CN110441441B - 一种狗脊与烫狗脊药材的uplc特征图谱构建方法及鉴别方法 - Google Patents

一种狗脊与烫狗脊药材的uplc特征图谱构建方法及鉴别方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种狗脊与烫狗脊药材的UPLC特征图谱构建方法及鉴别方法，所述的狗脊与烫狗脊药材的UPLC特征图谱构建方法包含如下步骤：（1）精密称取狗脊、烫狗脊药材，制备得到狗脊、烫狗脊供试品溶液；（2）精密吸取狗脊、烫狗脊供试品溶液，注入超高效液相色谱仪分析，得到狗脊、烫狗脊药材的UPLC特征图谱。该方法准确可靠、操作简便、重现性好。为狗脊与烫狗脊药材的鉴别提供一种快速、准确、客观的方法，本发明能从根本上快速地区别狗脊与烫狗脊药材，具有一定的特征性。

Description

一种狗脊与烫狗脊药材的UPLC特征图谱构建方法及鉴别方法
技术领域
本发明属于中药检测领域，具体涉及一种狗脊与烫狗脊药材的UPLC特征图谱构建方法及鉴别方法。
背景技术
狗脊来源于蚌壳蕨科大型蕨类植物金毛狗脊Cibotium barometz ( L. ) J. Sm.的干燥根茎，又称金毛狗、金毛狗蔗、金猴头、扶筋等，为常用中药。苦、寒，具有清热解毒、凉血消斑等功效，用于瘟疫时毒、发热咽痛、温毒发斑、丹毒等。多为炮制后使用，有祛风湿，补肝肾，强腰膝之效。主要用于风湿痹痛，腰膝酸软，下肢无力。狗脊的用药历史狗脊之名始载于《神农本草经》，用于寒湿痹痛及腰膝酸软等，沿用至今，功用基本未变，历代本草均有记述，品种与今用者基本一致。
烫狗脊是狗脊的炮制品。烫狗脊有祛风湿，补肝肾，强腰膝之效。主要用于风湿痹痛，腰膝酸软，下肢无力。主治肾虚腰痛脊强，足膝软弱无力，风湿痹痛，遗尿，尿频，遗精，白带等。由于经过炮制，生品和炮制品会存在活性成分的差异。因此，对不同炮制方法的炮制品进行鉴别，对于提升中药品质具有重要的实际意义。
目前，鉴别方法包括传统方法和与现代科技结合的色谱方法。现阶段，传统的眼看、口尝、鼻闻、手摸等简便方法在中药材鉴别已非常局限，而色谱方法如HPLC、IR、NIR、TLC中存在大量的假阳性和假阴性问题，容易导致结论的偏差。因此，本发明应用超高效液相色谱法建立狗脊特征图谱，从根本上进行色谱峰的归属和鉴定，从分子层面上鉴别狗脊与烫狗脊之间的特征性差异。
发明内容
本发明的目的在于提供一种狗脊与烫狗脊药材的UPLC特征图谱构建方法及鉴别方法，该方法快速、稳定且专属性强，能够更全面的反应狗脊与烫狗脊药材的特征，通过构建狗脊与烫狗脊药材的UPLC特征图谱，从根本上进行色谱峰的归属和鉴定，从分子层面上鉴别狗脊与烫狗脊药材之间的特征性差异。
本发明所要解决的上述技术问题，通过如下技术方案予以实现：
一种狗脊与烫狗脊药材的UPLC特征图谱构建方法，包含如下步骤：
（1）精密称取狗脊、烫狗脊药材，制备得到狗脊、烫狗脊供试品溶液；
（2）精密吸取狗脊、烫狗脊供试品溶液，注入超高效液相色谱仪分析，得到狗脊、烫狗脊药材的UPLC特征图谱。
作为一种优选方案，所述供试品溶液的制备方法为：取狗脊、烫狗脊粉末0.8~1.2g，精密加入混合溶液20~30ml，超声处理25~35分钟，放冷，再称定重量，用混合溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
作为一种优选方案所述混合溶液由甲醇和1%冰醋酸溶液混合组成，其中甲醇：1%冰醋酸溶液比例为60~80：20~40。
作为一种最优选方案，所述供试品溶液的制备方法为：取狗脊、烫狗脊粉末1g，精密加入混合溶液25ml，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用混合溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
作为一种优选方案所述混合溶液由甲醇和1%冰醋酸溶液混合组成，其中甲醇：1%冰醋酸溶液比例为70：30。
作为一种优选方案，所用超高效液相色谱仪分析的色谱条件为固定相采用以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，柱长为150mm，内径为2.1mm，粒径为1.6µm；流动相以乙腈为流动相A，以0.05%的磷酸水溶液为流动相B；流速为0.35~0.45ml/min；柱温为25~35℃；鉴别波长为220~300nm。
作为一种最优选方案，所用超高效液相色谱仪分析的色谱条件为固定相采用以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，柱长为150mm，内径为2.1mm，粒径为1.6µm；流动相以乙腈为流动相A，以0.05%的磷酸水溶液为流动相B；流速为0.38ml/min；柱温为30℃；鉴别波长为265nm。
作为一种优选方案，梯度洗脱条件为：0~15min，流动相A的体积分数变化为0~4.5%，流动相B的体积分数变化为100~95.5%；15~21min，流动相A的体积分数变化为4.5~5.5%，流动相B的体积分数变化为95.5~94.5%；21~31min，流动相A的体积分数变化为5.5~9%，流动相B的体积分数变化为94.5~91%，31~31.01，流动相A的体积分数变化为9~50%，流动相B的体积分数变化为91~50%，31.01~36，流动相A的体积分数为50%，流动相B的体积分数为50%。
本发明还提供了一种狗脊与烫狗脊药材的鉴别方法，其特征在于，包含如下步骤：
（1）精密称取待鉴别狗脊、烫狗脊药材，制备得到待鉴别狗脊、烫狗脊样品溶液；
（2）精密吸取待鉴别狗脊、烫狗脊样品溶液，注入超高效液相色谱仪，测定，即得；
（3）将测得的UPLC特征图谱与构建出的狗脊与烫狗脊的UPLC特征图谱进行比较比对，若与狗脊特征图谱一致，则待测样品为狗脊；若与烫狗脊特征图谱一致，则待测样品为烫狗脊。
作为一种优选方案，所述待鉴别狗脊、烫狗脊样品溶液的制备方法为：取狗脊、烫狗脊粉末0.8~1.2g，精密加入混合溶液20~30ml，超声处理25~35分钟，放冷，再称定重量，用混合溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
作为一种优选方案所述混合溶液由甲醇和1%冰醋酸溶液混合组成，其中甲醇：1%冰醋酸溶液比例为60~80：20~40。
作为一种最优选方案，所述待鉴别狗脊、烫狗脊样品溶液的制备方法为：取狗脊、烫狗脊粉末1g，精密加入混合溶液25ml，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用混合溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
作为一种优选方案所述混合溶液由甲醇和1%冰醋酸溶液混合组成，其中甲醇：1%冰醋酸溶液比例为70：30。
作为一种优选方案，所用超高效液相色谱仪分析的色谱条件为固定相采用以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，柱长为150mm，内径为2.1mm，粒径为1.6µm。流动相以乙腈为流动相A，以0.05%的磷酸水溶液为流动相B。流速为0.35~0.45ml/min；柱温为25~35℃；鉴别波长为220~300nm。
作为一种最优选方案，所用超高效液相色谱仪分析的色谱条件为固定相采用以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，柱长为150mm，内径为2.1mm，粒径为1.6µm。流动相以乙腈为流动相A，以0.05%的磷酸水溶液为流动相B。流速为0.38ml /min；柱温为30℃；鉴别波长为265nm。
作为一种优选方案，梯度洗脱条件为：0~15min，流动相A的体积分数变化为0~4.5%，流动相B的体积分数变化为100~95.5%；15~21min，流动相A的体积分数变化为4.5~5.5%，流动相B的体积分数变化为95.5~94.5%；21~31min，流动相A的体积分数变化为5.5~9%，流动相B的体积分数变化为94.5~91%，31~31.01，流动相A的体积分数变化为9~50%，流动相B的体积分数变化为91~50%，31.01~36，流动相A的体积分数为50%，流动相B的体积分数为50%。
有益效果：（1）本发明首次构建了狗脊与烫狗脊药材的UPLC特征图谱；（2）本发明构建的狗脊与烫狗脊药材的特征图谱，充分展示了狗脊与烫狗脊药材的化学成分特征；（3）本发明所述的狗脊与烫狗脊药材的鉴别方法，更加快速，稳定且专属性强，基线平稳。（4）本发明能从根本上快速地区别狗脊与烫狗脊药材，具有一定的特征性。
附图说明
图1 为22批狗脊饮片特征图谱叠加图。
图2为 22批烫狗脊饮片特征图谱叠加图。
图3 为狗脊饮片对照图谱，峰1：5-羟甲基糠醛，峰2：原儿茶酸（S峰），峰5：原儿茶醛。
图4 为烫狗脊饮片对照图谱，其中峰3：5-羟甲基糠醛，峰4（S）：原儿茶酸；峰6：原儿茶醛。
图5为5-羟甲基糠醛、原儿茶酸、原儿茶醛结构图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
狗脊与烫狗脊药材的UPLC特征图谱构建方法
试验方法
对照品溶液的配制
取原儿茶酸对照品、5-羟甲基糠醛对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含原儿茶酸20μg、5-羟甲基糠醛50μg的混合溶液，摇匀，即得。
狗脊与烫狗脊供试品溶液的制备
取狗脊、烫狗脊粉末1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入混合溶液25ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用混合溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
所述混合溶液由甲醇和1%冰醋酸溶液混合组成，其中甲醇：1%冰醋酸溶液比例为70：30。
色谱条件
固定相采用以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，柱长为150mm，内径为2.1mm，粒径为1.6µm。流动相以乙腈为流动相A，以0.05%的磷酸水溶液为流动相B。流速为0.38ml /min；柱温为30℃；鉴别波长为265nm。
梯度洗脱条件为：0~15min，流动相A的体积分数变化为0~4.5%，流动相B的体积分数变化为100~95.5%；15~21min，流动相A的体积分数变化为4.5~5.5%，流动相B的体积分数变化为95.5~94.5%；21~31min，流动相A的体积分数变化为5.5~9%，流动相B的体积分数变化为94.5~91%，31~31.01，流动相A的体积分数变化为9~50%，流动相B的体积分数变化为91~50%，31.01~36，流动相A的体积分数为50%，流动相B的体积分数为50%。
狗脊与烫狗脊药材特征图谱共有峰的确定
（1）样品测定：制备狗脊与烫狗脊供试品溶液制备在规定色谱条件下，获得22批狗脊与烫狗脊的UPLC特征图谱（图1、2），并进行共有峰标识，建立狗脊与烫狗脊的UPLC对照特征图谱(图3、4)。
（2）实验结果：选择分离度较好，色谱峰较纯的共有峰为狗脊与烫狗脊特征图谱的特征峰，确定22批狗脊具有7个特征峰(图3)，且7个特征峰均能从狗脊药材特征图谱中找到，选择狗脊药材UPLC特征图谱的上述7个共有峰作为狗脊药材UPLC特征图谱的特征峰，并以峰2（原儿茶酸）为参照峰进行标准研究，经过色谱峰指认，确定峰1为5-羟甲基糠醛，峰5为原儿茶醛； 烫狗脊具有6个特征峰(图3)，且6个特征峰均能从烫狗脊药材特征图谱中找到，选择烫狗脊药材UPLC特征图谱的上述6个共有峰作为烫狗脊药材UPLC特征图谱的特征峰，并以峰4（原儿茶酸）为参照峰进行标准研究，经过色谱峰指认，确定峰3为5-羟甲基糠醛，峰6为原儿茶醛。
精密度实验
取同一批号的狗脊、烫狗脊药材样品，按供试品溶液制备方法制备成狗脊、烫狗脊药材供试品溶液，进样6次，考察特征峰相对保留时间和相对峰面积的一致性。各特征峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD均小于2％，结果表明，精密度良好。
重复性实验
分别取同一批号狗脊、烫狗脊药材样品各6份，按供试品溶液制备方法制备成狗脊、烫狗脊药材供试品溶液，进样分析，考察特征峰相对保留时间和相对峰面积的一致性。结果表明，该方法的重复性良好。
稳定性实验
取同一批号狗脊、烫狗脊药材样品，按供试品溶液制备方法制备成狗脊、烫狗脊药材样品溶液，在0h、1h、2h、4h、8h、12h分别进样，共测定12小时，分别进样，考察特征峰相对保留时间和相对峰面积的一致性。结果表明，供试液在12小时内稳定性良好。
狗脊、烫狗脊特征图谱的确定
对22批狗脊、烫狗脊特征图谱进行分析，以原儿茶酸峰为参照峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间和相对峰面积，结果见表1、表2和表3。
表1 22批狗脊药材特征图谱相对保留时间结果表
Figure DEST_PATH_IMAGE002
表2 22批狗脊药材特征图谱相对峰面积结果表
Figure DEST_PATH_IMAGE004
表3 22批烫狗脊饮片特征图谱相对保留时间结果表
Figure DEST_PATH_IMAGE006
将22批狗脊、烫狗脊药材特征图谱通过匹配，使用《中药色谱特征图谱相似度评价系统2012版》生成对照图谱，建立狗脊、烫狗脊的对照特征图谱。
实施例2
随机从市场上购买一批狗脊药材鉴别其真伪。
一种狗脊与烫狗脊药材的鉴别方法，测量步骤如下：
（1）精密称取待鉴别狗脊药材，制备得到待鉴别狗脊样品溶液；
（2）精密吸取待鉴别狗脊样品溶液，注入超高效液相色谱仪，测定，即得；
（3）将测得的UPLC特征图谱与构建出的狗脊UPLC特征图谱进行比较比对，若与狗脊特征图谱一致，则待测样品为狗脊。
对照品溶液的配制
取原儿茶酸对照品、5-羟甲基糠醛对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含原儿茶酸20μg、5-羟甲基糠醛50μg的混合溶液，摇匀，即得。
待鉴别狗脊样品溶液的制备
取待测粉末1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入混合溶液25ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用混合溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
所述混合溶液由甲醇和1%冰醋酸溶液混合组成，其中甲醇：1%冰醋酸溶液比例为70：30。
色谱条件
固定相采用以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，柱长为150mm，内径为2.1mm，粒径为1.6µm。流动相以乙腈为流动相A，以0.05%的磷酸水溶液为流动相B；流速为0.38ml /min；柱温为30℃；鉴别波长为265nm。
梯度洗脱条件为：0~15min，流动相A的体积分数变化为0~4.5%，流动相B的体积分数变化为100~95.5%；15~21min，流动相A的体积分数变化为4.5~5.5%，流动相B的体积分数变化为95.5~94.5%；21~31min，流动相A的体积分数变化为5.5~9%，流动相B的体积分数变化为94.5~91%，31~31.01，流动相A的体积分数变化为9~50%，流动相B的体积分数变化为91~50%，31.01~36，流动相A的体积分数为50%，流动相B的体积分数为50%。
将测定的狗脊特征图谱与狗脊对照特征图谱进行比较：通过比较与狗脊药材特征图谱一致，可以判定，该批药材为狗脊药材。
实施例3
随机从市场上购买一批烫狗脊药材鉴别其真伪。
一种狗脊与烫狗脊药材的鉴别方法，测量步骤如下：
（1）精密称取待鉴别烫狗脊药材，制备得到待鉴别烫狗脊样品溶液；
（2）精密吸取待鉴别烫狗脊样品溶液，注入超高效液相色谱仪，测定，即得；
（3）将测得的UPLC特征图谱与构建出的烫狗脊的UPLC特征图若与烫狗脊特征图谱一致，则待测样品为烫狗脊。
对照品溶液的配制
取原儿茶酸对照品、5-羟甲基糠醛对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含原儿茶酸20μg、5-羟甲基糠醛50μg的混合溶液，摇匀，即得。
待鉴别烫狗脊样品溶液的制备
取待测粉末1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入混合溶液25ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用混合溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
所述混合溶液由甲醇和1%冰醋酸溶液混合组成，其中甲醇：1%冰醋酸溶液比例为70：30。
色谱条件
固定相采用以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，柱长为150mm，内径为2.1mm，粒径为1.6µm。流动相以乙腈为流动相A，以0.05%的磷酸水溶液为流动相B。流速为0.38ml /min；柱温为30℃；鉴别波长为265nm。
梯度洗脱条件为：0~15min，流动相A的体积分数变化为0~4.5%，流动相B的体积分数变化为100~95.5%；15~21min，流动相A的体积分数变化为4.5~5.5%，流动相B的体积分数变化为95.5~94.5%；21~31min，流动相A的体积分数变化为5.5~9%，流动相B的体积分数变化为94.5~91%，31~31.01，流动相A的体积分数变化为9~50%，流动相B的体积分数变化为91~50%，31.01~36，流动相A的体积分数为50%，流动相B的体积分数为50%。
将测定的烫狗脊样品特征图谱与烫狗脊对照特征图谱进行比较：通过比较与烫狗脊药材特征图谱一致，可以判定，该药材为烫狗脊药材。

Claims (6)

1.一种狗脊与烫狗脊药材的UPLC特征图谱构建方法，其特征在于，包含如下步骤：
（1）精密称取狗脊、烫狗脊药材，制备得到狗脊、烫狗脊供试品溶液；
（2）精密吸取狗脊、烫狗脊供试品溶液，注入超高效液相色谱仪分析，得到狗脊、烫狗脊药材的UPLC特征图谱；
所述超高效液相色谱仪分析的色谱条件为：固定相：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，柱长为150mm，内径为2.1mm，粒径为1.6µm；流动相：以乙腈为流动相A，以0.05%的磷酸水溶液为流动相B；
梯度洗脱条件为：0~15min，流动相A的体积分数变化为0~4.5%，流动相B的体积分数变化为100~95.5%；15~21min，流动相A的体积分数变化为4.5~5.5%，流动相B的体积分数变化为95.5~94.5%；21~31min，流动相A的体积分数变化为5.5~9%，流动相B的体积分数变化为94.5~91%，31~31.01，流动相A的体积分数变化为9~50%，流动相B的体积分数变化为91~50%，31.01~36，流动相A的体积分数为50%，流动相B的体积分数为50%。
2.根据权利要求1所述的狗脊与烫狗脊药材的UPLC特征图谱构建方法，其特征在于，所述供试品溶液的制备方法为：取狗脊、烫狗脊粉末0.8~1.2g，精密加入混合溶液20~30ml，超声处理25~35分钟，放冷，再称定重量，用混合溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；所述混合溶液由甲醇和1%冰醋酸溶液混合组成，其中甲醇：1%冰醋酸溶液比例为60~80：20~40。
3.根据权利要求1所述的狗脊与烫狗脊药材的UPLC特征图谱构建方法，其特征在于，所述超高效液相色谱仪分析的色谱条件还包括：流速为0.35~0.45ml/min；柱温为25~35℃；鉴别波长为220~300nm。
4.一种狗脊与烫狗脊药材的鉴别方法，其特征在于，包含如下步骤：
（1）精密称取待鉴别狗脊、烫狗脊药材，制备得到待鉴别狗脊、烫狗脊样品溶液；
（2）精密吸取待鉴别狗脊、烫狗脊样品溶液，注入超高效液相色谱仪，测定，即得；
（3）将测得的UPLC特征图谱与权利要求1~3任一项方法构建出的狗脊与烫狗脊的UPLC特征图谱进行比较比对，若与狗脊特征图谱一致，则待测样品为狗脊；若与烫狗脊特征图谱一致，则待测样品为烫狗脊；
所述超高效液相色谱仪分析的色谱条件为：固定相：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，柱长为150mm，内径为2.1mm，粒径为1.6µm；流动相：以乙腈为流动相A，以0.05%的磷酸水溶液为流动相B；
其中，梯度洗脱条件为：0~15min，流动相A的体积分数变化为0~4.5%，流动相B的体积分数变化为100~95.5%；15~21min，流动相A的体积分数变化为4.5~5.5%，流动相B的体积分数变化为95.5~94.5%；21~31min，流动相A的体积分数变化为5.5~9%，流动相B的体积分数变化为94.5~91%，31~31.01，流动相A的体积分数变化为9~50%，流动相B的体积分数变化为91~50%，31.01~36，流动相A的体积分数为50%，流动相B的体积分数为50%。
5.根据权利要求4所述的一种狗脊与烫狗脊药材的鉴别方法，其特征在于，所述待鉴别狗脊、烫狗脊样品溶液的制备方法为：待鉴别狗脊、烫狗脊粉末0.8~1.2g，精密加入混合溶液20~30ml，超声处理25~35分钟，放冷，再称定重量，用混合溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；所述混合溶液由甲醇和1%冰醋酸溶液混合组成，其中甲醇：1%冰醋酸溶液比例为60~80：20~40。
6.根据权利要求4所述的一种狗脊与烫狗脊药材的鉴别方法，其特征在于，所述超高效液相色谱仪分析的色谱条件还包括：流速为0.35~0.45ml/min；柱温为25~35℃；鉴别波长为220~300nm。
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