指纹图谱的研究

咽康含片，由冬凌草、玄参、甘草、麦冬、薄荷脑等多味药材加工而成的复方制剂，具有清热解毒，养阴利咽之功效，临床用于急慢性咽喉炎治疗。咽康含片现行质量标准(WS-10001-(HD-1136)-2002)的含量测定项目只对薄荷脑进行定量控制，难以全面反映制剂的化学成分特征。经检索，未见有关咽康含片定量控制的文献报道，为进一步提高咽康含片的质量可控性，增强产品的市场竞争力，本发明按照《中药、天然药物研究技术指导原则》和《中药新药质量标准研究的技术要求》，建立了HPLC同时测定咽康含片中4种成分的方法，为咽康含片的质量控制与综合评价提供科学的参考依据。

1、材料与方法

1.1试药及仪器

甘草苷(Liquiritin，供含量测定用，批号：111610-201106，中国药品生物制品检定所)、甘草酸铵(Monoammonium Glycyrrhizinate，供含量测定用，批号：110731-201317，中国药品生物制品检定所)、冬凌草甲素对照品(Oridonin,供含量测定用，批号：171203-200303,中国药品生物制品检定所提供)、迷迭香酸(Rosmarinic acid，供含量测定用，批号：111871-201203，中国药品生物制品检定所)；试验用咽康含片成品16批，样品信息见表1。Prominenece HPLC超快速液相色谱系统(岛津公司，包括两台LC-20AD二元梯度泵、DGU-20A3真空脱气机、SIL-20AHT自动进样器、CTO-10ASvp柱温箱、SPD-20A紫外检测器、LC-Solution色谱工作站)；AE240十万分之一电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；超纯水机(四川沃特尔科技发展有限公司)。

表1样品信息

1.2供试品溶液制备方法考察

1.2.1提取方法的选择

试验比较了甲醇回流(4小时)和甲醇索氏提取(4小时)，回流提取优于索氏提取，故采用甲醇回流提取4小时。同时，试验还对回流提取时间(3小时、4小时)进行了考察，结果表明，提取4小时基本能将被测物质提取完全。具体见表2、图2。

表2不同提取方法含量测定结果比较

1.2.2供试品溶液制备方法

取本品约咽康含片粉末8g，精密称定，精密加入甲醇50ml，称定重量，加热回流提取4小时，放冷再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液25ml，浓缩至近干，残渣加甲醇溶解并定容至5ml，摇匀，用0.2μm滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液，即得。

1.2.3混合对照品溶液的制备

取甘草苷对照品约5.33mg、甘草酸铵对照品约9.90mg、冬凌草甲素对照品约9.36mg和迷迭香酸对照品约9.70mg，分别置于10ml容量瓶中，精密称定，加甲醇溶解并稀释至刻度，得储备液1、储备液2、储备液3和储备液4。分别精密吸取储备液1、2、3、4各1ml于5ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，得混合对照品标准溶液。

1.2.4色谱条件选择

试验主要采用HPLC对咽康含片指纹图谱和多指标成分含量测定进行研究，试验表明，以5u C₁₈(250×4.6mm，5μm)色谱柱，流动相为80％乙腈-0.05％磷酸，流速1mL·min^-1，梯度洗脱(梯度见表3)，柱温40℃，进样10μl。

表3梯度表

1.2.5含量测定检测波长和指纹图谱检测波长的选择

按拟定的色谱条件，分别吸取对照品溶液和供试品溶液进样，以SPD-20A检测器检测，结果在检测波长为230nm时，在供试品色谱中基本能兼顾各成分色谱峰的丰度、分离度和基线，因此选择230nm作为甘草苷等5种成分含量测定检测波长并同时作为指纹图谱的检测波长，各定量成分色谱峰与对照品色谱峰比较见图3。

1.2.5.1阴性对照指纹图谱

缺冬凌草、缺玄参、缺甘草阴性对照色谱图见图4～图6。

1.3方法学考察

1.3.1指纹图谱稳定性试验

照供试品溶液制备方法制备供试品溶液，按0、2、4、6、8、24小时分别进样，测定各指标成分峰面积，结果供试品溶液在24小时内稳定。结果见表4、图7～图8。

表4稳定性试验结果

1.3.2指纹图谱精密度试验

取同一供试品溶液10μl，连续进样6次，测定峰面积，结果6次进样峰面积平均值的RSD％在0.18～0.65之间，说明精密度良好。结果见表5、图9～图10。

表5精密度试验结果

1.3.3指纹图谱重复性试验

取同一批号(20130624)的咽康含片6份，每份8g，精密称定，照供试品溶液制备方法制备供试品溶液，分别测定个指标成分，计算各指标含量。RSD％在0.2～0.7之间，表明试验的重复性良好。结果见表6、图11～图12。

表6重复性试验结果

2、结果

2.1共有峰的选择及指纹峰归属

在当前色谱条件下，选择了11个样品中共有的色谱峰作为指纹图谱的共有峰，代表性指纹图谱参见图13。

2.2相似度计算

采用国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004年A版1.0版》对16批咽康含片进行相似度计算，S1为16批咽康含片指纹图谱生成的共有模式，从图14可看出指纹图谱相似度分析结果与表7的含量测定结果基本一致，说明咽康含片的化学组成一致性较好、质量比较稳定。

表7 16批咽康含片相似度比较结果

中药指纹图谱分析借用法医学“指纹鉴定”的概念，根据中药化学成分的复杂性或模糊性和有效成分的整体性，在现阶段还不可能将中药复杂化学成分搞清楚的情况下寻找同一药材群体化学成分的相似性，即物种群体内的唯一性来表现药材的内在质量。通过建立中药指纹图谱可以全面反映中药所含内在化学成分的种类和数量，进而反映中药的质量，因而是中药的一种新型的生产质量标准。它可以确保药品的一致性，疗效的安全性及可靠性，如中药材指纹图谱系指中药材经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示该中药材特性的共有特性的图谱。在对中药材化学成分、相关活性缺乏全面了解的情况下，采用指纹阁谱相似度分析法评价药材质量是一种行之有效的方法。可见指纹图谱是中药质量控制的有效、可行的方法，现已成为中成药产品质量提升的重要方法。为了提高中药的安全性和质量稳定性，除了应重视加强新技术、新工艺运用，指纹图谱己经成为一种国际公认的控制中药或天然药物质量的有效手段，中成药中主要成分指纹图谱研究，可提高对中药质量控制技术。

中药在我国的历史上源远流氏，其在临床治疗中显现出的独特疗效，已日益为现代人们所重视和关注，然而，长期以来，在其生产中很难形成独立的知识产权保护。缺乏能综合评判和衡量中药及其制剂内在品质的标准，尤其是缺乏可以量化的可控质量标准和特异性的鉴别指标是一个重要的原因。根据文献报道，欧美日本等发达发达国家已经对植物提取化合物有明确的标准。咽康含片现行含量测定项目只对薄荷脑进行定量控制，已经不能使用中药现代化的发展。因此，本发明采用HPLC梯度洗脱法建立含片的指纹图，对本品的质量控制提升起到推动作用。在工业生产中可以此为参考建立经济、高效并且适合生产过程的指纹图谱质量控制方案。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种基于水提工艺的咽康含片的质量测定方法，其特征在于，所述基于水提工艺的咽康含片的质量测定方法包括：

步骤一，供试品溶液的制备方法包括：取咽康含片粉末8g；加热回流提取4小时；取续滤液作为供试品溶液；

步骤二，进行混合对照品溶液的制备；

所述混合对照品包括：取甘草苷对照品、甘草酸铵对照品、哈巴俄苷对照品、迷迭香酸对照品和冬凌草甲素；

步骤三，采用HPLC对咽康含片指纹图谱和多指标成分含量测定进行质量评价；

步骤四，以230nm作为咽康含片成分含量测定检测波长并同时作为指纹图谱的检测波长；

步骤五，指纹图谱稳定性试验、指纹图谱精密度试验、指纹图谱重复性试验；

HPLC检测条件为：以C₁₈，250×4.6mm，5μm，色谱柱，流动相为80％乙腈-0.05％磷酸，流速1mL·min^-1，梯度洗脱程序见下表，柱温40℃，进样10μl；

梯度表

2.如权利要求1所述的基于水提工艺的咽康含片的质量测定方法，其特征在于，步骤二中，所述供试品溶液的制备方法包括：

(1)取咽康含片粉末8g，精密称定，精密加入甲醇50ml，称定重量；

(2)加热回流提取4小时，放冷再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过；

(3)取续滤液25ml，浓缩至近干，残渣加甲醇溶解并定容至5ml，摇匀，用0.2μm滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。

3.如权利要求1所述的基于水提工艺的咽康含片的质量测定方法，其特征在于，步骤二中，所述混合对照品溶液的制备方法包括：

1)取甘草苷对照品5.33mg、甘草酸铵对照品9.90mg、哈巴俄苷对照品9.36mg和迷迭香酸对照品9.70mg，分别置于10ml容量瓶中，精密称定；

2)加甲醇溶解并稀释至刻度，得储备液1、储备液2、储备液3和储备液4；

3)分别精密吸取储备液1、2、3、4各1ml于5ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，得混合对照品标准溶液。

4.如权利要求1所述的基于水提工艺的咽康含片的质量测定方法，其特征在于，步骤五中，方法学考察包括：

(1)指纹图谱稳定性试验

照供试品溶液制备方法制备供试品溶液，按0、2、4、6、8、24小时分别进样，测定各指标成分峰面积，结果供试品溶液在24小时内稳定；

(2)指纹图谱精密度试验

取同一供试品溶液10μl，连续进样6次，测定峰面积，结果6次进样峰面积平均值的RSD％在0.18～0.65之间，说明精密度良好；

(3)指纹图谱重复性试验

取同一批号的咽康含片6份，每份8g，精密称定，照供试品溶液制备方法制备供试品溶液，分别测定个指标成分，计算各指标含量；RSD％在0.2～0.7之间，表明试验的重复性良好。

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