CN107753823B - 一种治疗或预防手足口病的中药组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明为克服现代医药对于治疗和预防手足口病方面的缺陷，提供了一种中药组合物在制备治疗或预防手足口病药物中的应用。该组合物的给药方式多样，毒副作用小，能够有效地抑制手足口病病毒引起的细胞病变、抑制病毒复制、降低病毒载量、减少或消除感染小鼠死亡、延长生存实验以及平抑炎症等。该中药组合物可以作为新的手足口病药治疗或预防药物，为治疗或预防手足口病提供一种新的途径和手段。

Description

一种治疗或预防手足口病的中药组合物
技术领域
本发明涉及中药技术领域，具体涉及一种治疗或预防手足口病的中药组合物。
背景技术
手足口病是由病毒引起的儿童传染病，为我国法定丙类传染病。该病主要感染0-6岁的婴幼儿，以2-3岁儿童感染最为常见，手足口病发病初期在患儿四肢末端以及口腔等处引起疱疹或溃疡，患儿多在1-2周内痊愈。然而，少数病例病情进展迅速，可在发病1-5天左右出现脑膜炎、无菌性脑炎、脑干脑炎、脑脊髓炎、肺水肿、呼吸和血液循环障碍等，极少数病例病情危重，可致死亡，存活病例可留有后遗症。
根据世界卫生组织报告，能够引起手足口病症状的病毒大约有20多种，其中以肠道病毒71型(enterovirus 71，EV71)和柯萨奇病毒A组16型(coxsachievirus A16，CoxA16)最为常见，由这两种病毒感染引起的病例数约占总病例数80％以上。其他能够引起手足口病的病毒主要包括：柯萨奇病毒A组4、5、7、9和10型(CoxA4、CoxA5、CoxA7、CoxA9和CoxA10)，柯萨奇病毒B组2和5型(CoxB2和CoxB5)以及埃可病毒(ECHO)等。
模型是化合物活性及作用机理的载体，手足口病毒感染可诱导多种细胞凋亡，包括人恶性胚胎横纹肌瘤细胞(RD)、Jurkat细胞、神经上皮瘤细胞(SK-N-MC)、人神经母细胞瘤细胞(SK-N-SH)、成胶质细胞瘤细胞(SF268)、非洲绿猴肾细胞(Vero)、人微血管内皮细胞以及HeLa细胞等。在实际的研究中，由于RD细胞和Vero细胞对病毒的敏感性较好，常用于细胞水平的抗病毒研究。在动物模型方面，1-7日龄的小鼠对病毒敏感，常用作动物模型。小鼠接种病毒后3-5天出现拒乳和体重下降等症状，6-8天四肢出现僵直性瘫痪等明显症状，9-14天后根据病毒接种量的不同自愈或死亡。
尽管手足口病疫苗已经获批上市，但其安全性和有效性仍有待进一步的临床验证；另一方面，目前临床上还没有直接靶向病毒的特效药物，临床主要采取对症治疗的策略；而广谱抗病毒药物利巴韦林在应用于婴幼儿时有致畸和抑制生长发育的风险。
中药是我国医药文化的瑰宝，随着国家对中药开发的逐步重视，优选健康、安全且功效确切的中药，受到消费者的广泛青睐。为克服现代医药对于治疗和预防手足口病方面的缺陷，有必要从传统中药中寻找能治疗或预防手足口病的组方或药物，为现有手足口病的治疗或预防提供一种新的途径和手段。
发明内容
本发明的目的在于弥补现有技术的不足，提供一种中药组合物在制备治疗或预防手足口病药物中的应用。
具体地，本发明提出了一种组合物在制备治疗或预防手足口病药物中的应用，该手足口病是由肠道病毒71型、柯萨奇病毒A组16型、柯萨奇病毒A组4型、柯萨奇病毒A组5型、柯萨奇病毒A组7型、柯萨奇病毒A组9型、柯萨奇病毒A组10型、柯萨奇病毒B组2型、5型或埃可病毒引起的手足口病；其中，该组合物由下述原料药制成：
Figure BDA0001433773620000021
进一步地，所述组合物由下述原料药制成：
Figure BDA0001433773620000022
Figure BDA0001433773620000031
或者，所述组合物由下述原料药制成：
Figure BDA0001433773620000032
进一步地，所述治疗或预防手足口病药物选自口服给药剂型、注射给药剂型或外用给药制剂。
具体地，所述治疗或预防手足口病药物的剂型选自注射剂、片剂、栓剂、软膏剂、凝胶剂、丸剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂和合剂。
本发明还提出了一种组合物在制备治疗或预防肠道病毒71型、柯萨奇病毒A组16型、柯萨奇病毒A组4型、柯萨奇病毒A组5型、柯萨奇病毒A组7型、柯萨奇病毒A组9型、柯萨奇病毒A组10型、柯萨奇病毒B组2型、5型或埃可病毒所引起疾病的药物中的应用，其中，该组合物由下述原料药制成：
Figure BDA0001433773620000033
进一步地，所述组合物由下述原料药制成：
Figure BDA0001433773620000034
或者，所述组合物由下述原料药制成：
Figure BDA0001433773620000041
本发明首先通过MTS法检测了上述中药组合物对Vero细胞(非洲绿猴肾细胞)的毒性情况；其次，研究了其对肠道病毒71型和柯萨奇病毒A组16型感染的Vero细胞的保护作用，发现病毒抑制率呈剂量依赖效应；第三，利用Real-Time PCR检测了该组合物对病毒核酸复制的影响，结果表明其能够干预病毒感染早期事件，抑制病毒复制，降低宿主细胞内病毒载量，促进病毒转阴；第四，研究发现本发明提出的组合物具有广谱的抗病毒作用；最后，通过多种给药方式发现该中药组合物能够延长感染小鼠生存时间，提高生存率，抑制感染小鼠炎症因子释放，平抑炎症。
本发明的中药组合物以局方《三拗汤》和《金匮》甘桔汤为基础加味组成，根据传统中医理论，手足口病属于“瘟疫”范畴。疫毒经口鼻入，湿热侵袭脾肺，外发四肢，上熏口咽，发为疱疹，并见发热、咽痛、流涎、纳差、便秘等症状。总的来说，该中药组合物用于治疗或预防手足口病具有其中医理论基础。尚没有文献报道其治疗或预防手足口病方面的有益作用。本发明提出的中药组合物，给药方式多样，毒副作用小，能够有效地抑制手足口病病毒引起的细胞病变、抑制病毒复制、降低病毒载量、减少或消除感染小鼠死亡、延长生存实验以及平抑炎症等。总之，该中药制剂用于治疗或预防手足口病的，安全有效，给药方式多样，弥补了现有药物在治疗或预防手足口病方面的空白与缺陷，具有广泛的应用前景。
具体实施方式
如前所述，本发明旨在提供一种中药组合物在制备治疗或预防手足口病药物中的应用。以下将结合实验例的内容进行具体描述。
特别需要指出的是，针对本发明所做出的类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
本发明如未注明具体条件者，均按照常规条件或制造商建议的条件进行，所用原料药或辅料，以及所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1干膏粉的制备
1.药材与试剂
除液相色谱用甲醇和乙腈为色谱纯外，其余试剂均为分析纯。
麻黄(Ephedrae Herba)；苦杏仁(Armeniacae Semen Amarum)；桔梗(Platycodonis Radix)；前胡(Peucedani Radix)；浙贝母(Fritillariae ThunbergiiBulbus)；百部(Stemonae Radix)；北沙参(Glehniae Radix)；木蝴蝶(Oroxyli Semen)；甘草(Glycyrrhiza Radix Et Rhizoma)；以上中药材均购于安徽亳州。所有药材饮片的炮制工艺及质控方法均严格按照2015版《中国药典》所载要求执行，麻黄优选蜜炙麻黄。
2.化合物的制备
制备例1
麻黄250重量份、前胡500重量份、浙贝母500重量份和百部500重量份加70％的乙醇6倍，回流3小时，过滤，药渣加70％的乙醇3倍，回流2小时，过滤，合并滤液，减压浓缩至55-65℃相对密度为1.08，得醇提清膏，放置备用；桔梗500重量份、北沙参833重量份、木蝴蝶250重量份和甘草250重量份等五味药材，加10倍量水，煮沸后加入833重量份苦杏仁，煮沸1.5hr，过滤，药渣加10倍量水，煮沸1.5hr，过滤，合并滤液，减压浓缩至55-65℃相对密度为1.09，得水提清膏；合并清膏，混匀，喷雾干燥，得干粉。
制备例2
麻黄100重量份、前胡1000重量份、浙贝母200重量份和百部1000重量份加60％的乙醇8倍，回流3小时，过滤，药渣加60％的乙醇4倍，回流2小时，过滤，合并滤液，减压浓缩至55-65℃相对密度为1.05，得醇提清膏，放置备用；桔梗1000重量份、北沙参200重量份、木蝴蝶500重量份和甘草500重量份等五味药材，加10倍量水，煮沸后加入200重量份苦杏仁，煮沸2hr，过滤，药渣加10倍量水，煮沸2hr，过滤，合并滤液，减压浓缩至55-65℃相对密度为1.09，得水提清膏；合并清膏，混匀，喷雾干燥，得干粉。
制备例3：
麻黄200重量份、前胡550重量份、浙贝母550重量份和百部450重量份加70％的乙醇5倍，回流2小时，过滤，药渣加70％的乙醇3倍，回流2小时，过滤，合并滤液，减压浓缩至55-65℃相对密度为1.05，得醇提清膏，放置备用；桔梗450重量份、北沙参866重量份、木蝴蝶300重量份和甘草200重量份等五味药材，加10倍量水，煮沸后加入850重量份苦杏仁，煮沸1.5hr，过滤，药渣加10倍量水，煮沸1.5hr，过滤，合并滤液，减压浓缩至55-65℃相对密度为1.06，得水提清膏；合并清膏，混匀，喷雾干燥，得干粉。
制备例4：
麻黄400重量份、前胡200重量份、浙贝母1000重量份和百部200重量份加80％的乙醇6倍，回流3小时，过滤，药渣加80％的乙醇3倍，回流2小时，过滤，合并滤液，减压浓缩至55-65℃相对密度为1.08，得醇提清膏，放置备用；桔梗200重量份、北沙参1000重量份、木蝴蝶100重量份和甘草100重量份等五味药材，加8倍量水，煮沸后加入1000重量份苦杏仁，煮沸2hr，过滤，药渣加8倍量水，煮沸2hr，过滤，合并滤液，减压浓缩至55-65℃相对密度为1.09，得水提清膏；合并清膏，混匀，喷雾干燥，得干粉。
实施例2组合物对Vero细胞的毒性
1.材料与方法
1.1细胞与培养方法
采用非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)为细胞模型(由军事医学科学院微生物流行病研究所提供，下同)，采用含10％胎牛血清(购自Gibco公司)的DMEM培养基(购自江苏凯基生物技术股份有限公司)，置于37℃、5％ CO2培养箱中培养，当细胞生长至90％密度后传代，细胞传代比例1/3-1/4。
1.2受试药物
中药组合物干膏粉，按照制备例1所述的处方比例制备。
1.3试剂
MTS细胞增殖定量检测试剂盒(购自Promega公司)。
1.4仪器
微孔板读数仪(购自Perkin Elmer公司，型号：EnSpire，下同)；倒置显微镜(购自Olympus公司，型号：CKX41，下同)；二氧化碳培养箱(购自Forma Scientific公司，型号：Forma Steri-Cycle 371，下同)；生物安全柜(购自上海洁佳空气净化技术有限公司，下同)。
1.5实验设计
取培养至90％密度的Vero细胞，0.25％胰酶消化后，用含10％胎牛血清的DMEM培养基调整细胞密度至1×105个·mL-1，每孔接种100μL细胞悬液于96孔板中。加入200μL不同浓度的含药DMEM培养基(干膏粉浓度从3200mg/L起连续2倍梯度稀释5个梯度，共计6个给药浓度，胎牛血清终浓度为2.5％)作为样品组，同时设置对照组(培养基中不含任何受试药物)，各组处理含3个复孔，CO2培养箱中培养72h后进行细胞增殖定量检测，用微孔板读数仪于490nm处检测各孔吸光值(A)。以[A(样品组)/A(对照组)]×100％作为各组处理的细胞存活率，计算组合物对Vero细胞的半数毒性浓度(TC50)。
1.6统计学处理
所有数据均用SPSS 19.0统计软件处理，实验数据以均值±标准误表示，组间数据比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异具有统计学意义。
2.结果
表1组合物对Vero细胞活力的影响(％，均值±标准误，n＝3)
Figure BDA0001433773620000081
注：*表示各样品组数据与对照组相比，在P<0.05的水平上具有显著差异。
本研究明确了该中药组合物对Vero细胞的毒性情况，如表1所示，该组合物干膏粉对Vero细胞的毒性作用呈明显的量效关系，细胞活力随给药浓度提高而逐步降低，表明其细胞毒性逐步增加，根据表1数据计算得该中药组合物对Vero细胞TC50＝893.2mg/L。
用同样方法求得制备例2～制备例4的组合物对Vero细胞TC50分别为674.1mg/L、725.7mg/L和1025.6mg/L。
实施例3组合物对EV71和CoxA16病毒感染的抑制作用
1.材料与方法
1.1细胞与培养方法
采用非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)为细胞模型，采用含10％胎牛血清的DMEM培养基，置于37℃、5％CO2培养箱中培养，当细胞生长至90％密度后传代，细胞传代比例1/3-1/4。
1.2病毒株
EV71病毒BJ09/07株，GenBank登录号JQ319054.1；CoxA16病毒TS10/08株，GenBank登录号JX068829，均由军事医学科学院微生物流行病研究所提供，下同。临用前测定EV71病毒半数细胞病变剂量(TCID50)为108/mL，CoxA16 TCID50为108.5/mL。
1.3受试药物
中药组合物干膏粉，按照制备例1所述的处方比例制备。
1.4试剂
MTS细胞增殖定量检测试剂盒；总RNA提取试剂盒(TRIzol法)(购自美国Invitrogen公司)；反转录试剂盒Prime ScriptTM(购自宝生物工程(大连)有限公司)；肠道病毒71型及柯萨奇病毒16型核酸联合测定试剂盒(荧光PCR法)(购自上海之江生物科技股份有限公司)。
1.5仪器
微孔板读数仪；倒置显微镜；二氧化碳培养箱；生物安全柜；普通PCR仪(购自ABI公司，型号：2720)；荧光定量PCR仪(购自ABI公司，型号：StepOne PlusTM)。
1.6实验设计
1.6.1EC50和选择指数SI的计算
取培养至90％密度的Vero细胞，0.25％胰酶消化后，用含10％胎牛血清的DMEM培养基调整细胞密度至1×105个·mL-1，每孔接种100μL细胞悬液于96孔板中。加入50μLCoxA16或EV71病毒悬液(100TCID50)，加入50μL不同浓度的含药DMEM培养基(干膏粉浓度从800mg/L开始以2倍梯度连续稀释5个浓度，共计6个给药浓度，胎牛血清终浓度为2.5％)，同时设置对照组(既不含病毒也不含药)和模型组(仅含病毒)，各组处理含3个复孔，CO2培养箱中培养72h后进行细胞增殖定量检测，用微孔板读数仪于490nm处检测各孔吸光值(A)。以[A(样品组)-A(模型组)]/[A(对照组)-A(模型组)]×100％作为各组的抑制率，计算样品对CoxA16和EV71病毒的半数最大效应浓度(EC50)和选择指数(SI＝TC50/EC50)。
1.6.2研究感染细胞病毒载量
取培养至90％密度的Vero细胞，0.25％胰酶消化后，用10％胎牛血清的DMEM培养基调整细胞密度至2×105个·mL-1，每孔接种1mL于6孔板中，加入1mL含2000TCID50CoxA16或EV71病毒的DMEM培养基以及干膏粉(终浓度为400mg/L)，同时设置对照组(既不含病毒也不含药)和模型组(仅含病毒)，各组处理含2个复孔，CO2培养箱中培养8h后参照试剂盒说明书分别提取RNA，合成cDNA以及检测病毒载量。
1.7统计学处理
所有数据均用SPSS 19.0统计软件处理，实验数据以均值±标准误表示，组间数据比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异具有统计学意义。
2.结果
2.1组合物对EV71和CoxA16病毒的抑制作用
表2组合物对EV71和CoxA16病毒的抑制率(％，均值±标准误，n＝3)
Figure BDA0001433773620000101
本研究探讨了中药组合物对EV71和CoxA16病毒的抑制作用，如表2所示，干膏粉对EV71和CoxA16病毒的抑制呈剂量依赖效应，抑制率随给药剂量的增加逐渐提高到最高值后趋于稳定，其中400mg/L浓度的病毒抑制效果最佳。当给药浓度达到800mg/L时，细胞活力逐步降低，推测与该样品细胞毒性有关。根据表2中数据计算得中药组合物抑制EV71病毒半EC50＝209.7mg/L，SI＝4.3，抑制CoxA16病毒EC50＝154mg/L，SI＝5.8。
用同样方法求得制备例2的组合物抑制EV71病毒EC50＝246.8mg/L，SI＝2.7，抑制CoxA16病毒EC50＝184.5mg/L，SI＝3.6，；制备例3的组合物抑制EV71病毒EC50＝192.2mg/L，SI＝3.8，抑制CoxA16病毒EC50＝186.8mg/L，SI＝3.9；制备例4的组合物抑制EV71病毒EC50＝227.5mg/L，SI＝4.5，抑制CoxA16病毒EC50＝216.5mg/L，SI＝4.7。
2.2组合物对EV71和CoxA16病毒复制的抑制作用
表3组合物对EV71和CoxA16病毒复制的抑制作用(均值±标准误，n＝6)
Figure BDA0001433773620000111
注：ND表示未检出；*表示各组数据与对照组相比，在P<0.05的水平上具有显著差异
本研究探讨了组合物对EV71和CoxA16病毒复制的抑制作用，如表3所示，400mg/L的组合物干膏粉能够显著抑制细胞内EV71和CoxA16病毒复制，降低病毒载量，表明该中药组合物具有促进病毒转阴的作用。用同样方法验证了制备例2～制备例4的组合物，也具有类似的有益作用，能够显著抑制细胞内EV71和CoxA16病毒复制，降低病毒载量，表明该中药组合物具有促进病毒转阴的效果。
实施例4组合物的抗病毒谱研究
1.材料与方法
1.1细胞与培养方法
采用非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)为细胞模型，取传代次数为130～145之间的细胞用于实验。细胞采用含10％胎牛血清的DMEM培养基，置于37℃、5％CO2培养箱中培养，当细胞生长至90％密度后传代，传代比例1/3-1/4。
1.2病毒株
柯萨奇病毒A组4、5、7、9和10型(CoxA4、CoxA5、CoxA7、CoxA9和CoxA10)，柯萨奇病毒B组2和5型(CoxB2和CoxB5)以及埃可病毒(ECHO)。临用前测定各病毒TCID50分别为108、107.5、107、106、108.5、107.5、107和107.5/mL，上述病毒均由中科院武汉病毒研究所提供。
1.3受试药物
中药组合物干膏粉，按照制备例1所述的处方比例制备。
1.4试剂
MTS细胞增殖定量检测试剂盒。
1.5仪器
微孔板读数仪；倒置显微镜；二氧化碳培养箱；生物安全柜。
1.6实验设计
取培养至90％密度的Vero细胞，0.25％胰酶消化后，用含10％胎牛血清的DMEM培养基调整细胞密度至1×105个·mL-1，每孔接种100μL细胞悬液于96孔板中，加入50μL病毒悬液(100TCID50)，加入50μL含药DMEM培养基(干膏粉浓度从800mg/L开始以2倍梯度连续稀释5个浓度，共计6个给药浓度，胎牛血清终浓度为2.5％)，同时设置对照组(培养基中既不含病毒也不含药)和模型组(仅含病毒)，各组处理含3个复孔，CO2培养箱中培养72h后进行细胞增殖定量检测，用微孔板读数仪于490nm处检测各孔吸光值(A)。以[A(样品组)-A(模型组)]/[A(对照组)-A(模型组)]×100％作为各组处理的抑制率，计算该中药组合物对各病毒株的EC50和SI。
1.7统计学处理
所有数据均用SPSS 19.0统计软件处理。
2.结果
表4组合物对多种手足口病毒的EC50和SI
Figure BDA0001433773620000131
如表4所示，该组合物对多种能够引起手足口病症状的病毒均具有明显的抑制作用，EC50从138.4-219.6mg/L不等。本实施例表明，制备例1中的组合物膏粉在抑制手足口病毒方面具有广谱性。
用同样方法以制备例2～制备例4的组合物进行实验，发现制备例2组合物抑制各株病毒的EC50从198.3～267.4mg/L不等；制备例3组合物抑制各株病毒的EC50从174.4～260.4mg/L不等；制备例4组合物抑制各株病毒的EC50从151.5～243.7mg/L不等，表明上述三个组合物在抑制手足口病毒方面具有广谱性。
实施例5组合物治疗给药时对病毒感染小鼠生存时间、抑制小鼠死亡和炎症因子释放的影响
1.材料与方法
1.1动物
5日龄ICR小鼠，购自北京维通利华实验动物有限公司。
1.2病毒株
EV71病毒BJ09/07株，GenBank登录号JQ319054.1，CoxA16病毒TS10/08株，GenBank登录号JX068829。临用前测定EV71病毒半数细胞病变剂量(TCID50)为108/mL，CoxA16病毒TCID50为108.5/mL。
1.3试剂与耗材
中药组合物干膏粉，按照制备例1所述的处方比例制备，利巴韦林口服液(缩写：RBV，购自辅仁药业集团有限公司)、一次性无菌注射器、灌胃针、生理盐水。细胞因子白细胞介素-6(IL-6)ELISA测定试剂盒(购自eBioscience公司)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)ELISA测定试剂盒(购自eBioscience公司)和单核细胞趋化因子-1(MCP-1)ELISA测定试剂盒(购自eBioscience公司)。
1.4实验方法
(1)病毒悬液配制：根据病毒TCID50值，临用前采用DMEM培养基将两病毒分别稀释至107TCID50/mL。
(2)药液配制：干膏粉采用生理盐水稀释至所需剂量，0.22μm微孔滤膜过滤后待用。利巴韦林注射液于临用前摇匀开瓶，采用生理盐水稀释至所需剂量(0.32g/kg)。
(3)分组、造模与给药：5日龄小鼠按照表5进行分组、造模及给药。分组：小鼠随机分为11组：空白对照组、EV71模型组和CoxA16模型组、中药组合物高、中和低剂量组(4、2和1g/kg)，利巴韦林组(RBV，0.32g/kg)，每组含13只小鼠。造模：各组小鼠腹腔注射EV71或CoxA16病毒悬液，每只0.1mL，空白对照组以注射生理盐水代替。给药：造模结束后，每只小鼠进行灌胃给药(空白对照组、EV71模型组和CoxA16模型组以生理盐水代替)，每次0.1mL，每日1次，连续给药14日。造模后第6天每组各取3只小鼠，摘眼球处死取血清测定细胞因子IL-6、TNF-α和MCP-1含量(这3只小鼠因提前处死，故未计入终点生存情况)。动物实验过程的所有操作，都根据科技部2006年颁布的《关于善待动物的指导性意见》进行。
(4)统计指标：每日记录小鼠存活情况，统计小鼠死亡率、平均生存时间和各细胞因子含量。
2.结果
表5组合物治疗给药对EV71和CoxA16病毒导致的小鼠死亡的影响(n＝10)
Figure BDA0001433773620000151
注：
Figure BDA0001433773620000152
和*表示该组数据与EV71模型组相比，P<0.05；$和#表示该组数据与CoxA16模型组相比，P<0.05。
如表5所示，与阳性药利巴韦林注射液相似，该中药组合物中剂量组(2g/kg)明显抑制EV71病毒导致的小鼠死亡，显著延长小鼠的存活时间达42.9％；组合物中剂量(2g/kg)明显抑制CoxA16病毒导致的小鼠死亡，显著延长小鼠的存活时间达47.4％。同时，其他各剂量也具有相似的药效，不同程度地缓解病毒导致的小鼠死亡，延长小鼠存活时间。
表6小鼠血清细胞因子含量(ng/L，n＝3)
Figure BDA0001433773620000153
Figure BDA0001433773620000161
注：*和#分别表示该组数据与EV71模型组和CoxA16模型组相比P<0.05。&和Δ分别表示该组数据与EV71+RBV组合CoxA16+RBV相比P<0.05。
如表6所示，EV71病毒感染导致小鼠血清中IL-6、TNF-α和MCP-1含量异常升高，中药组合物高、中和低剂量组(4、2和1g/kg)不同程度地抑制EV71病毒或CoxA16病毒导致的小鼠细胞因子升高(P<0.05)，显著优于阳性药利巴韦林注射液的抑制效果；以中剂量组(2g/kg)抑制效果最为明显，其明显抑制EV71和CoxA16病毒导致的小鼠细胞因子升高(P<0.05)。
由表5和表6表明：该中药组合物治疗性给药能够显著降低EV71和CoxA16病毒致小鼠死亡率，延长小鼠存活时间，并显著抑制病毒导致的炎症因子释放，缓解炎症。
实施例6组合物预防给药时对病毒感染小鼠生存时间、抑制小鼠死亡和炎症因子释放的影响
1.材料与方法
1.1动物
2日龄ICR小鼠，购自北京维通利华实验动物有限公司。
1.2病毒株
EV71病毒BJ09/07株，GenBank登录号JQ319054.1，CoxA16病毒TS10/08株，GenBank登录号JX068829。临用前测定EV71病毒半数细胞病变剂量(TCID50)为108/mL，CoxA16病毒TCID50为108.5/mL。
1.3试剂与耗材
中药组合物干膏粉，按照制备例1所述的处方比例制备，利巴韦林口服液(缩写：RBV，购自辅仁药业集团有限公司)、一次性无菌注射器、灌胃针、生理盐水。细胞因子白细胞介素-6(IL-6)ELISA测定试剂盒(购自eBioscience公司)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)ELISA测定试剂盒(购自eBioscience公司)和单核细胞趋化因子-1(MCP-1)ELISA测定试剂盒(购自eBioscience公司)。
1.4实验方法
(1)病毒悬液配制：根据病毒TCID50值，临用前采用DMEM培养基将两病毒稀释至107TCID50/mL。
(2)药液配制：干膏粉采用生理盐水稀释至所需剂量。利巴韦林口服液临用前摇匀开瓶，采用生理盐水稀释至所需剂量(0.32g/kg)。
(3)分组、造模与给药：2日龄小鼠按照表7进行分组、造模及给药。分组：小鼠随机分为11组：空白对照组、EV71模型组和CoxA16模型组、组合物高、中和低剂量组(8、4和2g/kg)以及利巴韦林组(RBV，0.32g/kg)，每组含13只小鼠。给药：每只小鼠进行灌胃给药(空白对照组、EV71模型组和CoxA16模型组以生理盐水代替)，每次0.1mL，每日1次，连续给药7日。造模：初次给药3天后，各组小鼠分别腹腔注射EV71或CoxA16病毒悬液，每只0.1mL，空白对照组以注射生理盐水代替。造模后第6天每组各取3只小鼠，摘眼球处死取血清测定细胞因子IL-6、TNF-α和MCP-1含量(这3只小鼠因提前处死，故未计入终点生存情况)。动物实验过程的所有操作，都根据科技部2006年颁布的《关于善待动物的指导性意见》进行。
(4)统计指标：每日记录小鼠存活情况，统计小鼠死亡率、平均生存时间和各细胞因子含量。
2.结果
表7口服给药对EV71和CoxA16病毒导致的小鼠死亡的影响(n＝10)
Figure BDA0001433773620000171
Figure BDA0001433773620000181
注：
Figure BDA0001433773620000182
和*表示该组数据与EV71组相比，P<0.05；$和#表示该组数据与CoxA16组相比，P<0.05。
如表7所示，与阳性药利巴韦林口服液相似，中药组合物中剂量组(4g/kg)明显抑制EV71病毒导致的小鼠死亡，显著延长小鼠的存活时间达36.1％；中药组合物中剂量(4g/kg)明显抑制CoxA16病毒导致的小鼠死亡，显著延长小鼠的存活时间达46.2％。同时，其他各剂量也具有相似的药效，不同程度地缓解病毒导致的小鼠死亡，延长小鼠存活时间。
表8小鼠血清细胞因子含量(ng/L，n＝3)
Figure BDA0001433773620000183
注：*和#分别表示该组数据与EV71和CoxA16组相比P<0.05。&和Δ分别表示该组数据与EV71+RBV组合CoxA16+RBV相比P<0.05。
如表8所示，EV71病毒感染导致小鼠血清中IL-6、TNF-α和MCP-1含量异常升高，中药组合物高、中和低剂量组(8、4和2g/kg)不同程度地抑制EV71病毒或CoxA16病毒导致的小鼠细胞因子升高(P<0.05)，显著优于阳性药利巴韦林口服液的抑制效果；以中剂量组(4g/kg)抑制效果最为明显，其显著抑制EV71和CoxA16病毒导致的小鼠细胞因子升高(P<0.05)。
由表7和表8数据表明：该中药组合物预防性给药能够明显降低EV71和CoxA16病毒致小鼠死亡率，延长小鼠存活时间，并显著抑制病毒导致的炎症因子释放，缓解炎症。
上述实验表明，本发明提出的组合物能够抑制EV71和CoxA16病毒感染，呈剂量依赖效应；实现干预病毒感染早期事件，抑制病毒复制，降低感染细胞内EV71和CoxA16病毒载量，促进病毒转阴的作用；其在抗手足口病病毒方面具有广谱性，对能够引起手足口病症状的病毒柯萨奇病毒A组4、5、7、9和10型，柯萨奇病毒B组2和5型以及埃可病毒均具有明显的抑制作用；动物实验证明了该组合物还能缓解病毒引起的症状、减轻或消除病毒感染导致的炎症和死亡等；延长感染病毒小鼠生存时间，提高小鼠存活率，平抑病毒感染导致的炎症因子释放。此外，该组合物的给药方式多样化，既可以治疗性给药，也可以预防性给药。
综上所述，本发明所述中药组合物可以作为新的手足口病药治疗或预防药物，为治疗或预防手足口病提供一种新的途径和手段。
需要进一步指出的是，本发明实施例中使用的各病毒，仅是为了举例说明本发明所述的中药组合物的处方组成及其对肠道病毒71型、柯萨奇病毒A组16型感染Vero细胞的保护及抑制病毒复制作用，对能够引起手足口病症状的病毒柯萨奇病毒A组(包括但不限于4、5、7、9和10型)、柯萨奇病毒B组(包括但不限于2和5型)以及埃可病毒均具有明显的抑制作用，能够缓解肠道病毒71型、柯萨奇病毒A组16型导致的小鼠死亡，抑制病毒导致的炎症因子释放，缓解炎症等症状”，但使用的各病毒并不局限于该来源。本领域技术人员应该清楚，只要使用具有相应致病性的且鉴定为肠道病毒71型、柯萨奇病毒A组4、5、7、9、10型和16型、柯萨奇病毒B组2和5型、埃可病毒的病毒，均适用于本发明。

Claims (6)

1.一种组合物在制备治疗或预防手足口病药物中的应用，其中，该组合物由下述原料药制成：
Figure FDA0001433773610000011
2.根据权利要求1所述的应用，所述组合物由下述原料药制成：
Figure FDA0001433773610000012
3.根据权利要求1所述的应用，所述组合物由下述原料药制成：
Figure FDA0001433773610000013
4.根据权利要求1所述的应用，所述治疗或预防手足口病药物选自口服给药剂型、注射给药剂型或外用给药制剂。
5.一种组合物在制备治疗或预防肠道病毒71型、柯萨奇病毒A组16型、柯萨奇病毒A组4型、柯萨奇病毒A组5型、柯萨奇病毒A组7型、柯萨奇病毒A组9型、柯萨奇病毒A组10型、柯萨奇病毒B组2型、5型或埃可病毒所引起疾病的药物中的应用，其中，该组合物由下述原料药制成：
Figure FDA0001433773610000021
6.根据权利要求5所述的应用，所述组合物由下述原料药制成：
Figure FDA0001433773610000022
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