CN110559309A - 黄芪甲苷在制备预防和治疗艾滋病毒药物中的应用 - Google Patents

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杨英
苏艳芳
吴昌鸿
张瑞娟
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Abstract

本发明公开了黄芪甲苷在制备预防和治疗艾滋病毒药物中的应用，涉及黄芪甲苷的新用途，体外细胞试验时发现黄芪甲苷具有明显地抑制艾滋病毒感染，特别是抑制艾滋病毒cDNA整合。因此，黄芪甲苷可以开发成制备抗艾滋病毒、特别是预防或治疗艾滋病的药物。本发明采用化学提纯法纯化黄芪甲苷，通过体外实验证实黄芪甲苷具有抑制HIV‑1病毒的作用，为应用黄芪甲苷抗病毒提供良好的工作基础。研究黄芪甲苷抑制HIV‑1病毒将具有重大的科学意义和应用前景，为进一步开发我国的中草药的新的药用价值提供依据。

Description

黄芪甲苷在制备预防和治疗艾滋病毒药物中的应用
技术领域
本发明涉及黄芪甲苷(AstragalosideⅣ)的新用途，特别是涉及黄芪甲苷抑制艾滋病毒(HIV-1)的应用。
背景技术
黄芪具有健脾补中,补气固表、升阳举陷、利尿排毒、排脓、敛疮生肌等功效，并具有增强机体免疫功能、保肝、利尿、抗衰老、抗应激、降压和抗菌等作用。黄芪甲苷是黄芪的主要活性成分，其药理活性主要包括增强免疫力，抗炎杀菌、抗癌和抗病毒等。
艾滋病是一种危害性极大的传染病，是由于感染艾滋病病毒(humanimmunodeficiency virus；HIV)引起。HIV-1病毒可破坏人体的免疫系统，使人体易于感染多种疾病，严重危害人类健康。目前在全世界范围内仍缺乏根治HIV感染的有效药物。有报道显示黄芪甲苷(黄芪皂苷IV)对柯萨奇病毒，乙型肝炎病毒及腺病毒具有一定的抑制作用。目前还未见黄芪甲苷抑制HIV-1病毒的报道。
发明内容
为了解决现有技术中的问题，本发明提供一种黄芪甲苷在制备预防和治疗艾滋病毒药物中的应用，解决现有技术中缺乏根治HIV感染的有效药物的问题。
本发明的技术方案为：
黄芪甲苷在制备预防和治疗艾滋病毒药物中的应用。
黄芪甲苷在制备HIV-1病毒抑制剂中的应用。
一种预防和治疗艾滋病毒的药物制剂，以黄芪甲苷为有效成分并辅以药学上可接受的辅料组成。
所述药物制剂为片剂、注射剂、缓释剂、胶囊或复方制剂。
其中，本发明所说的“抑制艾滋病毒”主要为抑制艾滋病毒cDNA的整合。
本发明有益效果：本发明在体外细胞试验时发现黄芪甲苷具有明显地抑制艾滋病毒感染，特别是抑制艾滋病毒cDNA整合。因此，黄芪甲苷可以开发成制备抗艾滋病毒、特别是预防或治疗艾滋病的药物。
本发明采用化学提纯法纯化黄芪甲苷，通过体外实验证实黄芪甲苷具有抑制HIV-1病毒的作用，为应用黄芪甲苷抗病毒提供良好的工作基础。研究黄芪甲苷抑制HIV-1病毒将具有重大的科学意义和应用前景，为进一步开发我国的中草药的新的药用价值提供依据。
附图说明
图1黄芪甲苷药物毒性结果；
图2假病毒制备情况；
图3黄芪甲苷对艾滋病毒抑制作用；
图4病毒整合cDNA；
具体实施方式
下面用实例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。
实施例1制备黄芪甲苷：
(1)将膜荚黄芪的干燥块根粉碎，用3倍质量的体积浓度为70％乙醇水溶液加热回流提取2次，再用3质量倍的体积浓度为30％乙醇水溶液加热回流提取1次，每次提取2.5h，过滤，合并滤液，减压回收溶剂至残留物无醇味；
(2)将步骤(1)获得的残留物分散至蒸馏水中，配成残留物质量浓度为40％的水混悬液；依次用1倍体积的乙酸乙酯，1倍体积的正丁醇进行萃取；将正丁醇萃取液减压回收至干，获得正丁醇萃取物；
(3)将正丁醇萃取物加入水溶解后用D101大孔树脂柱分离，依次用水，30％乙醇，50％乙醇，70％乙醇，95％乙醇洗脱，收集70％乙醇洗脱液，旋干；
(4)将步骤(3)获得的残留物加入溶剂溶解，与相当步骤(3)获得的残留物质量3倍的100-200目硅胶搅拌均匀，自然晾干，获得拌有步骤(3)获得的残留物的硅胶。再以相当步骤(3)获得的残留物质量50倍的100-200目硅胶湿法装柱，用拌有步骤(3)获得的残留物的硅胶干法上样，依次用体积比为(9：1)，(8：2)，(7：3)，(6：4)，(5：5)的二氯甲烷-甲醇进行梯度洗脱，收集体积比为(5：5)的二氯甲烷-甲醇洗脱液，自然放置，析出黄芪甲苷。
实施例2黄芪甲苷抑制HIV-1的实验研究
1.细胞及细胞培养
本研究采用的实验模型为HEK293T细胞，用于制备艾滋病假病毒；MAGI-CCR-5细胞，该细胞株表面具有CD4+受体，易于被HIV假病毒感染。
细胞完全培养基为含10％胎牛血清，1％青霉素/链霉素的DMEM培养基。细胞于37℃，5％CO2孵箱中进行培养。
2.药物的细胞毒性检测
受试药物用DMSO分别配制成25μg/mL,50μg/mL,100μg/mL,200μg/mL四个不同浓度。HEK293T细胞在96孔细胞培养板中培养24小时后，加入不同浓度黄芪甲苷培养液(25μg/mL,50μg/mL,100μg/mL,200μg/mL)，对照组加入DMSO，分别于加药后24h,48h和72h检测细胞存活率，采用MTT法检测细胞存活率，确定药物对293T细胞的毒性浓度。
3.MTT法：
MTT法是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在492nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
实验结果如图1所示，黄芪甲苷对细胞没有明显的毒性。
4.HIV假病毒的制备
按照VSVG:NL4-3-dVif/dEnv为1:6的比例进行转染，采用PEI转染试剂进行转染。1.6×105个HEK293T细胞接种6孔板，24小时后加入不同浓度的黄芪甲苷(0μg/mL,25μg/mL,50μg/mL,100μg/mL)，继续培养24小时后收获病毒，6000rpm离心去除细胞碎片，病毒上清过滤并分装，保存于-80℃冰箱。Western blot检测病毒蛋白含量，根据p24蛋白量调平病毒浓度进行感染。
实验结果如图2所示，病毒在24KDa大小检测到蛋白存在，证明成功制备了HIV假病毒。
5.药物对艾滋病毒抑制作用实验
原理：
步骤4中制备的假病毒带有GFP标签，当病毒感染表达CD4+受体的MAGI细胞后，被感染的细胞表达GFP蛋白，通过流式细胞术检测GFP阳性的细胞即可确定被假病毒感染的细胞数量，从而计算病毒的感染能力，进而确定黄芪甲苷对病毒的抑制作用。
步骤：
MAGI细胞接种24孔培养板，每孔细胞数为4×104个，同时加入20μg/mL DEAE-dextran。24小时后，去掉原培养基，加入加药处理后的病毒上清液，病毒浓度梯度为30μL,60μL,90μL(培养总体积为150μL)，未加药处理的病毒上清液作为阳性对照，设置相同的浓度梯度。病毒感染2小时后加入1mL完全培养基，继续培养48小时后采用流式细胞术检测病毒感染情况。
实验结果如图3所示，黄芪甲苷对艾滋病毒具有明显的抑制作用。
6.黄芪甲苷对细胞中艾滋病毒整合cDNA的抑制作用
MAGI细胞接种24孔培养板，每孔细胞数为4×104个，同时加入20μg/mLDEAE-dextran。24小时后，去掉原培养基加入加药处理后的病毒上清液，病毒感染量为90μL(培养总体积为150μL)，未加药处理的病毒上清液作为阳性对照，病毒感染量相同。感染2小时后，加入1mL无抗培养基，感染16小时后收获细胞。
收获细胞时先弃掉细胞培养液，每孔加入300μL PBS漂洗，弃掉PBS，加入200μL0.25％胰酶，再加入600μL完全培养基中和胰酶，收获细胞，6000rpm离心5分钟后弃上清收获细胞沉淀。
采用DNeasy Blood&Tissue Kit(QIAGEN公司)试剂盒提取细胞总DNA。实时定量PCR分别检测HIV-1病毒在逆转录早期、晚期及整合期的cDNA量。
实验结果如图4所示，黄芪甲苷可抑制病毒cDNA的整合，抑制率为97.11％。
我们的研究显示黄芪甲苷具有通过抑制HIV-1病毒的整合进而抑制HIV-1病毒增殖的作用。

Claims (4)

1.黄芪甲苷在制备预防和治疗艾滋病毒药物中的应用。
2.黄芪甲苷在制备HIV-1病毒抑制剂中的应用。
3.一种预防和治疗艾滋病毒的药物制剂，其特征在于，以黄芪甲苷为有效成分并辅以药学上可接受的辅料组成。
4.根据权利要求3所述的预防和治疗艾滋病毒的药物制剂，其特征在于，所述药物制剂为片剂、注射剂、缓释剂、胶囊或复方制剂。
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