CN102198192B - 一种防治甲流的中药组合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种防治甲流的中药组合物，由质量配比如下的组分组成：荆芥1～5份；防风1～5份；前胡1～5份；板蓝根1～5份；大青叶1～5份；杏仁1～5份；白芷1～5份；陈皮1～5份；生甘草1～5份。本发明所述的中药组合物的有益效果主要体现在：本发明组合物处方精简、配伍合理，不仅疗效肯定，弥补了中、西药治疗甲流的不足，而且稳定性高、使用方便，制成颗粒冲剂体积小，重量轻，解决了临床中汤剂的制备麻烦、携带不便、不易保存、服用困难等问题，并且药物含量成分明确，避免了中药汤剂组分不明的缺点，保障了用药安全，实为一种有效的、应用前景良好的新型药物。

Description

一种防治甲流的中药组合物及其应用

(一)技术领域

本发明涉及一种防治甲流的中药组合物及其应用。

(二)背景技术

流行性感冒，简称流感，是由流行性感冒病毒引起的一种人兽共患的急性呼吸道传染病。主要通过空气飞沫经呼吸道传播，具有高度的传染性，发病时出现急起高热、恶寒、全身酸痛、乏力和呼吸道症状。其以病程短、传染性强、发病率高为特点，是对人类健康威胁最大和人类至今尚不能有效控制的世界性传染病之一。

对流感病毒的预防和治疗主要有疫苗和化学合成药。由于流感病毒的抗原变异能力极强且相当频繁，使得疫苗效果不稳定，对易感人群的保护率不高；况且疫苗只对已知的流感病毒亚型有预防作用，对由于抗原性漂移或转换所产生的新型流感病毒无效。现有抗病毒药离子通道阻断剂和神经氨酸酶抑制剂正式应用于临床，但耐药性及严重毒副作用的产生限制了其在临床上的广泛应用；流感病毒吸附抑制剂、细胞-病毒膜融合抑制剂和反义核苷酸等还处于实验室研究阶段，至今尚缺乏理想的抗病毒药物。因此开发安全有效的抗流感病毒新药是当前医学界面临的重要课题。

(三)发明内容

本发明目的即是为了提供一种疗效肯定、性效稳定，质优价廉、应用广泛的防治甲流的中药组合物及其应用。

本发明采用的技术方案是：

一种防治甲流的中药组合物，由质量配比如下的组分组成：荆芥1～5份；防风1～5份；板蓝根1～5份；大青叶1～5份；前胡1～5份；杏仁1～5份；白芷1～5份；陈皮1～5份；生甘草1～5份。

优选的，所述组合物质量配比如下：荆芥5份；防风5份；板蓝根5份；大青叶5份；前胡5份；杏仁5份；白芷5份；陈皮5份；生甘草5份。

方中荆芥和防风辛散气香，均长于发表散风，且微温不烈，药性和缓，表寒表热皆可用之，《本草纲目》载荆芥：“其功长于祛风邪，散瘀血，破结气，消疮毒”；《本草汇言》：“用防风辛温轻散，润泽不燥，能发邪从毛窍出”。两者相须为用，其效益彰，《本草求真》指出“用以防风之必兼用荆芥者，以其能入肌肤宣散故耳-------糜不藉其轻扬，以为宣泄之具”。更有白芷芳香浓烈，味辛力厚，善通肌肤、透毛窍，祛风散寒，为解表通腠之良药，《本草汇言》：“白芷，上行头目，下抵肠胃，中达肢体，遍通肌肤以至毛窍，而利泄邪气”。上述三药相伍为用，解表散邪之力尤著。

板蓝根、大青叶苦寒，既清肺胃心经实火，又善解瘟疫时毒，并能凉血消斑，《本草便读》：“板蓝根功用性味与靛青叶同，能入肝胃血分，不过清热、解毒、辟疫、杀虫四者而已。但叶主散，根主降，此又同中之异耳”。生甘草得中和之性，能调和药性，又可缓和脾胃，也有清热解毒之功，《药品化义》：“甘草，生用凉而泻火，主散表邪，消痈肿，利咽痛，解百药毒，除胃积热”。五药合用，使疫毒得清、里热得解，以截断疾病传变之路，防止外邪化热造成种种变证。

前胡苦辛微寒，能开宣肺气、降气化痰，《本草纲目》：“前胡乃手足太阴、阳明之药，其功长于下气-------气下则火降，痰亦降矣”。杏仁主入肺经，味苦能降，且兼疏利开通之性，降肺气之中兼有宣肺之功而达止咳平喘之能，《长沙药解》：“杏仁疏利开通，破壅降逆，善于开痹而止喘，消肿而润燥，调理气分之郁，无以易此”。陈皮辛行苦泄而能宣肺止咳，《本草求真》：“陈皮有散痰、开痰理气之功”。

上述九味药物联合应用，清热解毒，宣肺解表，则邪去正安，诸症尽除。

从抗病毒药物的传统功效分布来看，具有直接抗病毒感染活性的单味中草药以清热解毒类药物居多，现代药理和临床实践证明，大青叶、板蓝根、鱼腥草、金银花、连翘、野菊花、黄芩、黄连、柴胡、黄柏、甘草等几十种单味中药具有显著的抗流感病毒作用，并从这些中药当中已经提取分离得到抗流感病毒的活性成分。

板蓝根长期以来一直用于预防和治疗流感、流脑、肝炎、腮腺炎、丹毒等病证，尤其是在预防和治疗流感方面效果显著。试管和鸡胚实验证明，50％板蓝根注射液对流感病毒PR8株及京科68-1株有明显的抑制作用，100％板蓝根煎剂有延缓京科68-1株和腺病毒-T型所致细胞病变作用。以鸡胚法考察15个种质的板蓝根对甲型流感病毒的抑制作用，血凝滴度实验显示，板蓝根的水提醇沉液对病毒的直接作用、治疗作用、预防作用有效率分别为100％、60％、70％。在对板蓝根抗病毒有效部位的筛选实验中，表明板蓝根抗流感病毒有效部位为阳离子树脂吸附部分，并进一步证实有效部位为结合氨基酸。板蓝根生物碱成分中的4(3H)-喹唑酮经药理实验证明具有抑制流感病毒、柯萨奇病毒的活性。在对板蓝凝集素粗提液抗流感病毒的研究中发现，板蓝根凝集素对流感病毒具有显著的直接杀灭作用和预防作用及良好的治疗作用，而且抑制流感病毒的效果与板蓝根凝集素血凝活性的高低有关。

大青叶和板蓝根一样都是优良的广谱抗病毒中草药，对多种病毒有直接抑制作用，试验证实大青叶在抗甲型流感病毒方面疗效显著，与大青叶抗病毒作用相关的化学成分主要是4(3H)喹唑酮。目前对其抗病毒作用机制尚无定论，一般认为大青叶是通过多种有效成分，多环节、多途径地发挥协同作用而表现出抗病毒功效。

早在1979年Pompei等就发现甘草酸有抗病毒活性，能抑制很多不相关的DNA、RNA病毒的生长，并且不影响正常细胞的活性。对甘草酸影响感染A2型流感病毒小鼠存活率的研究表明实验组小鼠存活都超过了21天，而对照组小鼠没有存活超过21天的(平均存活时间10.5天)，在肺组织实变程度及被感染小鼠肺组织病毒值方面，实验组也明显低于对照组。

现代药理试验证实，荆芥、防风、白芷和陈皮等药物亦有一定的抗病毒活性和抗病原微生物作用，能够保护细胞不受病毒侵袭。

本发明还涉及所述中药组合物在制备防治甲流的药物中的应用。

所述药物可制成下列之一的剂型：(1)颗粒剂、(2)片剂、(3)口服液、(4)胶囊剂，可由所述中药组合物经提取后添加合适的辅料制成。

优选的，所述药物为颗粒剂，制备所述颗粒剂的中药原料质量组成为：荆芥1～5份；防风1～5份；板蓝根1～5份；大青叶1～5份；前胡1～5份；杏仁1～5份；白芷1～5份；陈皮1～5份；生甘草1～5份；所述颗粒剂由如下方法制得：将配方量的中药原料加水浸没浸渍0.5～1小时，煎煮2次，每次1～2小时，合并两次煎液，过滤，滤液浓缩至相对密度为1.08～1.12，冷却后加乙醇至乙醇体积含量为60％，充分搅拌，冷藏静置12小时以上，取醇沉上清液，过滤，滤液减压回收乙醇，继续浓缩至相对密度为1.34～1.40清膏，取清膏加入质量为清膏质量1.5～2.0倍的淀粉，搅匀、制粒、干燥、整粒，混匀，即得所述颗粒剂。

本发明依据祖国中医传统理论对时疫流行感冒的致病机理和治疗原则的论述和理解，结合现代医学成果，精选具有清热解毒，宣肺解表功效的纯中草药，经科学炮制，制成药物制剂，用于抑制和消除流感病毒。

本发明所述的中药组合物的有益效果主要体现在：本发明组合物处方精简、配伍合理，不仅疗效肯定，弥补了中、西药治疗甲流的不足，而且稳定性高、使用方便，制成颗粒冲剂体积小，重量轻，解决了临床中汤剂的制备麻烦、携带不便、不易保存、服用困难等问题，并且药物含量成分明确，避免了中药汤剂组分不明的缺点，保障了用药安全，实为一种有效、应用前景良好的新型药物。

(四)附图说明

图1为含药血清体外抑制甲型流感病毒作用研究；其中a为正常MDCK细胞，b为病毒对照孔CPE，c为空白血清对照孔CPE，d为防感颗粒低剂量孔CPE，e为防感颗粒中剂量孔CPE，f为防感颗粒高剂量孔CPE，g为达菲血清对照孔CPE。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：

处方：

工艺：

将以上诸药加水过药面浸渍0.5小时，煎煮二次，第一次1.5小时，第二次1小时，合并两次煎液，过滤，滤液经单效外循环浓缩器浓缩至相对密度为1.08(60℃)，冷却后加乙醇至含醇量(v/v)达60％，充分搅拌，冷藏静置12小时；次日取醇沉上清液，过滤，滤液减压回收乙醇，继续浓缩至相对密度约为1.38(60℃)的清膏；按质量为清膏质量1.8倍加入淀粉搅匀、制粒、干燥(80℃以下)、整粒，混匀制成600g(即每g含处方药材1.66g)，包装即得颗粒剂，即防感颗粒。

实施例2：含药血清体外抑制甲型流感病毒作用研究

一、材料与方法

(一)实验材料

1.各组大鼠血清：取清洁级SD大鼠36只，雌雄各半，体重200±20g，按体重分层随机分为正常(空白)对照组、防感颗粒低剂量组、中剂量组、高剂量组、达菲对照组，每组6只，雌雄分笼喂养。按体型系数换算法(2)进行实验动物与人用药量的换算，防感颗粒(按实施例1方法制得)低剂量组给药剂量为10.21g/kg，相当于临床等效剂量；中剂量组给药量为低剂量组的2倍，即20.42g/kg；高剂量组为低剂量组的5倍，即51.05g/kg；达菲对照组给药剂量0.02g/kg，分别灌胃给药，正常对照组以生理盐水灌胃，每天2次，每次1ml/100g，连续给药共3天，末次给药后1h腹主动脉无菌采血。大鼠以3％戊巴比妥腹腔麻醉后，用75％酒精腹部浸泡消毒5分钟，沿腹正中线皮肤剪开腹腔，使腹主动脉暴露，用无菌注射器吸取血液，血样置于无菌离心管中，静置2h以上，待血块收缩良好后，3000r/min 15min在超净工作台上无菌分离血清，经56℃、30min灭活处理，-20℃冰箱冻存备用。

2.单层MDCK细胞制备：MDCK细胞由浙江省疾病预防与控制中心病毒所提供。RPMI1640生长液含10％胎牛血清、100Iu/ml双抗；RPMI1640维持液不含胎牛血清、其它同生长液。

3.病毒：甲1型流感病毒株A/PR/8/34(H1N1)，由浙江省疾病预防与控制中心病毒所提供，在9日龄鸡胚中增殖复壮，收集尿囊液，-70℃超低温冰箱冻存备用。

4.主要试剂：

RPMI1640                批号8108008        美国GIBCO公司；

胎牛血清                批号080412         杭州四季青生物工程材料有限公司；

双抗                    批号274564         美国GIBCO公司；

0.25％胰酶-0.02％EDTA   批号08061201       杭州吉诺生物医药技术有限公司；

PBS(PH7.2±0.1)         批号08070302       GIBCO杭州吉诺生物医药技术有限公司；

MTT                     批号1324837        Amersco上海生工生物工程有限公司；

DMSO                    批号01541345       Amersco杭州荧光泰生物技术有限公

司；

乳酸脱氢酶(LDH-L)试剂盒批号11342 德国prodia diagnostics公司；

1.2％豚鼠红细胞悬液     自备。

5.主要设备：

倒置相差显微镜(Leica DC-300)      Made in Germany；

超低温冰箱(Forma 8525)            Made in USA；

生物安全柜(Forma ClassII)         Made in USA；

CO₂恒温培养箱(Forma Class100)     Made in USA；

25cm²细胞培养瓶(Corning Flask)    Made in USA；

96孔细胞培养板(Becton)            Made in USA；

酶标仪(BioTek ELX808)             Made in USA；

微孔板震荡仪(MH-1)                海门市其林贝尔仪器制造有限公司；

AEROSET全自动生化分析仪系统(Abbott)    Made in USA；

(二)实验方法

1.甲型流感病毒半数组织细胞感染量(TCID50)测定：

以不含胎牛血清的RPMI1640维持液将病毒10倍递增稀释为10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8 8个不同稀释度，分别加至长满单层MDCK细胞的96孔细胞培养板上，每个浓度病毒稀释液接种6孔，每孔100ul，同时设正常细胞对照孔，37℃、5％CO₂恒温培养箱中孵育2h，弃病毒液，用PBS洗板2次，然后各孔再加入100ul维持液，每日倒置显微镜下观察细胞病变情况，连续3天，采用Reed-Muench法计算病毒的半数组织细胞感染量(TCID50)。

2.含药血清对甲型流感病毒增殖抑制作用(治疗给药方式，先感染病毒再给含药血清)：

预先用96孔细胞培养板将MDCK细胞培养成单层，每孔接种100TCID50甲1型流感病毒液100ul，于37℃、5％CO₂培养箱中吸附2h感染细胞，弃病毒液，用PBS洗板2次。取已制备好的终浓度均为1∶8的正常(空白)对照组、各剂量组防感颗粒、达菲对照组血清分别加入已经感染的细胞板中，每孔100ul，每份血清平行测定2孔，同时设正常细胞和病毒对照孔，37℃、5％CO₂恒温培养箱中孵育2h，弃血清，用PBS洗板2次，然后各孔再加入100ul维持液，每日到置显微镜下观察细胞病变效应(CPE)进展情况。当病毒对照孔出现+++以上病变时(图1)，每孔加入MTT(终浓度0.5mg/ml)20ul，37℃、5％CO₂孵育4h，弃去上清液，每孔加入DMSO150ul并以微孔板震荡机振荡作用10min，待颗粒完全溶解后，酶标仪490nm测吸光度值(OD值)，空白孔调零，计算病毒抑制率。

病毒抑制率％＝(各实验组平均OD值-病毒对照孔平均OD值)/(正常细胞对照孔平均OD值-病毒对照孔平均OD值)x100％

3.含药血清对甲型流感病毒吸附细胞的影响(预防给药方式，先给含药血清后感染病毒)：

将已制备好的正常(空白)对照组、各剂量组防感颗粒、达菲对照组血清(终浓度均为1∶8)加入已经长成单层细胞的培养板中，每份血清2孔，每孔100ul，同时设正常细胞和病毒对照孔，恒温培养箱中孵育2h，弃去血清，再接入100TCID50甲1型流感病毒液每孔100ul，同2.法培养与检查。

4.含药血清对甲型流感病毒的直接杀灭作用(含药血清与病毒同时作用)：

将正常(空白)对照组、各剂量组防感颗粒、达菲对照组血清(终浓度均为1∶8)分别与100TCID50甲1型流感病毒液等量混合，恒温培养箱中作用2h，将混合液加至已长满单层MDCK细胞的培养板上，同2.法培养与检查。

5.含药血清对甲型流感病毒感染MDCK细胞膜通透性的影响：

另外取96孔细胞培养板将MDCK细胞培养成单层后，同上法将各组血清以上述3种不同给药方式分别作用于细胞，当病毒对照孔出现+++以上病变时，从实验各孔取50ul上清液到1.5ml Eppendorf管中，在Eppendorf管中先加入含缓冲基质液的检测试剂1.0ml 37℃混合反应5min、再加入含辅酶I溶液的试剂0.5ml混合延迟1min，AEROSET全自动生化分析仪系统检测乳酸脱氢酶活性，于340nm处分别读取吸光度A值至2min，计算LDH值。LDH(U/L)＝(ΔA/min样品-ΔA/min空白)/(ΔA/min标准-ΔA/min空白)×标准液浓度。

6.含药血清对甲型流感病毒血凝效价的影响：

从2.5.实验各孔另取25ul上清液到96孔u型微量反应板中，在反应板中加入已配制好的1.2％豚鼠红细胞悬液25ul，轻轻混匀后室温放置45min，观测血凝活性。各孔出现红细胞凝集程度以++++、+++、++、+、-表示，红细胞呈细砂粒状均匀铺于孔底者为++++，即100％凝集；红细胞均匀铺于孔底，但边缘不整而稍向孔底集中者为+++，即75％凝集；红细胞于孔底形成一个环状，四周有小凝集块者为++，即50％凝集；红细胞于孔底形成圆团，但边缘不够光滑，四周稍有凝集块者为+，即25％凝集；红细胞于孔底形成圆团，边缘光滑整齐，将板倾斜片刻，就可见红细胞滑动象人的眼泪滴样者为-，即无凝集。血凝效价以++为终点，即以能够使50％红细胞凝集的病毒液的最高稀释度的倒数作为该病毒血凝素的血凝效价。

7.统计学处理：以spss13.0软件进行统计分析，描述指标采用均数±标准差(X±S)表示，血凝效价经数据转换为对数值后计算均数±标准差(X±S)，多组样本均数间的比较采用单因素方差分析F检验法，两两比较用q检验。

二、结果

(一)甲型流感病毒半数组织细胞感染量(TCID50)测定：

病毒攻击MDCK细胞后24h，10^-1浓度孔即有2孔发生+的CPE，其余各孔未见CPE。病变持续进展，到第3天时，10^-1浓度孔6孔均发生+++～++++的CPE，10^-2有5孔、10^-33孔、10^-42孔、10^-51孔、10^-61孔发生细胞病变，10^-7、10^-8及正常细胞对照孔没有细胞病变。根据细胞的病变情况，采用Reed-Muench法计算得出TCID50为10^-3.45/100ul，含药血清药效实验中选用病毒攻击量为100TCID₅₀/100ul。见表1。

表1：甲型流感病毒对MDCK细胞CPE的影响

(二)含药血清在不同给药方式时对抑制甲型流感病毒作用的影响：

MTT试验结果显示在治疗给药方式时，病毒对照孔、空白血清对照组、各剂量组防感血清、达菲对照组血清平均OD值均明显低于正常细胞对照孔，差异非常显著(P＜0.01)；空白血清对照组、各剂量组防感血清、达菲对照组血清平均OD值略高于病毒对照孔，经组间两两比较q检验，差异无显著性(P＞0.05)；与空白血清对照组相比，各剂量组防感血清、达菲对照组血清平均OD值略高，组间差异无统计学意义(P＞0.05)。空白血清对照组、各剂量组防感血清、达菲对照组血清均对流感病毒增殖有轻微抑制作用，达菲对照组血清病毒抑制率略高于防感高剂量组。见表2。

表2：含药血清对甲型流感病毒增殖抑制作用(MTT法)

#与正常细胞对照孔相比P＜0.01

在预防给药方式时，病毒对照孔、空白血清对照组、各剂量组防感血清、达菲对照组血清平均OD值均明显低于正常细胞对照孔，差异非常显著(P＜0.01)；空白血清对照组、各剂量组防感血清、达菲对照组血清平均OD值高于病毒对照孔，经组间两两比较q检验，差异非常显著(P＜0.01)；与空白血清对照组相比，防感低、中剂量组血清平均OD值略高，组间差异无统计学意义(P＞0.05)，防感高剂量组血清、达菲对照组血清平均OD值高于空白血清组，差异非常显著(P＜0.01)。空白血清对照组、各剂量组防感血清、达菲对照组血清均对流感病毒吸附细胞有抑制作用，各剂量组防感血清、达菲对照组血清病毒抑制率高于空白血清对照组，达菲对照组血清略高于防感高剂量组。见表3。

表3：含药血清对甲型流感病毒吸附细胞的影响(MTT法)

#与正常细胞对照孔相比P＜0.01      ^*与病毒对照孔相比P＜0.01

△与空白对照组血清相比P＜0.01

含药血清与病毒同时作用于MDCK细胞时，病毒对照孔、空白血清对照组、各剂量组防感血清、达菲对照组血清平均OD值均明显低于正常细胞对照孔，差异非常显著(P＜0.01)；空白血清对照组、各剂量组防感血清、达菲对照组血清平均OD值高于病毒对照孔，经组间两两比较q检验，差异非常显著(P＜0.01)；与空白血清对照组相比，防感低剂量组血清平均OD值略高，组间差异无统计学意义(P＞0.05)，防感中剂量组血清平均OD值高于空白血清组，差异有显著性(P＜0.05)，防感高剂量组血清、达菲对照组血清平均OD值明显高于空白血清组，差异非常显著(P＜0.01)。空白血清对照组、各剂量组防感血清、达菲对照组血清均对流感病毒有直接杀灭作用，各剂量组防感血清、达菲对照组血清病毒抑制率高于空白血清对照组，达菲对照组血清略高于防感高剂量组。见表4。

表4：含药血清对甲型流感病毒的直接杀灭作用(MTT法)

#与正常细胞对照孔相比P＜0.01    ^*与病毒对照孔相比P＜0.01

△与空白对照组血清相比P＜0.01   △△与空白对照组血清相比P＜0.05

从表中可以看出，含药血清与病毒同时作用及预防给药方式时病毒抑制率明显高于治疗给药方式，而又以同时作用的抑制率最高，各含药血清组抑制作用高于空白血清组，高剂量组抑制作用强于低、中剂量组，稍低于达菲对照组血清。

(三)含药血清对甲型流感病毒感染MDCK细胞膜通透性的影响：

3种不同给药方式的病毒对照孔、空白血清对照组、防感血清各剂量组、达菲血清对照组LDH活性均明显高于正常细胞对照孔，差异非常显著(P＜0.01)。在治疗给药方式，空白血清对照组、防感血清低、中剂量组LDH活性略低于病毒对照孔，组间差异无统计学意义(P＞0.05)，防感血清高剂量组、达菲血清对照组LDH活性低于病毒对照孔，差异有显著性(P＜0.05)；防感血清各剂量组、达菲血清对照组LDH活性略低于空白血清对照组，组间差异无显著性(P＞0.05)。在预防给药方式，空白血清对照组、防感血清各剂量组、达菲血清对照组LDH活性低于病毒对照孔，差异有显著性(P＜0.05)；防感血清各剂量组、达菲血清对照组LDH活性略低于空白血清对照组，组间差异无显著性(P＞0.05)。含药血清与病毒同时作用时，空白血清对照组、防感血清各剂量组、达菲血清对照组LDH活性均低于病毒对照孔，差异有显著性(P＜0.05)；防感血清低、中剂量组LDH活性略低于空白血清对照组，组间差异无显著性(P＞0.05)，防感血清高剂量组、达菲血清对照组LDH活性低于空白血清对照组，差异有显著性(P＜0.05)。见表5。

表5：含药血清对甲型流感病毒感染MDCK细胞膜通透性的影响(X±S)

#与正常细胞对照孔相比P＜0.01    ^**与病毒对照孔相比P＜0.05

△△与空白对照组血清相比P＜0.05

从表中可以看出，3种不同给药方式的病毒对照孔LDH活性均明显高于正常细胞对照孔，各含药血清组LDH活性均低于空白血清组，高剂量组LDH活性低于低、中剂量组，稍高于达菲血清对照组，3种给药方式中预防及同时作用的LDH活性低于治疗方式，而又以同时作用方式的LDH活性最低。

(四)含药血清对甲型流感病毒血凝效价的影响：

3种不同给药方式的病毒对照孔、空白血清对照组、防感血清各剂量组、达菲血清对照组血凝效价均明显高于正常细胞对照孔，差异非常显著(P＜0.01)。在治疗给药方式，空白血清对照组、防感血清低、中剂量组血凝效价略低于病毒对照孔，组间差异无统计学意义(P＞0.05)，防感血清高剂量组、达菲血清对照组低于病毒对照孔，差异有显著性(P＜0.05)；防感血清各剂量组、达菲血清对照组略低于空白血清对照组，组间差异无显著性(P＞0.05)。在预防给药方式，空白血清对照组血凝效价低于病毒对照孔，差异有显著性(P＜0.05)；防感血清各剂量组、达菲血清对照组明显低于病毒对照孔，差异有非常显著性(P＜0.01)；防感血清低中剂量组略低于空白血清对照组，组间差异无显著性(P＞0.05)；高剂量组和达菲血清对照组低于空白血清对照组，差异有显著性(P＜0.05)。含药血清与病毒同时作用时，空白血清对照组、防感血清各剂量组、达菲血清对照组血凝效价均明显低于病毒对照孔，差异有非常显著性(P＜0.01)；防感血清各剂量组、达菲血清对照组明显低于空白血清对照组，差异有非常显著性(P＜0.01)。见表6。

表6：含药血清对甲型流感病毒血凝效价的影响

#与正常细胞对照孔相比P＜0.01

^*与病毒对照孔相比P＜0.01   ^**与病毒对照孔相比P＜0.05

△与空白对照组血清相比P＜0.01  △△与空白对照组血清相比P＜0.05

从表中可以看出，3种不同给药方式的病毒对照孔血凝效价均明显高于正常细胞对照孔，各含药血清组均低于空白血清组，高剂量组低于低、中剂量组，稍高于达菲血清对照组，3种给药方式中同时作用和预防方式药物组的血凝效价低于治疗方式，而又以同时作用的效价最低。

三、结论

1.防感颗粒对流感病毒感染有显著的预防与直接作用，作用机理可能主要是通过直接杀灭病毒、以及抑制病毒吸附及膜融合作用来阻止流感病毒进入宿主体内增殖复制。

2.防感颗粒可以减轻病毒感染后对宿主细胞膜造成的损伤，有利于宿主细胞的保护，药物的主要作用靶点可能在细胞膜。

3.防感颗粒使细胞培养体系中病毒含量和毒力下降，感染细胞的能力降低，有一定的直接抗流感病毒作用。

实施例3：中药组合物对流感病毒感染小鼠T细胞亚群的影响

一、材料与方法

(一)实验材料

1.实验动物与饲养：清洁级ICR小鼠168只，雌雄各半，体重20±2g，购自中国科学院上海实验动物中心。动物购回后饲养于浙江省疾病预防与控制中心病毒实验室，环境温度18-25℃，湿度为40-60％，常规喂养小鼠颗粒饲料，自由饮水与活动。

2.实验药品：防感颗粒购自浙江中医药大学附属第一医院中药房，药物品系和质量合格。按常规方法煎煮2次，合并煎煮液，过滤，所得滤液浓缩成不同浓度的药液，所含生药量分别为14.66g/kg、29.32g/kg和73.30g/kg。药液置4℃冰箱中保存，临用前用烧杯水浴至室温。

3.阳性对照药：达菲胶囊，75毫克/粒，批号E1184，罗氏大药厂香港有限公司

4.病毒：甲1型流感病毒鼠肺适应株(FM1)，由浙江省疾病预防与控制中心病毒所提供，在9日龄鸡胚中增殖复壮，收集尿囊液，-70℃超低温冰箱冻存备用。

5.主要试剂：

6.主要设备：

流式细胞仪(COULTER Epics XL)        Made in USA

(二)实验方法

清洁级ICR小鼠96只，雌雄各半，体重20±2g，按体重分层随机分为正常对照组、病毒对照组(模型组)、防感颗粒低剂量组、中剂量组、高剂量组、达菲对照组，每组16只，每个时相段4只，雌雄分笼喂养。按体型系数换算法(2)进行实验动物与人用药量的换算，防感颗粒低剂量组给药剂量为14.66g/kg，相当于临床等效剂量；中剂量组给药量为低剂量组的2倍，即29.32g/kg；高剂量组为低剂量组的5倍，即73.30g/kg；达菲对照组给药剂量0.02g/kg，分别灌胃给药，正常对照组和模型组以生理盐水灌胃，每天1次，每次0.25ml/10g。给药第3天，小鼠用乙醚轻度麻醉后，正常对照组以生理盐水滴鼻，其余各组以10LD50的流感病毒液滴鼻感染，每只20ul，滴鼻造模后2h开始继续灌胃给药，每日1次，直到感染病毒后第5天，共给药8天。以滴鼻造模的次日为病毒感染后第1天，每组分别于感染后第1、5、9、13天随机取小鼠4只，摘眼球取血，肝素管抗凝，流式细胞仪直接免疫荧光法检测T细胞亚群、CD25，动态观察。

标本均当日测试完毕。取流式检测试管48只，标上记号，加样：管1-24分别加入荧光标记抗小鼠抗体CD3 PE-Cy5、CD4 FITC和CD8a PE各4μl，管25-48分别加入CD3 PE-Cy5、CD25 PE各4μl。对照管1则加相应荧光标记同型阴性抗体Hamster IgG1 PE-Cy5、Rat IgG2a FITC、Rat IgG2a PE各4μl，对照管2加入荧光标记同型阴性抗体Hamster IgG1 PE-Cy5、Rat IgG1 PE各4μl，每管分别加入40μl肝素抗凝全血，混匀，室温(20-25℃)避光孵育15min。分别加入溶血素800μl，立即涡旋振荡，然后静置10min。再分别加入500ul PBS，短暂涡旋震荡，避光室温孵育10min。再离心，1500r/min 5min，弃上清，轻轻倒扣于滤纸上吸干管口，加PBS 0.5ml重悬沉淀，流式细胞仪上机检测，以对照管作为空白定标，计数2000只淋巴细胞，用System II for EPICS XL-MCL Version 3.0软件进行检测结果分析，记录样本CD3⁺、CD3⁺CD4⁺、CD3⁺CD8⁺和CD3⁺CD25⁺T细胞的百分比。

(三)统计学方法

以SPSS13.0软件进行统计分析，描述指标采用均数±标准差(X±S)表示，多组样本均数间的比较采用单因素方差分析F检验，两两比较用q检验。

二、结果

(一)防感颗粒对感染小鼠T细胞亚群的影响：

病毒感染后第1天模型组、防感颗粒各剂量组和达菲对照组外周血中CD3⁺T细胞的阳性百分比有下降，各组均略低于正常对照组(P＞0.05)，防感颗粒各剂量组和达菲对照组稍高于模型组(P＞0.05)；第5天各组CD3⁺％继续下降，明显低于正常对照(P＜0.01)，防感颗粒低剂量组和达菲对照组稍高于模型组(P＞0.05)，中高剂量组高于模型组(P＜0.05)；第9天起不再下降，而较第5天有所升高，但仍低于正常对照(P＜0.05)，防感颗粒各剂量组和达菲对照组稍高于模型组(P＞0.05)；第13天模型组仍低于正常对照(P＜0.05)，而防感颗粒各剂量组和达菲对照组略低于正常对照组(P＞0.05)，基本接近正常范围。见表7。

表7：防感颗粒对感染小鼠外周血CD3⁺％的影响(X±S)

#与正常对照组相比P＜0.01；##与正常对照组相比P＜0.05；###与正常对照组相比P＞0.05

^**与模型组相比P＜0.05；^***与模型组相比P＞0.05

病毒感染后第1、5、9、13天模型组外周血中CD3⁺CD4⁺T细胞的百分比均有所下降，但下降程度不明显，略低于正常对照组(P＞0.05)；防感颗粒各剂量组和达菲对照组均略低于正常对照组(P＞0.05)，稍高于模型组(P＞0.05)。见表8。

表8：防感颗粒对感染小鼠外周血CD3⁺CD4⁺％的影响(X±S)

###与正常对照组相比P＞0.05；^***与模型组相比P＞0.05

病毒感染后第1天模型组外周血中CD3⁺CD8⁺T细胞的百分比下降，低于正常对照(P＜0.05)，防感颗粒各剂量组和达菲对照组均略低于正常对照组(P＞0.05)，防感颗粒各剂量组和达菲对照组均略高于模型组(P＞0.05)；第5天模型组、防感颗粒各剂量组和达菲对照组CD3⁺CD8⁺％进一步下降到最低值，均明显低于正常对照(P＜0.01)，防感颗粒低剂量组和达菲对照组稍高于模型组(P＞0.05)，中高剂量组高于模型组(P＜0.05)；模型组、防感颗粒各剂量组和达菲对照组第9天较第5天有所升高，但仍低于正常对照(P＜0.05)，防感颗粒各剂量组和达菲对照组均稍高于模型组(P＞0.05)；第13天模型组仍低于正常对照(P＜0.05)，防感颗粒各剂量组和达菲对照组基本正常范围，略低于正常对照组(P＞0.05)，防感颗粒各剂量组和达菲对照组均稍高于模型组(P＞0.05)。见表9。

表9：防感颗粒对感染小鼠外周血CD3⁺CD8⁺％的影响(X±S)

#与正常对照组相比P＜0.01；##与正常对照组相比P＜0.05；###与正常对照组相比P＞0.05

^**与模型组相比P＜0.05；   ^***与模型组相比P＞0.05

从表中可以看出，模型组主要表现为CD3⁺T细胞％和CD3⁺CD8⁺T细胞％下降，从病程看在感染后第5天下降为最低值，第9天后不再继续下降，但恢复过程缓慢，到第13天仍低于正常对照组。而防感颗粒可提高下降的CD3⁺和CD3⁺CD8⁺T细胞％，此作用以第5天明显，并且13天时防感颗粒各剂量组已基本恢复正常范围，各药物组中尤其中高剂量组提高和恢复下降的T细胞％作用明显。

(二)防感颗粒对感染小鼠T细胞活化的影响：

病毒感染后第1天模型组外周血中CD3⁺CD25⁺T细胞阳性百分比低于正常对照组(P＜0.05)，防感颗粒各剂量组和达菲对照组略高于正常对照组(P＞0.05)，防感颗粒各剂量组和达菲对照组略高于模型组(P＞0.05)；第5天模型组CD3⁺CD25⁺％有所升高，略高于正常对照(P＞0.05)，防感颗粒低剂量组和达菲对照组高于正常对照(P＜0.05)，中高剂量组明显高于正常对照组(P＜0.01)，防感颗粒低剂量组和达菲对照组高于模型组(P＜0.05)，中高剂量组明显高于模型组(P＜0.01)；第9天较第5天有回落，模型组稍低于正常对照(P＞0.05)，防感颗粒各剂量组和达菲对照组高于正常对照(P＜0.05)，防感颗粒各剂量组和达菲对照组高于模型组(P＜0.05)；第13天防感颗粒各剂量组回落至正常范围，模型组、防感颗粒各剂量组和达菲对照组均略低于正常对照组(P＞0.05)，防感颗粒各剂量组和达菲对照组均稍高于模型组(P＞0.05)。见表10。

表10：防感颗粒对感染小鼠外周血CD3⁺CD25⁺％的影响(X±S)

#与正常对照组相比P＜0.01；##与正常对照组相比P＜0.05；###与正常对照组相比P＞0.05

^*与模型组相比P＜0.01；^**与模型组相比P＜0.05；^***与模型组相比P＞0.05

从表中可以看出，模型组感染后细胞免疫总体活化与增殖水平低下，而防感颗粒可以促进成熟T细胞活化与增殖，尤其在感染后第5、9天，第13天恢复至正常范围。

三、结论

1.甲型流感病毒感染时存在T细胞特异性抗病毒免疫功能抑制状况，T细胞总体活化与增殖程度低下，主要表现为CD3⁺、CD3⁺CD8⁺和CD3⁺CD25⁺T细胞的百分比下降。

2.防感颗粒可以改善流感病毒感染时的成熟T细胞免疫功能抑制状况，促进成熟T细胞免疫功能的恢复，特别是CD8⁺杀伤性T细胞的抗病毒免疫效应，提高细胞免疫的总体水平，调节免疫细胞比例失衡，并且可以通过促进成熟T细胞活化增殖功能，增强淋巴细胞的抗病毒感染效应，从而发挥免疫效应的间接抗病毒作用，该作用以中高剂量组较为明显。

实施例4：中药组合物对感染小鼠细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10的影响

一、材料与方法

(一)实验材料

1.实验动物：实施例3中饲养小鼠，分别于感染后第1、5、9、13天随机取各组小鼠，在断颈处死前先摘眼球取血，待血液凝固2h以上，3000r/min低速离心10min，取血清，置-20℃冰箱中冻存备用，ELISA法测IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10含量。

2.主要试剂与设备：

(二)实验方法：ELISA法测定IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10含量。

(三)统计学方法：以SPSS13.0软件进行统计分析，描述指标采用均数±标准差(X±S)表示，多组样本均数间的比较采用单因素方差分析F检验，两两比较用q检验。

二、结果

(一)对Th1型细胞因子的影响：

感染后第1天模型组IFN-γ含量有所下降，略低于正常对照组(P＞0.05)，防感颗粒各剂量组和达菲对照组略高于正常对照组(P＞0.05)，防感颗粒各剂量组和达菲对照组略高于模型组((P＞0.05)；第5天IFN-γ含量有所升高，模型组略高于正常对照组(P＞0.05)，低剂量组高于正常对照组(P＜0.05)，中高剂量组和达菲对照组明显高于正常对照组(P＜0.01)，低剂量组略高于模型组(P＞0.05)，中高剂量组和达菲对照组明显高于正常对照组(P＜0.01)；第9天IFN-γ含量又有下降，模型组略低于正常对照组(P＞0.05)，防感颗粒各剂量组和达菲对照组略高于正常对照组(P＞0.05)，防感颗粒各剂量组和达菲对照组略高于模型组((P＞0.05)；第13天模型组仍偏低，略低于正常对照组(P＞0.05)，防感颗粒各剂量组和达菲对照组基本在正常范围，稍高于模型组(P＞0.05)。见表11。

表11：防感颗粒对感染小鼠IFN-γ含量的影响(X±S)

#与正常对照组相比P＜0.01；##与正常对照组相比P＜0.05；###与正常对照组相比P＞0.05

^*与模型组相比P＜0.01；^***与模型组相比P＞0.05

感染后第1天IL-2含量有所下降，模型组、防感颗粒各剂量组和达菲对照组略高于正常对照组(P＞0.05)，防感颗粒各剂量组和达菲对照组略高于模型组((P＞0.05)；第5天继续下降至最低值，模型组低于正常对照组(P＜0.05)，防感颗粒各剂量组和达菲对照组略低于正常对照组(P＞0.05)，防感颗粒低剂量组略高于模型组((P＞0.05)，中高剂量组和达菲对照组高于模型组(P＜0.05)；第9天不再继续下降，但模型组仍低于正常对照组(P＜0.05)，而防感颗粒各剂量组和达菲对照组略低于正常对照组(P＞0.05)，各剂量组和达菲对照组略高于模型组((P＞0.05)；第13天较第9天有所升高，模型组、防感颗粒各剂量组和达菲对照组略高于正常对照组(P＞0.05)，防感颗粒各剂量组和达菲对照组略高于模型组((P＞0.05)。见表12。

表12：防感颗粒对感染小鼠IL-2含量的影响(X±S)

##与正常对照组相比P＜0.05；###与正常对照组相比P＞0.05

^**与模型组相比P＜0.05；^***与模型组相比P＞0.05

从表中可以看出，模型组在感染后第5天IL-2下降明显，低于正常对照组，第9天IL-2有所回升，但仍低于正常对照组，而IFN-γ下降不明显，在第5天似有轻度升高；防感颗粒组IL-2下降程度教轻，在9天已基本恢复至正常，IFN-γ在感染后第5天升高，9天下降明显，第13天已恢复至正常，尤其中高剂量组作用较强。

(二)对Th2型细胞因子的影响：

感染后第1天模型组IL-4升高不明显，略高于正常对照组(P＞0.05)，防感颗粒各剂量组和达菲对照组略高于正常对照组(P＞0.05)，略低于模型组(P＞0.05)；第5天模型组IL-4有所增高，但与正常对照组比较，差异无显著性(P＞0.05)，防感颗粒各剂量组和达菲对照组略高于正常对照组(P＞0.05)，略低于模型组(P＞0.05)；第9天模型组IL-4明显高于正常对照组(P＜0.01)，防感颗粒各剂量组和达菲对照组略高于正常对照组(P＞0.05)，低于模型组(P＜0.05)；第13天模型组IL-4继续升高，明显高于正常对照组(P＜0.01)，防感颗粒各剂量组和达菲对照组略高于正常对照组(P＞0.05)，明显低于模型组(P＜0.01)。见表13。

表13：防感颗粒对感染小鼠IL-4含量的影响(X±S)

#与正常对照组相比P＜0.01；###与正常对照组相比P＞0.05

^*与模型组相比P＜0.01；^**与模型组相比P＜0.05；^***与模型组相比P＞0.05

感染后模型组IL-10略高于正常对照组(P＞0.05)，并随病程进展似有逐渐增高趋势，但与正常对照组比较，差异均无显著性(P＞0.05)，防感颗粒各剂量组和达菲对照组均略低于模型组(P＞0.05)。见表14。

表14：防感颗粒对感染小鼠IL-10含量的影响(X±S)

###与正常对照组相比P＞0.05；^***与模型组相比P＞0.05

从表中可以看出，感染后第1-5天模型组IL-4、IL-10变动均不明显，但有逐渐增高趋势，IL-4变化比IL-10明显。在9-13天模型组IL-4明显高于正常对照组(P＜0.01)，IL-10略高于正常对照组(P＞0.05)，防感颗粒各剂量组和达菲对照组能减低染毒小鼠IL-4水平，而减少IL-10作用不明显。

四、结论

1.甲型流感病毒感染时存在Th细胞分泌细胞因子功能的紊乱，主要表现为早期Th1为主的分泌IFN-γ、IL-2反应不足，在感染后期Th2分泌反应亢进，导致病毒在体内的增殖扩散，感染加重，病程迁延，并可能与慢性炎症引起的高反应性哮喘相关以及继发过敏反应相关。

2.防感颗粒在感染早期主要诱导Th1细胞为主的免疫应答反应，促进抗病毒因子IFN-γ、IL-2的分泌，以抵御或清除病毒，有利于感染症状的控制与恢复，抑制Th2反应，特别是影响IL-4分泌，调节Th1/Th2免疫细胞的平衡状态，防止由于炎性介质过度释放而引起的免疫病理损伤，对炎症伴发的超敏反应的控制有益。

实施例5：中药组合物对感染小鼠病毒含量的影响

动物实验已证实，防感颗粒有直接抑制病毒以及改善流感病毒感染小鼠免疫功能状态、调动机体抗病力量的间接抗病毒的双重作用，本实验主要运用血凝试验及荧光定量RT-PCR方法来检测动物体内病毒含量，进一步研究药物体内抗病毒的效果。

一、材料与方法

(一)实验材料

1.实验动物：实施例3中饲养小鼠，分别于感染后第1、5、9、13天随机取各组小鼠4只在取血、断颈处死后，取右侧肺脏，加入生理盐水，肺重(g)∶生理盐水(ml)＝1∶9，用研浆器研磨，制成鼠肺悬液，3000r/min低速离心20min，取上清检测血凝效价。实施例4饲养小鼠，分别于感染后第1、5、9、13天随机取各组小鼠4只在取血后，断颈处死，剪断两侧肋骨和胸肌，暴露胸腔，从喉头以上剪断气管，将胸腔脏器一并取出，摘除心脏、肺门淋巴结等组织，取两侧肺脏放入冻存管中，置-70℃超低温冰箱中冻存备用，准备行实时荧光定量RT-PCR检测。

2.主要试剂与设备：

(二)实验方法

1.流感病毒感染小鼠血凝效价检测：

(1)在96孔微量反应板的1～12孔均加入25ul生理盐水；

(2)用微量移液器吸取25ul鼠肺悬液上清加入第1孔，混匀，从第1孔吸取25ul鼠肺悬液上清加入第2孔，混匀后吸取25ul加入第3孔，如此进行倍比稀释至第11孔，从第11孔吸取25ul弃之，第12孔作为生理盐水对照；

(3)每孔再加入25ul生理盐水；

(4)之后每孔均加入25ul 1.2％豚鼠红细胞悬液，混合均匀；

(5)在室温(20℃～25℃)下作用45min后观察结果。

(6)各孔出现红细胞凝集程度以++++、+++、++、+、-表示，红细胞呈细砂粒状均匀铺于孔底者为++++，即100％凝集；红细胞均匀铺于孔底，但边缘不整而稍向孔底集中者为+++，即75％凝集；红细胞于孔底形成一个环状，四周有小凝集块者为++，即50％凝集；红细胞于孔底形成圆团，但边缘不够光滑，四周稍有凝集块者为+，即25％凝集；红细胞于孔底形成圆团，边缘光滑整齐，将板倾斜片刻，就可见红细胞滑动象人的眼泪滴样者为-，即无凝集。血凝效价以++为终点，即以能够使50％红细胞凝集的病毒液的最高稀释度的倒数作为该病毒血凝素的血凝效价。

2.荧光定量RT-PCR检测感染小鼠流感病毒含量：

2.1病毒RNA提取：

(1)将肺组织挑入已高压灭菌过的1.5ml Eppendof管中，每管加1ml DEPC水，混匀，吸去上清，重复以上操作。

(2)将冲洗后的肺组织挑出，加液氮，研碎。

(3)然后将研磨好的肺组织放入新的1.5ml Eppendof管中，加入1ml Trizol，混匀，室温静置15分钟。

(4)再加入200ul氯仿，颠倒混匀，室温静置10分钟，13000r/min离心10min。

(5)取上清液转移至一新的1.5ml Eppendof管，加入等体积异丙醇，颠倒混匀，静置10分钟，13000r/min离心10min。

(6)弃上清，加1ml 75％乙醇(用DEPC水配置)洗涤沉淀，8500r/min离心5min，吸去上清。

(7)空气干燥沉淀，加40ulDEPC水溶解RNA。

(8)-20℃冰箱保存备用(长期保存放-70℃冰箱)。

2.2TaqMan探针与引物设计：

从GenBank中随机下载不同年代和地区的甲1型流感病毒H1N1的M基因序列，用DNA Star软件进行同源性分析，找出其保守和无二级结构区域，用Primer Premier5.0软件设计合适的TaqMan探针与引物序列，并通过NCBI数据库进行了Blast同源性比对验证。其中探针的5’端标记的荧光报告基团为FAM，3’端标记的荧光淬灭基团为TAMRA。TaqMan探针序列5’-FAM-ACTGGACTTTGCTAGAACCCGGAGACACAA-3’-TAMRA，其Tm值68.9℃，GC含量在80％。上游引物Primer：5’-AGGTCAAGCAGGGAGAATAAACTAT-3’，Tm值58.7℃，G+C含量在65％；下游引物Antisense primer：5’-AATGCCTCTATTTAGTGCGAAAGC-3’，Tm值58.9℃，G+C含量在66％，扩增目的片断长度为121bp。所选探针由日本TaKaRa公司合成，引物由上海英俊生物技术有限公司合成。

2.3建立RT-PCR阳性定量标准品曲线：

2.4荧光定量RT-PCR反应体系与条件：反应条件：93℃3min，然后93℃45sec，55℃1min，共40循环。反应结束后，由电脑自动分析并计算结果。结果按B＝拷贝数/ul cDNA进行分析，考虑到各个样本总RNA浓度的差异，最终计算结果按下列公式换算：A(拷贝数/ug总RNA)＝B(拷贝数/ul cDNA)÷OD260×5/6

(三)统计学方法：以SPSS13.0软件进行统计分析，描述指标采用均数±标准差(X±S)表示，血凝效价经数据转换为对数值后计算均数±标准差(X±S)，多组样本均数间的比较采用单因素方差分析F检验法，两两比较用q检验。

二、结果

(一)对流感病毒感染小鼠血凝效价影响：

感染后第1、5、9、13天模型组、防感颗粒各剂量组和达菲对照组血凝效价均明显高于正常对照组(P＜0.01)。第1天防感颗粒各剂量组和达菲对照组略低于模型组(P＞0.05)；第5天低剂量组略低于模型组(P＞0.05)，中高剂量组低于模型组(P＜0.05)，达菲对照组明显低于模型组(P＜0.01)；第9天各剂量组略低于模型组(P＞0.05)，达菲对照组低于模型组(P＜0.05)；第13天防感颗粒各剂量组和达菲对照组略低于模型组(P＞0.05)。从表中可以看出，感染后第5天血凝效价最高，第9天起血凝效价不再继续增高，防感颗粒各剂量组血凝效价低于模型组，其中以第5天中高剂量组作用较强。见表15。

表15：防感颗粒对感染小鼠血凝效价的影响(X±S)

#与正常对照组相比P＜0.01；

^*与模型组相比P＜0.01；^**与模型组相比P＜0.05；^***与模型组相比P＞0.05

(二)实时荧光定量RT-PCR检测防感颗粒对小鼠感染感染病毒量的影响：

1.实时荧光定量RT-PCR检测标准品曲线：

病毒RNA经RT-PCR扩增后，测定核酸浓度，作为定量的外标准品。10倍梯度稀释外标准品，取终浓度为10⁴--10⁷拷贝数/反应的4个DNA样品进行标准曲线绘制，通过标准曲线对未知样品定量。见图5a，5b，从图上可以看到，标准曲线的斜率为-3.9643，扩增的相关系数0.9933。

2.实时荧光定量RT-PCR检测染毒小鼠病毒含量A(拷贝数/ug总RNA)：

实时荧光定量RT-PCR检测感染后第1、5、9、13天模型组、防感颗粒各剂量组和达菲对照组小鼠病毒含量均明显高于正常对照组(P＜0.01)。第1天防感颗粒低剂量组低于模型组(P＜0.05)，中高剂量组和达菲对照组明显低于模型组(P＜0.01)；第5天低剂量组略低于模型组(P＞0.05)，中高剂量组低于模型组(P＜0.05)，达菲对照组明显低于模型组(P＜0.01)；第9天各剂量组略低于模型组(P＞0.05)，达菲对照组低于模型组(P＜0.05)；第13天低剂量组略低于模型组(P＞0.05)，中高剂量组低于模型组(P＜0.05)，达菲对照组明显低于模型组(P＜0.01)。见表16。从表中可以看出，感染后第5天病毒含量达到峰值，第9天起不再继续增高，防感颗粒各剂量组病毒含量均低于模型组，尤其中高剂量组作用较为明显。

表16：实时荧光定量RT-PCR检测染毒小鼠病毒含量A(x10⁵拷贝数/ug总RNA)

#与正常对照组相比P＜0.01

^*与模型组相比P＜0.01；^**与模型组相比P＜0.05；^***与模型组相比P＞0.05

三、结论

1.血凝效价、荧光定量PCR检测结果证实小鼠是甲1型流感病毒感染，且病毒含量较高，进一步提示模型复制成功。

2.防感颗粒有一定的抑制体内病毒含量以及减弱病毒感染能力的作用。

实施例6：中药组合物治疗H1N1甲型流行性感冒的临床研究

一、资料方法

(一)一般资料2009年9月至2009年10月浙江省中医药大学附属第一医院下沙院区收治的甲型H1N1流感轻症患者，男性56例，女性39例，年龄(18±5.7)岁。全部病例均符合卫生部甲型H1N1流感诊疗方案(2009年版)中甲型H1N1流行性感冒诊断标准，中医辨证分型符合风热犯卫型。所有患者入院时体温均超过38.5℃，咽拭子送浙江省中医药大学附属第一医院下沙院区检验科检测确诊为甲型H1N1流感。

(二)方法采用平行、随机对照的研究设计进行研究，研究人群按随机数字表分为中药治疗组和对照组。中药治疗组共计48例患者入组，对照组47例患者入组。中药治疗组单纯采用防感颗粒口服，一日两次，疗程3～5天。对照组采用单纯西药治疗，对症处理，高热给予退热治疗。对于既往健康、无并发症的患者无需应用神经氨酸酶抑制剂和其他抗病毒药物，症状严重时可积极抗病毒治疗。

1.观测指标症状量化表；体温、舌苔、脉搏等一般情况；胸片、肝肾功能和电解质等实验室指标；病原学咽拭子检查。

2.疗效判定标准显效：治疗后体温恢复正常，鼻塞、流涕、咳嗽、咽部充血等症状体征消失或明显改善；有效：治疗后体温热峰下降，鼻塞、流涕、咳嗽、咽部充血等症状体征好转，无效：治疗后症状、体征无改善或加重；总有效率＝显效率+有效率。

3.统计方法所有的统计检验均采用双侧检验，P值小于或等于0.05为差别有统计学意义。使用SPSS13.0软件进行数据处理。

二、结果

1.中药治疗组应用防感颗粒治疗后，与西药治疗组比较，能缩短退热时间，减少咳嗽病程，头痛鼻塞肌肉酸痛等流感样症状缓解时间也明显缩短。两者的并发症发生率相似，中药治疗组有1例患者出现水样便，1例出现心律失常的并发症。对照组有1例患者出现肺炎的并发症，1例出现胸痛等不良反应。

2.中药治疗组总有率达89.6％，对照组总有效率为85.1％。中药防感颗粒治疗甲型H1N1流感与西药对照组相比，两者虽然总有效率相当，但中药组具有缩短退热时间、减少咳嗽天数、缩短病程的优点。见表17、18。

表17：两组指标比较

^*与西药组比较，P＜0.05。

表18：两组疗效比较

三、结论

1.防感颗粒治疗甲型H1N1流感轻症具有良好疗效。

Claims (5)

1.一种防治甲流的中药组合物，其原料药的重量配比如下：荆芥1～5份；防风1～5份；前胡1～5份；板蓝根1～5份；大青叶1～5份；杏仁1～5份；白芷1～5份；陈皮1～5份；生甘草1～5份。

2.如权利要求1所述的中药组合物，其特征在于所述组合物的原料药的重量配比如下：荆芥1份；防风1份；前胡1份；板蓝根1份；大青叶1份；杏仁1份；白芷1份；陈皮1份；生甘草1份。

3.如权利要求1所述中药组合物在制备防治甲流的药物中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述药物制成下列之一的剂型：(1)颗粒剂、(2)片剂、(3)口服液、(4)胶囊剂。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述药物为颗粒剂，制备所述颗粒剂的中药原料重量配比为：荆芥1～5份；防风1～5份；前胡1～5份；板蓝根1～5份；大青叶1～5份；杏仁1～5份；白芷1～5份；陈皮1～5份；生甘草1～5份；所述颗粒剂由如下方法制得：将配方量的中药原料加水浸没浸渍0.5～1小时，煎煮2次，每次1～2小时，合并两次煎液，过滤，滤液浓缩至相对密度为1.08～1.12，冷却后加乙醇至乙醇体积含量为60％，充分搅拌，冷藏静置12小时以上，取醇沉上清液，过滤，滤液减压回收乙醇，继续浓缩至相对密度为1.34～1.40清膏，取清膏加入质量为清膏质量1.5～2.0倍的淀粉，搅匀、制粒、干燥、整粒，混匀，即得所述颗粒剂。

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