CN101850070A - 中药唐草片的质量标准及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种治疗艾滋病中药唐草片的质量标准及检测方法，采用显微特征鉴别唐草片样品中全蝎成分；采用薄层层析法鉴别唐草片样品中老鹳草、石榴皮、糯稻根、甘草、胡黄连、柴胡、黄芩、银杏叶等成分；采用高效液相色谱法定量测定唐草片样品中金银花的绿原酸和木樨草苷含量、红花的红花黄色素A含量、黄芪的黄芪甲苷含量。本发明质量控制方法稳定可靠，专一性强，确保中药唐草片的整体质量，有较大的科学性和应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及中药复方制剂，具体涉及治疗艾滋病的中药唐草片的质量标准及检测方法。
背景技术
国内外运用中医药治疗艾滋病的大量实验和临床研究结果发现，中医药对艾滋病的治疗，具有增强和稳定机体免疫功能；例如，在治疗某些机会性感染，改善患者的症状体征，提高生活质量和延长生命等方面均有较大的作用。
中国专利200410030849公开了一种治疗艾滋病的中成药复方制剂。该发明经过科学、严格的中医药理论、药物相互作用、中药配伍、药物毒理和药效、临床研究等基础研究。该中成药复方制剂具有益气养血、清热解毒、活血化瘀、除湿化痰的功效，通过益气祛邪扶正，增强HIV/AIDS患者的免疫功能，延缓HIV病毒的复制；通过调节脏腑功能而改善患者的临床症状。该发明对于艾滋病毒感染者以及艾滋病患者(CD4 +T细胞在100-400个/mm3之间)，有显著提高CD4 +T细胞计数作用，可改善乏力，脱发、食欲减退和腹泻等症状，改善活动功能状况。对无症状感染者及各期艾滋患者均可服用，长期服用该药能增强自身的抗病毒能力，提高CD4 +T细胞数，且无毒副作用，提高患者整体生活质量。该发明充分体现了中医药的整体调理、固本祛邪的理念，弥补了西药HARRT疗法的不足，同时又可以作为艾滋病患者的辅助治疗手段，价格低廉，服用方便。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于在中国专利200410030849的基础上，进一步的深入质量控制方法的研究，用先进的色谱和显微等分析技术，有效控制其活性指标成分，建立产品的质量控制标准。
中国专利200410030849公开了一种治疗艾滋病的中成药复方制剂。现已取得生产批准，产品为中药唐草片。为了对制剂产品质量进行控制，本发明人经过许多的试验，研究了其中的中药活性成分的定性定量检测方法，建立了中药唐草片的质量标准。
所述中药唐草片由老鹳草、黄芪、龙葵、金银花、木棉花、诃子、白花蛇舌草、石榴皮、糯稻根、菱角、瓜蒌皮、柴胡、香薷、甘草、鸡血藤、红花、银杏叶、马齿苋、胡黄连和全蝎等中药原料制成。所述中药原料具有下列功能，例如：①有抑制病毒复制的作用：甘草、诃子、老鹳草、石榴皮、金银花、白花蛇舌草、黄芪等。②有提高自身免疫的能力：黄芪、甘草、糯稻根、菱角等。③有抗氧化的作用：甘草、黄芪、红花、银杏叶、鸡血藤、诃子、金银花等。④能抑制并发症的发生：甘草、诃子、老鹳草、石榴皮、金银花、白花蛇舌草、黄芪、香薷、马齿苋、胡黄连、瓜蒌皮等。由于该处方组成达20味药，成分复杂多样，有效控制的难度颇大，因此，对处方中1/3以上药味进行质量控制，是符合现代化中药质量控制标准的要求。
本发明采用显微特征鉴别唐草片中生药成分，采用薄层层析法鉴别唐草片中老鹳草、石榴皮、糯稻根、甘草、胡黄连、柴胡、黄芩和银杏叶等成分，采用高效液相色谱法定量测定唐草片中金银花的绿原酸和木樨草苷含量、红花的红花黄色素A含量、黄芪的黄芪甲苷的量。建立了唐草片中的老鹳草、石榴皮、糯稻根、甘草、胡黄连、柴胡、全蝎等中药的鉴别质量控制方法；建立了唐草片中的金银花、红花、黄芪等含量测定质量控制方法。
本发明提供了一种中药唐草片的质量标准，该标准包括以下内容：
(1)唐草片样品中的全蝎显微鉴别，呈显微特征图，见图1
(2)唐草片样品中甘草的薄层鉴别，呈特征色谱图，见图2
(3)唐草片样品中糯稻根的薄层鉴别，呈特征色谱图，见图3
(4)唐草片样品中胡黄连的薄层鉴别，呈特征色谱图，见图4
(5)唐草片样品中老鹳草、石榴皮的薄层鉴别，呈特征色谱图，见图5
(6)唐草片样品中柴胡的薄层鉴别，呈特征色谱图，见图6
(7)唐草片样品中银杏叶的薄层鉴别，呈特征色谱图，见图7
(8)唐草片样品中黄芪的薄层鉴别，呈特征色谱图，见图8
(9)唐草片样品中金银花-绿原酸的高效液相色谱测定，含量以绿原酸(C16H18O9)计，不得少于0.13％，见图10。
(10)唐草片样品中金银花-木犀草苷的高效液相色谱测定，含量以木犀草苷(C21H20O11)计，不得少于0.05％，见图13。
(11)唐草片样品中黄芪-黄芪甲苷的高效液相色谱测定，含量以黄芪甲苷(C41H68O14)计，不得少于0.02％，见图16。
(12)唐草片样品中红花-红花黄色素A的高效液相色谱测定，含量以羟基红花黄色素A(C27H30O15)计，不得少于0.5％，见图19。
本发明另一目的是提供了上述中药唐草片的检测方法，该方法包括下列步骤：
(1)显微法：
全蝎显微特征鉴别：取唐草片样品适量，置显微镜下观察，体壁碎片淡黄色至黄色，有网状纹理及圆形毛窝；有时可见棕褐色刚毛。
(2)薄层层析色谱法：
A、甘草鉴别：取唐草片样品适量，研细，加水或乙醇等溶媒溶解，置水浴上加热回流或超声提取，放冷，离心，取上清液，用乙醚振摇提取1-3次，每次适量，弃去乙醚液，再用水饱和的正丁醇提取1-3次，每次适量，合并正丁醇提取液，用等量的正丁醇饱和的水洗涤1-3次，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇适量使溶解，离心，取上清液作为供试品溶液。另取甘草对照药材，同法制成对照药材溶液。再取甘草苷对照品，加甲醇制成对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录VI B)试验，吸取上述三种溶液各适量，分别点于同一硅胶薄层板上，用三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15∶40∶22∶10)10℃以下放置的下层溶液；或以适合的展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液或以2％对二甲氨基苯甲醛40％硫酸溶液，加热至斑点显色清晰，分别置日光及紫外光灯下检视。供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点及荧光斑点。
B、糯稻根鉴别：取唐草片样品适量，研细，加乙酸乙酯或甲醇等溶媒适量，回流或超声处理提取，离心，取上清液蒸干，残渣加无水乙醇或甲醇适量使溶解，作为供试品溶液。另取糯稻根对照药材，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录VI B)试验，吸取上述两种溶液各适量，分别点于同一硅胶薄层板上，用甲苯-乙酸乙酯(4∶1)或苯-氯仿-甲醇(5∶5∶1)等适合的展开剂，展开，取出，晾干，喷以2％对二甲氨基苯甲醛40％硫酸溶液，加热至斑点显色清晰，分别置日光及紫外光灯下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点及荧光斑点。
C、胡黄连鉴别：取唐草片样品适量，研细，加水或乙醇或甲醇等溶媒，使湿润，加甲醇或乙醇适量，加热回流或超声提取，离心，取上清液蒸干，残渣加水饱和的正丁醇适量使溶解，用等量的正丁醇饱和的水洗涤1-3次，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇适量使溶解，离心，取上清液作为供试品溶液。另取胡黄连苷-II对照品，加甲醇制成对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录VI B)试验，吸取上述两种溶液各适量，分别点于同一硅胶薄层板上，用乙酸乙酯-乙醇-水(8∶2∶1)，或甲苯-氯仿-甲醇(5∶5∶1)，或氯仿-乙酸乙酯-甲醇-水(15∶40∶22∶10)10℃以下放置后的下层溶液等适合的展开剂，展开，取出，晾干，喷以2％对二甲氨基苯甲醛40％硫酸溶液或10％硫酸溶液等显色剂，显色。加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
D、老鹳草、石榴皮鉴别：取唐草片样品适量，研细，加溶媒50-100ml，置沸水浴加热或超声提取，放冷，离心，取上清液，加乙酸乙酯振摇提取两次，每次20-40ml，合并乙酸乙酯层，蒸干，残渣加乙酸乙酯适量使溶解，作为供试品溶液。另取老鹳草对照药材、石榴皮对照药材各适量，分别同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录VI B)试验，吸取上述三种溶液各适量，分别点于同一硅胶薄层板上，用三氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸(4∶5∶1)或以苯-氯仿-甲醇-冰乙酸(5∶5∶2∶0.5)或以氯仿-乙酸乙酯(4∶5)等适合的展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯下检视；或加热，置碘蒸气中熏至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
E、柴胡鉴别：取唐草片样品适量，研细，加水或乙醇或甲醇等溶媒，置水浴上加热回流或超声提取，放冷，离心，取上清液，用乙醚振摇提取1-3次，每次适量，弃去乙醚液，再用水饱和的正丁醇振摇提取1-3次，每次适量，合并正丁醇提取液，用等量的氨试液洗涤，再用等量的正丁醇饱和的水洗涤1-3次，正丁醇液蒸干，残渣加溶剂使溶解，离心，取上清液作为供试品溶液。另取柴胡对照药材同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录VI B)试验，吸取上述两种溶液各适量，分别点于同一硅胶薄层板上，用甲苯-氯仿-甲醇(5∶5∶1)；或乙酸乙酯-乙醇-水(8∶2∶1)；或氯仿-乙酸乙酯-甲醇-水(15∶40∶22∶10)10℃以下放置后的下层溶液；或氯仿-乙酸乙酯-甲醇-水(15∶40∶22∶10)10℃以下放置后的下层溶液+5滴甲醇等合适的展开剂，展开，取出，晾干，喷以2％对二甲氨基苯甲醛40％硫酸溶液或者10％硫酸溶液等显色剂，显色，加热至斑点显色清晰，分别置日光及紫外光灯下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的主斑点及荧光主斑点。
F、银杏叶鉴别：取唐草片样品适量，研细，加50％丙酮100ml，加热回流，放冷，滤过，滤液蒸去丙酮，水液用乙酸乙酯适量振摇提取，乙酸乙酯液蒸干，残渣用5-25％乙醇使溶解，通过聚酰胺柱(60-90H，内径1.5cm，长10cm)，用5-10％乙醇洗脱，洗脱液浓缩至，放冷，用乙酸乙酯振摇提取1-3次，蒸干，残渣用丙酮使溶解，作为供试品溶液。另取银杏叶对照提取物，加丙酮适量制成对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2000年版一部附录VI B)试验，吸取上述两种溶液各适量，分别点于同一硅胶薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-丙酮-甲醇(10∶5∶5∶0.6)或以乙酸乙酯-丁酮-甲醇-水(5∶3∶1∶1)等复合有机溶剂，展开，取出，晾干，在加热约30分钟，置紫外光灯下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
G、黄芪鉴别：取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录VI B)试验，吸取对照品溶液和鉴别(E)项下的供试品溶液各适量，分别点于同一硅胶薄层板上，用乙酸乙酯-乙醇-水(8∶2∶1)展开剂，展开，取出，晾干，喷以2％对二甲氨基苯甲醛40％硫酸溶液或者10％硫酸溶液等显色剂，在加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
(3)高效液相色谱法定量测定唐草片样品中金银花的绿原酸、木樨草苷成分，黄芪的黄芪甲苷成分；红花的羟基红花黄色素A成分，照高效液相色谱法(中国药典2000年版一部附录VI D)测定，具体步骤包括：
A、金银花的绿原酸、木樨草苷含量测定方法：
绿原酸：取唐草片样品适量，研细，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加50％以上甲醇20ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，取出，放至室温，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，为供试品溶液。以绿原酸对照品，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为乙腈-水-磷酸(10∶89.1∶0.9)，检测波长为327nm，精密吸取对照品溶液与供试品溶液，注入液相色谱仪，测定。
木樨草苷：取唐草片样品适量，研细，取约3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％乙醇50ml，称定重量，超声处理约1小时，放冷，再称定重量，用70％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，为供试品溶液。以木犀草苷对照品，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为乙腈流动相A，以0.5％冰乙酸溶液流动相B，按0～30分钟，A∶B→10∶90，30～55分钟，A∶B→30∶70，进行梯度洗脱；检测波长为350nm。精密吸取对照品溶液与供试品溶液，注入液相色谱仪，测定。
B、黄芪的黄芪甲苷含量测定方法：
取唐草片样品适量，研细，取约3g，精密称定，置三角锥形瓶中，精密加入50％以上甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理40分钟，放冷，再次称定重量，用甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液40ml，水浴蒸干，残渣加水10ml，微热使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取4次，每次40ml，合并正丁醇液，用氨试液充分洗涤2次，每次40ml，弃去氨液，正丁醇液蒸干，残渣加水5ml使溶解，放冷，通过D101型大孔吸附树脂柱(内径1.5cm，长12cm)，以水50ml洗脱，弃去水液，再用40％乙醇30ml洗脱，弃去洗脱液，继用70％乙醇80ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，用甲醇溶解并转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，为供试品溶液。以黄芪甲苷对照品，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为乙腈-水(32∶68)；检测器为蒸发光散射，精密吸取对照品溶液10μl、20μl，供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，测定，以外标两点法对数方程计算。
C、红花的羟基红花黄色素A含量测定方法：
取唐草片样品适量，研细，取约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入25％甲醇50ml，称定重量，超声处理40分钟，放冷，再称定重量，用25％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，为供试品溶液。以羟基红花黄色素A对照品，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为甲醇-乙腈-0.7％磷酸溶液(26∶2∶72)，检测波长为403nm，精密吸取溶液与供试品溶液，注入液相色谱仪，测定。
附图说明
图1、唐草片样品中全蝎显微特征图：体壁碎片淡黄色、棕褐色刚毛、有网状纹理及圆形毛窝；
图2、唐草片样品中甘草的薄层色谱图：分别置日光及紫外光灯(365nm)下检视，点样顺序从左至右1、2、3样品，4甘草对照药材，5甘草苷对照品，6缺甘草的阴性制剂样品，7、8、9样品，10甘草对照药材，11甘草苷对照品，12缺甘草的阴性制剂样品；
图3、唐草片样品中糯稻根的薄层色谱图：分别置日光及紫外光灯(365nm)下检视，点样顺序从左至右1、2、3样品，4缺糯稻根的阴性制剂样品，5糯稻根对照药材，6、7、8样品，9缺糯稻根的阴性制剂样品，10糯稻根对照药材；
图4、唐草片样品中胡黄连的薄层色谱图：点样顺序从左至右1、2、3样品，4胡黄连苷-II对照品，5缺胡黄连阴性制剂样品；
图5、唐草片样品中老鹳草、石榴皮的薄层色谱图：点样顺序从左至右1、2、3样品，4老鹳草对照药材，5石榴皮对照药材，6缺老鹳草、石榴皮阴性制剂样品；
图6、唐草片样品中柴胡的薄层色谱图：分别置日光及紫外光灯(365nm)下检视，点样顺序从左至右1、2、3样品，4缺柴胡阴性制剂样品，5柴胡对照药材，6、7、8样品，9缺柴胡阴性制剂样品，10柴胡对照药材；
图7、唐草片样品中银杏叶的薄层色谱图：点样顺序从左至右，1、2、3样品，4银杏叶提取对照物，5缺银杏叶阴性制剂样品；
图8、唐草片样品中黄芪的薄层色谱图：点样顺序从左至右，1、2、3样品，4缺黄芪阴性制剂样品，5黄芪甲苷对照药材；
图9、绿原酸对照品的高效液相色谱图；
图10、唐草片样品中金银花-绿原酸的高效液相色谱图；
图11、缺金银花阴性制剂样品中原酸酸的高效液相色谱图；
图12、木樨草苷对照品的高效液相色谱图；
图13、唐草片样品中金银花-木樨草苷高效液相色谱图；
图14、缺金银花阴性制剂样品中木樨草苷的高效液相色谱图；
图15、黄芪甲苷对照品的高效液相色谱图；
图16、唐草片样品中黄芪-黄芪甲苷的高效液相色谱图；
图17、缺黄芪阴性制剂样品中黄芪甲苷的高效液相色谱图；
图18、红花黄色素A对照品的高效液相色谱图；
图19、唐草片样品中红花-红花黄色素A的高效液相色谱图；
图20、缺红花阴性制剂样品中红花黄色素A的高效液相色谱图。
具体实施方式
实施例1、唐草片质量标准
检验质量：
(1)唐草片样品中的全蝎显微鉴别，呈显微特征图，见图1
(2)唐草片样品中甘草的薄层鉴别，呈特征色谱图，见图2
(3)唐草片样品中糯稻根的薄层鉴别，呈特征色谱图，见图3
(4)唐草片样品中胡黄连的薄层鉴别，呈特征色谱图，见图4
(5)唐草片样品中老鹳草、石榴皮的薄层鉴别，呈特征色谱图，见图5
(6)唐草片样品中柴胡的薄层鉴别，呈特征色谱图，见图6
(7)唐草片样品中银杏叶的薄层鉴别，呈特征色谱图，见图7
(8)唐草片样品中黄芪的薄层鉴别，呈特征色谱图，见图8
(9)唐草片样品中金银花-绿原酸的高效液相色谱测定，含量以绿原酸(C16H18O9)计，不得少于0.13％，见图10。
(10)唐草片样品中金银花-木犀草苷的高效液相色谱测定，含量以木犀草苷(C21H20O11)计，不得少于0.05％，见图13。
(11)唐草片样品中黄芪-黄芪甲苷的高效液相色谱测定，含量以黄芪甲苷(C41H68O14)计，不得少于0.02％，见图16。
(12)唐草片样品中红花-红花黄色素A的高效液相色谱测定，含量以羟基红花黄色素A(C27H30O15)计，不得少于0.5％，见图19。
实施例2、唐草片检测
(1)显微特征鉴别：
全蝎显微特征：取唐草片样品适量，置显微镜下观察，体壁碎片淡黄色至黄色，有网状纹理及圆形毛窝；有时可见棕褐色刚毛。
(2)甘草、糯稻根、胡黄连、老鹳草、石榴皮、柴胡、银杏叶、黄芪薄层色谱鉴别：
A、甘草鉴别：取唐草片样品5g，研细，加水50ml，置水浴上加热回流30分钟，放冷，离心，取上清液，用乙醚振摇提取2次，每次50ml，弃去乙醚液，再用水饱和的正丁醇提取2次，每次50ml，合并正丁醇提取液，用等量的正丁醇饱和的水洗涤3次，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，离心，取上清液作为供试品溶液。另取甘草对照药材1g，同法制成对照药材溶液。再取甘草苷对照品，加甲醇制成每1ml含0.3mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录VI B)试验，吸取上述三种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15∶40∶22∶10)10℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，分别置日光及紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点及荧光斑点。
B、糯稻根鉴别：取唐草片样品3.2g，研细，加乙酸乙酯25ml，超声处理20分钟，离心，取上清液蒸干，残渣加无水乙醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取糯稻根对照药材1g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录VI B)试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯(4∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2％对二甲氨基苯甲醛40％硫酸溶液，在80℃加热至斑点显色清晰，分别置日光及紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点及荧光斑点。
C、胡黄连鉴别：取唐草片样品5g，研细，加水5ml，使湿润，加甲醇20ml，加热回流1小时，离心，取上清液蒸干，残渣加水饱和的正丁醇40ml使溶解，用等量的正丁醇饱和的水洗涤3次，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，离心，取上清液作为供试品溶液。另取胡黄连苷-II对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录VI B)试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-乙醇-水(8∶2∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
D、老鹳草、石榴皮鉴别：取唐草片样品4g，研细，加水100ml，置沸水浴加热30分钟，放冷，离心，取上清液，加乙酸乙酯振摇提取两次，每次40ml，合并乙酸乙酯层，蒸干，残渣加乙酸乙酯2ml使溶解，作为供试品溶液。另取老鹳草对照药材、石榴皮对照药材各2g，分别同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录VI B)试验，吸取上述三种溶液各2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸(4∶5∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，在105℃加热约5分钟，置碘蒸气中熏至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
E、柴胡鉴别：取唐草片样品5g，研细，加水50ml，置水浴上加热回流30分钟，放冷，离心，取上清液，用乙醚振摇提取2次，每次50ml，弃去乙醚液，再用水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次50ml，合并正丁醇提取液，用等量的氨试液洗涤，再用等量的正丁醇饱和的水洗涤2次，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，离心，取上清液作为供试品溶液。另取柴胡对照药材2g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录VI B)试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-乙醇-水(8∶2∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2％对二甲氨基苯甲醛的40％硫酸溶液，在80℃加热至斑点显色清晰，分别置日光及紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的主斑点及荧光主斑点。
F、银杏叶鉴别：取唐草片10片，研细，加50％丙酮100ml，加热回流3小时，放冷，滤过，滤液蒸去丙酮，水液用乙酸乙酯50ml振摇提取，乙酸乙酯液蒸干，残渣用15％乙醇5ml使溶解，通过聚酰胺柱(60-90H，内径1.5cm，长10cm)，用5％乙醇200ml洗脱，洗脱液浓缩至30ml，放冷，用50ml乙酸乙酯振摇提取1次，蒸干，残渣用丙酮5ml使溶解，作为供试品溶液。另取银杏叶对照提取物，加丙酮制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2000年版一部附录VI B)试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-丙酮-甲醇(10∶5∶5∶0.6)为展开剂，在15℃以下展开，取出，晾干，在140-160℃加热约30分钟，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
G、黄芪鉴别：取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录VI B)试验，吸取对照品溶液和鉴别(E)项下的供试品溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-乙醇-水(8∶2∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
(3)金银花的绿原酸、木樨草苷成分，黄芪的黄芪甲苷成分；红花的羟基红花黄色素A成分高效液相色谱法含量测定：
A、金银花的绿原酸、木樨草苷含量测定：
绿原酸：照高效液相色谱法(中国药典2000年版一部附录VI D)测定。
色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-水-(10∶89.1∶0.9)为流动相；检测波长为327nm。理论板数按绿原酸计算应不低于5000。
对照品溶液的制备精密称取绿原酸对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.04mg的溶液，即得。
供试品溶液的制备 取唐草片样品，研细，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加50％以上甲醇20ml，密塞，称定重量，超声处理(功率135W，频率59KHZ)30分钟，取出，放至室温，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
唐草片样品含金银花以绿原酸(C16H18O9)计，不得少于0.13％。
木樨草苷：照高效液相色谱法(中国药典2000年版一部附录VI D)测定。
色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈流动相A，以0.5％冰乙酸溶液流动相B，按0～30分钟，A∶B→10∶90，30～55分钟，A∶B→30∶70，进行梯度洗脱；检测波长为350nm。理论板数按木犀草苷峰面积计算应不低于2000。
对照品溶液的制备 精密称取木樨草苷对照品适量，加70％乙醇制成每1ml含40μg的溶液，即得。
供试品溶液的制备 取唐草片样品细粉，约3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％乙醇50ml，称定重量，超声处理(功率250W，频率35kHz)1小时，放冷，再称定重量，用70％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
唐草片样品含金银花以木樨草苷(C21H20O11)计，不得少于0.05％。
B、黄芪含量：照高效液相色谱法(中国药典2000年版一部附录VI D)测定。
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水(32∶68)为流动相；蒸发光散射检测器。理论板数以黄芪甲苷峰面积计算应不低于4000。
对照品溶液的制备 精密称取黄芪甲苷对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，即得。
供试品溶液的制备 取唐草片粉末约3g，精密加入50％以上甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理40分钟，放冷，再次称定重量，用甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液40ml，水浴蒸干，残渣加水10ml，微热使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取4次，每次40ml，合并正丁醇液，用氨试液充分洗涤2次，每次40ml，弃去氨液，正丁醇液蒸干，残渣加水5ml使溶解，放冷，通过D101型大孔吸附树脂柱(内径1.5cm，长12cm)，以水50ml洗脱，弃去水液，再用40％乙醇30ml洗脱，弃去洗脱液，继用70％乙醇80ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，用甲醇溶解并转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。
测定法 精密吸取对照品溶液10μl、20μl，供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，测定，以外标两点法对数方程计算，即得。
唐草片样品含黄芪，以黄芪甲苷(C41H68O14)计，不得少于0.02％。
C、红花含量：
羟基红花黄色素A：照高效液相色谱法(中国药典2000年版一部附录VI D)测定。
色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-乙腈-0.7％磷酸溶液(26∶2∶72)为流动相；检测波长为403nm；理论板数按羟基红花黄色素A峰计算应不低于3000。
对照品溶液的制备 精密称取羟基红花黄色素A对照品适量，加25％甲醇制成每1ml含0.13mg的溶液，即得。
供试品溶液的制备 取唐草片粉末约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入25％甲醇50ml，称定重量，超声处理(功率300W，频率50kHz)40分钟，放冷，再称定重量，用25％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
唐草片样品含红花，以羟基红花黄色素A(C27H30O15)计，不得少于0.5％。
实施例3、唐草片中金银花-绿原酸的高效液相色谱测定方法学研究
照高效液相色谱法(中国药典2005年版一部附录VI D)测定。色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-水-磷酸(10∶89.1∶0.9)为流动相；检测波长为327nm。理论板数按绿原酸计算应为低于5000。
对照品溶液的制备 精密称取绿原酸对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.04mg的溶液，即得。
供试品溶液的制备 取唐草片10片，研细，取0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加50％以上甲醇20ml，密塞，称定重量，超声处30分钟，取出，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，弃去初滤液，取续滤液用微孔滤膜(0.45um)滤过，即得。
测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20ul，注入液相色谱仪，测定，即得。
检测标准 唐草片每片含金银花以绿原酸(C16H18O9)计，不得少于0.13％。
系统组成：检测器 光电二极管阵列检测器 SPD-M20A 数据工作站LC Solution 柱子 INERTSIL ODS-35um 250*4.6mm
检测条件 仪器型号LC-20AT高效液相色谱仪 温度35℃ 检测波长327nm
流动相 乙腈-水-磷酸(10∶89.1∶0.9) 进样量20ul
试剂、标准品
乙腈 规格：色谱纯 批号：1.00030.4000 供应商：MERCK
磷酸 规格：色谱纯 批号：909073 供应商：TEDIA COMPANY，INC
绿原酸 规格：对照品 批号：110753-200212 供应商：中国药品生物制品研究所
本发明方法通过以下试验进行选择和验证：
方法选择性：
操作要求：按上述液相色谱条件，分别进空白样品、对照品溶液、供试品唐草片溶液各20ul，确定保留时间，及相关物质的分离度。
表3：出峰时间
| 序号 | 溶液名称 | 保留时间 |
| 1 | 空白样品 | ...... |
| 2 | 对照品溶液 | 18.982min |
| 3 | 供试品溶液 | 19.098min |
含量测定线性范围：操作要求：按要求制备对照品溶液：精密称取绿原酸对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.64mg的溶液，并再稀释成0.0636mg/ml的对照品溶液，按上述液相色谱条件，分别以5μl、10μl和5μl、10μl、20μl进样分析，每一个浓度进针二次，记录各对应浓度下的相应峰面积，以峰面积为Y，进样量为X，求线性对应关系：
表5：线性
结果：回归线的相关系数(R)为1大于0.998
样品溶液稳定性：按制备供试品溶液方法制备溶液，即得。取供试品溶液，于配制后0，4，8，12，24小时，按上述液相色谱条件，进样，记录峰面积。
表6：样品溶液稳定性
结果：峰面积的相对偏差为0.44％小于2.0％
对照品溶液的稳定性：按要求制备对照品溶液：精密称取绿原酸对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.0636mg的溶液，于0，4，8，12，24小时，按上述液相色谱条件，进样，记录峰面积。
表7：对照品溶液的稳定性
结果：峰面积的相对偏差为0.41％小于2.0％
重复性试验
操作方法：按制备供试品溶液方法制备溶液，制备5份，即得。取供试品溶液，即得。然后，按上述液相色谱条件，分别进样，测定供试品中绿原酸的含量。
计算：C样＝m标/A标×A样×C样×V样×m样×M平
表8：重复性试验
结果：供试品含量其相对偏差为1.31％小于2.0％
方法准确度(检验回收率测定)
对照品溶液的制备：取对照品10.4mg，置25ml量瓶中，加甲醇溶解摇匀作为对照品溶液，(1)另取14.9mg对照品置10ml量瓶中，加甲醇溶解摇匀，再分别稀释100倍备用；(2)另取13.0mg对照品置10ml量瓶中，加甲醇溶解摇匀，再分别吸取(2)2ml和(3)3ml，加甲醇稀释至100ml。
供试品溶液的制备：取唐草片10片，研细，取0.25g，精密称定，分别精密加入上述对照品溶液(1)和(2)、(3)各20ml，置具塞锥形瓶中，密塞，称定重量，超声处理30分钟，取出，放冷至室温，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，弃去初滤液，取续滤液用微孔滤膜(0.45um)滤过，即得。
然后按，按上述液相色谱条件，进样测定峰面积，分别求得供试品中绿原酸的含量，结果见下表。
计算：用实测值与供试品中含有量之差，除以加入对照品量计算回收率。
表9：加样回收
结论：回收率在95％-105％可接收范围之间
最低检测限：按要求制备对照品溶液，精密称取绿原酸对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.0636mg的溶液，再精密吸取1ml，置25ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀后再精密吸取1ml，置10ml量瓶中，加甲醇定容至10ml，进样4μl。
根据进针后出峰顶峰高和对照品的浓度计算得到最低检测限为1.0176ng
实施例4、唐草片中黄芪-黄芪甲苷的高效液相色谱测定方法学研究
1、方法：照高效液相色谱法(中国药典2005年版一部附录VI D)测定。
2、仪器与试剂：仪器：PE series200高效液相系统，手动进样器，2010色谱工作站；SEDEX75型蒸发光散射仪；超声波清洗机BS2200(上海科导超声仪器有限公司)；电子天平(SARTORIUS BS210S)；
试剂：乙腈为色谱纯，水为超纯水，正丁醇、甲醇等均为分析纯。黄芪甲苷对照品由中国药品生物制品检定所提供，批号110781-200512；试验用样品为本单位制备，批号060501，061001。
3、溶液的制备：
供试品溶液的制备 取唐草片粉末约3g，精密加入50％以上甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理40分钟，放冷，再次称定重量，用甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液40ml，水浴蒸干，残渣加水10ml，微热使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取4次，每次40ml，合并正丁醇液，用氨试液充分洗涤2次，每次40ml，弃去氨液，正丁醇液蒸干，残渣加水5ml使溶解，放冷，通过D101型大孔吸附树脂柱(内径1.5cm，长12cm)，以水50ml洗脱，弃去水液，再用40％乙醇30ml洗脱，弃去洗脱液，继用70％乙醇80ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，用甲醇溶解并转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。
对照品溶液的制备 精密称取黄芪甲苷对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，即得。
4、色谱条件的选择与系统适用性试验
色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水(32：68)为流动相；蒸发光散射检测器，温度为100℃，流速为1.2ml/min。理论板数以黄芪甲苷峰面积计算应不低于4000。
5、测定法 精密吸取对照品溶液10μl、20μl，供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，测定，以外标两点法对数方程计算，即得。
6、试验项目
6.1测定方法的选择
黄芪甲苷含量测定方法有比色法、薄层扫描法、HPLC法、HPLC-ELSD法，由于本品所含成分较多，比色法不适用；薄层扫描法操作比较复杂，误差大；HPLC法对本品分离较好，由于黄芪甲苷仅在200nm左右处有弱的末端吸收，灵敏度低，检测效果不佳。目前，《中国药典2005年版一部》及近年文献，均以HPLC-ELSD法测定，结果无干扰，重现性好。故选择此法为测定方法。
6.2提取条件选择
6.2.1溶剂选择
《中国药典2005年版一部》及有关文献[5][6][7]中记载，黄芪药材及含黄芪的中成药有关于黄芪甲苷的测定，其报道的提取溶剂主要为甲醇，故选择甲醇作为提取溶剂。
6.2.2提取溶剂量选择
取样品060501粉末，分别加入甲醇25ml，50ml，75ml，超声40分钟，按样品处理方法步骤处理，取20ul进样，记录峰面积。结果见下表：
4.2.3提取时间的选择
取样品粉末，分别加入甲醇20ml，40ml，60ml，热回流，按样品处理方法步骤处理，取20ul进样，记录峰面积。结果见下表：
表10：提取溶剂量选择
| 提取溶剂量 | 25ml | 40ml | 60ml |
| 相当于1g样品的峰面积 | 185392.3 | 212264.6 | 221339.8 |
结果表明，采用25ml量甲醇提取结果低，采用40ml和60ml量甲醇提取较为完全，故选择50ml量甲醇为提取溶剂量。
4.2.3提取时间的选择
取样品060501粉末，以甲醇为溶剂，分别超声处理20分钟，40分钟，60分钟，按样品处理方法步骤处理，取20ul进样，记录峰面积。结果见下表：
表11：提取时间的选择
| 超声时间(min) | 20 | 40 | 60 |
| 相当于1g样品的峰面积 | 188986.9 | 212264.6 | 214703.0 |
结果表明，样品超声40分钟和60分钟，提取较完全，故选择超声时间为40分钟。
4.3空白样品试验：取不含黄芪药材的其他各味药材，按相同工艺制得阴性对照样品，按样品处理方法步骤处理，取20ul进样，在黄芪甲苷对照品出峰处没有吸收峰。
4.4线性关系及最低检测限：精密称取黄芪甲苷对照品15.52mg，置100ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。精密吸取上述对照品溶液5ml置10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀。依次配制溶度为0.1552，0.0776，0.0388，0.0194，0.0097mg/ml对照品溶液为标准曲线样品，以浓度为0.00485mg/ml的对照品溶液为最低检测限样品。精密吸取上述对照品溶液各20ul，高效液相色谱仪中，测定其峰面积。结果见下表。
表12：黄芪甲苷标准曲线测定结果
| 黄芪甲苷进样量(ug) | 进样量的自然对数 | 平均峰面积 | 平均峰面积的自然对数 |
| 0.194 | -0.7122 | 13480.5 | 4.1297 |
| 0.388 | -0.4112 | 39167.7 | 4.5929 |
| 0.776 | -0.1101 | 107795.9 | 5.0326 |
| 1.552 | 0.1909 | 318920.9 | 5.5037 |
| 3.104 | 0.4919 | 997955.5 | 5.9991 |
以峰面积A的自然对数值为纵坐标Y，以黄芪甲苷进样量的自然对数值为横坐标X，绘制标准曲线，经线性回归，得到回归方程：y＝1.5446x+5.2217，r＝0.9998，黄芪甲苷在0.194～3.104ug范围内呈良好线性关系，最低检出限为0.00485mg/ml。
4.5精密度试验：取浓度为0.0776mg/ml的对照品溶液，连续进样5次，其峰面积见下表15-16，
表13：对照品溶液精密度试验结果
| 测定次数 | 第一次 | 第二次 | 第三次 | 第四次 | 第五次 |
| 峰面积 | 320374.1 | 317467.6 | 315366.9 | 317194.2 | 318196.9 |
结果表明，黄芪甲苷峰面积RSD为0.57％，本仪器精密度良好。，
4.6溶液稳定性试验：取浓度为0.0776mg/ml的对照品溶液，分别在0、2、8、16、24、36小时检测；取样品，按样品处理方法步骤处理，分别在0、2、8、16、24、36小时检测，其黄芪甲苷峰面积见下表14，15。
表14：对照品溶液的稳定性试验结果
| 测定时间(h) | 0 | 2 | 8 | 16 | 24 | 36 |
| 对照品峰面积 | 318920.9 | 322309.1 | 316404.5 | 320941.1 | 321029.0 | 318585.3 |
表15：样品溶液的稳定性试验结果
| 样品品测定时间(h) | 0 | 2 | 8 | 16 | 24 | 36 |
| 样品峰面积 | 243757.6 | 239101.8 | 243889.4 | 241258.7 | 240629.6 | 243059.7 |
结果表明，对照品黄芪甲苷峰面积RSD为0.67％，样品中黄芪甲苷峰面积RSD为0.80％，溶液在检测时间范围内稳定性良好。
4.7重现性试验：取同一批号061001的样品5份，分别按样品制备方法处理后测定，所测得每克样品含黄芪甲苷量见下表。
表16：样品溶液的重现性试验结果
| 样品 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| 每克样品含黄芪甲苷mg | 0.447 | 0.453 | 0.464 | 0.459 | 0.461 |
结果表明，5份样品平均含量为0.457mg/g，RSD为1.49％，重现性结果良好。
4.8加样回收试验
分别称取样品6份，每份约1.0g，精密称定，加入一定量的对照品，再按样品溶液的制备方法处理后，测定，进行计算，具体结果见下表。
表17黄芪甲苷含量测定回收率试验结果
结论：方法回收率测定结果RSD为1.47％，表明回收率较好，符合要求。
Claims (2)
1.一种治疗艾滋病中药唐草片的质量标准：其特征在于所述质量标准如下：
(1)唐草片样品中的全蝎显微鉴别，呈显微特征图；
(2)唐草片样品中甘草的薄层鉴别，呈特征色谱图；
(3)唐草片样品中糯稻根的薄层鉴别，呈特征色谱图；
(4)唐草片样品中胡黄连的薄层鉴别，呈特征色谱图；
(5)唐草片样品中老鹳草、石榴皮的薄层鉴别，呈特征色谱图；
(6)唐草片样品中柴胡的薄层鉴别，呈特征色谱图；
(7)唐草片样品中银杏叶的薄层鉴别，呈特征色谱图；
(8)唐草片样品中黄芪的薄层鉴别，呈特征色谱图；
(9)唐草片样品中金银花-绿原酸的高效液相色谱测定，含量以绿原酸(C16H18O9)计，不得少于0.13％；
(10)唐草片样品中金银花-木犀草苷的高效液相色谱测定，含量以木犀草苷(C21H20O11)计，不得少于0.05％；
(11)唐草片样品中黄芪-黄芪甲苷的高效液相色谱测定，含量以黄芪甲苷(C41H68O14)计，不得少于0.02％；
(12)唐草片样品中红花-红花黄色素A的高效液相色谱测定，含量以羟基红花黄色素A(C27H30O15)计，不得少于0.5％。
2.一种如权利要求1所述的中药唐草片的检测方法，其特征在于该方法包括下列步骤：
(1)显微法鉴别：
全蝎显微鉴别特征：取唐草片样品适量，置显微镜下观察，体壁碎片淡黄色至黄色，有网状纹理及圆形毛窝；有时可见棕褐色刚毛；
(2)薄层层析色谱法：
A、甘草鉴别：取唐草片样品适量，研细，加水或乙醇等溶媒溶解，置水浴上加热回流或超声提取，放冷，离心，取上清液，用乙醚振摇提取1-3次，每次适量，弃去乙醚液，再用水饱和的正丁醇提取1-3次，每次适量，合并正丁醇提取液，用等量的正丁醇饱和的水洗涤1-3次，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇适量使溶解，离心，取上清液作为供试品溶液；另取甘草对照药材，同法制成对照药材溶液，再取甘草苷对照品，加甲醇制成对照品溶液，照薄层色谱法中国药典2005年版一部附录VI B试验，吸取上述三种溶液各适量，分别点于同一硅胶薄层板上，用三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水15∶40∶22∶10，10℃以下放置的下层溶液或以适合的展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液或以2％对二甲氨基苯甲醛40％硫酸溶液，加热至斑点显色清晰，分别置日光及紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点及荧光斑点；
B、糯稻根鉴别：取唐草片样品适量，研细，加乙酸乙酯或甲醇等溶媒适量，回流或超声处理提取，离心，取上清液蒸干，残渣加无水乙醇或甲醇适量使溶解，作为供试品溶液。另取糯稻根对照药材，同法制成对照药材溶液，照薄层色谱法中国药典2005年版一部附录VI B试验，吸取上述两种溶液各适量，分别点于同一硅胶G薄层板上，用甲苯-乙酸乙酯4∶1或苯-氯仿-甲醇5∶5∶1展开剂，展开，取出，晾干，喷以2％对二甲氨基苯甲醛40％硫酸溶液，加热至斑点显色清晰，分别置日光及紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点及荧光斑点；
C、胡黄连鉴别：取唐草片样品适量，研细，加水或乙醇或甲醇等溶媒，使湿润，加甲醇或乙醇适量，加热回流或超声提取，离心，取上清液蒸干，残渣加水饱和的正丁醇适量使溶解，用等量的正丁醇饱和的水洗涤1-3次，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇适量使溶解，离心，取上清液作为供试品溶液；另取胡黄连苷-II对照品，加甲醇制成对照品溶液，照薄层色谱法中国药典2005年版一部附录VI B试验，吸取上述两种溶液各适量，分别点于同一硅胶薄层板上，用乙酸乙酯-乙醇-水8∶2∶1或甲苯-氯仿-甲醇5∶5∶1或氯仿-乙酸乙酯-甲醇-水15∶40∶22∶10，10℃以下放置后的下层溶液或以适合的展开剂，展开，取出，晾干，喷以2％对二甲氨基苯甲醛40％硫酸溶液或10％硫酸溶液等显色剂，显色，加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
D、老鹳草、石榴皮鉴别：取唐草片适量，研细，加溶媒50-100ml，置沸水浴加热或超声提取，放冷，离心，取上清液，加乙酸乙酯振摇提取两次，每次20-40ml，合并乙酸乙酯层，蒸干，残渣加乙酸乙酯适量使溶解，作为供试品溶液；另取老鹳草对照药材、石榴皮对照药材各适量，分别同法制成对照药材溶液，照薄层色谱法中国药典2005年版一部附录VI B试验，吸取上述三种溶液各适量，分别点于同一硅胶薄层板上，用三氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸4∶5∶1或以苯-氯仿-甲醇-冰乙酸5∶5∶2∶0.5或以氯仿-乙酸乙酯4∶5为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯下检视；或加热，置碘蒸气中熏至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与对照品药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
E、柴胡鉴别：取唐草片样品适量，研细，加水或乙醇或甲醇等溶媒，置水浴上加热回流或超声提取，放冷，离心，取上清液，用乙醚振摇提取1-3次，每次适量，弃去乙醚液，再用水饱和的正丁醇振摇提取1-3次，每次适量，合并正丁醇提取液，用等量的氨试液洗涤，再用等量的正丁醇饱和的水洗涤1-3次，正丁醇液蒸干，残渣加溶剂使溶解，离心，取上清液作为供试品溶液；另取柴胡对照药材同法制成对照药材溶液，照薄层色谱法中国药典2005年版一部附录VI B试验，吸取上述两种溶液各适量，分别点于同一硅胶薄层板上，用甲苯-氯仿-甲醇5∶5∶1或乙酸乙酯-乙醇-水8∶2∶1或氯仿-乙酸乙酯-甲醇-水15∶40∶22∶10，10℃以下放置后的下层溶液；或氯仿-乙酸乙酯-甲醇-水15∶40∶22∶10，10℃以下放置后的下层溶液+5滴甲醇或以合适的展开剂，展开，取出，晾干，喷以2％对二甲氨基苯甲醛40％硫酸溶液或者10％硫酸溶液等显色剂，显色，加热至斑点显色清晰，分别置日光及紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的主斑点及荧光主斑点；
F、银杏叶鉴别：取唐草片制剂样品适量，研细，加50％丙酮100ml，加热回流，放冷，滤过，滤液蒸去丙酮，水液用乙酸乙酯适量振摇提取，乙酸乙酯液蒸干，残渣用5-25％乙醇使溶解，通过聚酰胺柱60-90H，内径1.5cm，长10cm，用5-10％乙醇洗脱，洗脱液浓缩至，放冷，用乙酸乙酯振摇提取1-3次，蒸干，残渣用丙酮使溶解，作为供试品溶液。另取银杏叶对照提取物，加丙酮适量制成对照品溶液，照薄层色谱法中国药典2000年版一部附录VI B试验，吸取上述两种溶液各适量，分别点于同一硅胶薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-丙酮-甲醇10∶5∶5∶0.6或以乙酸乙酯-丁酮-甲醇-水5∶3∶1∶1为展开剂，展开，取出，晾干，加热30分钟，置紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；
G、黄芪鉴别：取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成对照品溶液，照薄层色谱法中国药典2005年版一部附录VI B试验，吸取对照品溶液和鉴别E项下的供试品溶液各适量，分别点于同一硅胶薄层板上，用乙酸乙酯-乙醇-水8∶2∶1展开剂，展开，取出，晾干，喷以2％对二甲氨基苯甲醛40％硫酸溶液或者10％硫酸溶液显色剂，在加热至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
(3)高效液相色谱法定量测定唐草片中样品金银花的绿原酸、木樨草苷成分，黄芪的黄芪甲苷成分；红花的羟基红花黄色素A成分，照高效液相色谱法中国药典2000年版一部附录VI D测定，具体步骤包括：
A、金银花中绿原酸、木樨草苷的含量测定方法：
绿原酸：取唐草片样品适量，研细，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加50％以上甲醇20ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，取出，放至室温，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，为供试品溶液，以绿原酸对照品，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为乙腈-水-磷酸10∶89.1∶0.9，检测波长为327nm，精密吸取对照品溶液与供试品溶液，注入液相色谱仪，测定；
木樨草苷：取唐草片样品适量，研细，取约3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％乙醇50ml，称定重量，超声处理约1小时，放冷，再称定重量，用70％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，为供试品溶液。以木犀草苷对照品，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为乙腈流动相A，以0.5％冰乙酸溶液流动相B，按0～30分钟，A∶B→10∶90，30～55分钟，A∶B→30∶70，进行梯度洗脱；检测波长为350nm。精密吸取对照品溶液与供试品溶液，注入液相色谱仪，测定；
B、黄芪中黄芪甲苷含量：取唐草片样品适量，研细，取约3g，精密加入50％以上甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理40分钟，放冷，再次称定重量，用甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液40ml，水浴蒸干，残渣加水10ml，微热使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取4次，每次40ml，合并正丁醇液，用氨试液充分洗涤2次，每次40ml，弃去氨液，正丁醇液蒸干，残渣加水5ml使溶解，放冷，通过D101型大孔吸附树脂柱内径1.5cm，长12cm，以水50ml洗脱，弃去水液，再用40％乙醇30ml洗脱，弃去洗脱液，继用70％乙醇80ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，用甲醇溶解并转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，为供试品溶液，以黄芪甲苷对照品，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为乙腈-水32∶68；检测器为蒸发光散射，精密吸取对照品溶液10μl、20μl，供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，测定，以外标两点法对数方程计算；
C、红花中羟基红花黄色素A含量：取唐草片样品适量，研细，取约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入25％甲醇50ml，称定重量，超声处理40分钟，放冷，再称定重量，用25％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，为供试品溶液，以羟基红花黄色素A对照品，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为甲醇-乙腈-0.7％磷酸溶液26∶2∶72，检测波长为403nm，精密吸取溶液与供试品溶液，注入液相色谱仪，测定。
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