CN113616764B

CN113616764B - 抗病毒中药组合物及其应用

Info

Publication number: CN113616764B
Application number: CN202010385033.8A
Authority: CN
Inventors: 陈国瑞; 辛远航
Original assignee: Shanghai Guankrypton Pharmaceutical Technology Development Co ltd
Current assignee: Shanghai Guankrypton Pharmaceutical Technology Development Co ltd
Priority date: 2020-05-09
Filing date: 2020-05-09
Publication date: 2022-08-02
Anticipated expiration: 2040-05-09
Also published as: CN113616764A

Abstract

本发明涉及一种抗病毒中药组合物，可用于制备抗病毒或防治病毒性疾病(特别是以病毒为主导致的呼吸道感染)的药物。该中药组合物遵循中医理论组方，由金银花、金荞麦茎叶、鱼腥草、母菊、夏枯草、桑叶、菊花、紫苏、藿香、薄荷、葛根、甘草、生姜、大枣为原料制备而成。实验研究表明，该中药组合物具有显著的抑制常见可导致呼吸道感染的病毒之作用，并能调节实验动物免疫功能，提高免疫功能低下动物的免疫水平，尤其是可提高呼吸道黏膜免疫功能，因而可用于制备抗病毒药物或防治病毒性疾病(特别是以病毒为主导致的呼吸道感染)的药物。本发明还涉及该中药组合物的医药用途。

Description

抗病毒中药组合物及其应用

技术领域

本发明涉及中药技术领域和健康维护领域，具体地说，是一种具有抗病毒作用，及具有防治病毒性疾病作用，特别具有防治以病毒为主导致的呼吸道感染作用的中药组合物。此外，本发明还涉及该中药组合物的医药用途和健康维护应用。

背景技术

很多病毒是导致常见传染病的病原体，极具传染性和危害性，这些传染病包括狂犬病、天花、脊髓灰质炎、肝炎、黄热病、免疫缺损、脑炎、呼吸道感染、流行性感冒等。如风疹和巨细胞病毒可导致先天性异常，肿瘤病毒可导致人和动物的肿瘤。普通感冒的主要病原体是鼻病毒，其次为副流感病毒、腺病毒、埃可病毒、柯萨奇病毒以及呼吸道合胞病毒等，常易合并细菌感染。流行性感冒(简称流感)是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病，病原体为甲、乙、丙3型流行性感冒病毒，通过飞沫传播，临床上有急起高热、乏力、全身肌肉酸痛和轻度呼吸道症状，中年人和伴有慢性呼吸道疾病或心脏病患者易并发肺炎。流感病毒尤其是甲型极易变异，常造成暴发、流行或大流行。可以说，由于自然环境的剧烈扰动，病毒的快速变异，以及人类对野生动物不科学的食用等诸多原因，新的病毒性疾病特别是以病毒为主导致的呼吸道感染疫情的爆发、流行越来越多，人类社会面临着巨大的威胁。目前，国内外西医对鼻病毒、冠状病毒等多采用利巴韦林、氯喹、瑞德西韦等进行治疗，但是效果非常有限，并且毒副作用很大。由于上述很多病毒传播迅速、变异快、耐药性高等原因，以及新的病毒不断出现，药物和疫苗研发需要较长的周期，使病毒性疾病的防治常缺乏特异性手段，故防治病毒性疾病特别是以病毒为主导致的呼吸道感染药物的研发需求非常迫切。

中医药对病毒性疾病的防治，具有抑制病毒复制、调节免疫功能、改善血液循环、解热镇痛及抗菌消炎等综合功效，可以从多个方面发挥作用，而且具有耐药性低、不良反应和副作用少等优势。现有研究表明，其作用机制在于：某些清热解毒类中药具有直接抗病毒作用，如贯众、金银花、野菊花、大青叶等；某些清热解毒类中草药具有诱发人体内干扰素产生，调节人体免疫力，从而抑制病毒复制，以及改善肺通气功能与微循环，从而减轻患者病情、缩短病程、降低死亡率。总之，中药在防治病毒性疾病方面，特别是防治病毒性呼吸道感染方面，具有独特优势和广阔前景。中药方剂是中医临床应用的主要形式，通过不同中药的配伍组合，可以发挥协同作用，通过多途径、多靶点发挥作用。由于中药品种众多，寻找好的中药组方，需要投入大量精力进行筛选和验证才能确定，是学术界关注的热点。好的抗病毒中药组方对于防治病毒性疾病的用途在于：一、对于病人而言，通过施用(可通过口服、熏蒸、雾化等适宜途径)，可直接抗病毒或调整机体免疫功能，减轻症状，改善病情，帮助病人度过难关，缩短病程；二、在平时或病毒流行期，隐性感染者的呼吸道粘膜等部位存在病毒，但没有临床症状，并不发病，但具有传染性。随着条件转换，隐性感染者可以发病而转换成病人。故对阴性携带者所携带之病毒抑制或杀灭，防治其自身发病和传染他人，亦为重要。三、在平时或病毒流行期，作为病原体的病毒可以在飞沫等媒介中存活一定时间并藉此传播，故直接抑制或杀灭空间环境媒介中存在的病原体，防治其传播给接触者，也很重要。

发明内容

本发明旨在提供一种具有抗病毒作用的中药组合物，及具有防治病毒性疾病的作用，特别是可防治以病毒为主导致的呼吸道感染的中药组合物，并提出该中药组合物的医药和健康维护用途，具体在于可以将该中药组合物制备成适宜剂型，直接作为抑制病毒之用，或用于病毒性疾病的治疗，特别用于以病毒为主导致的呼吸道感染的防治。

由于中药的临床应用形式主要是选择多种中药组成复方，这也是中医药防治病毒性疾病的优势所在，故对良好中药组方需求非常迫切。但是由于药品种很多，良好中药组方筛选工作量大，难度很大。本发明人长期从事中医药研究，在中医理论指导下，针对常见病毒性呼吸道感染的病因病机分析，并通过体外、动物试验和临床验证，终于找到了有较好疗效的抗病毒中药组合物，可以将其制备成适宜剂型，直接抑制病毒之用，或用于病毒性疾病的防治，特别用于以病毒为主导致的呼吸道感染的防治。该中药组方主要由金银花、金荞麦茎叶、鱼腥草、母菊、夏枯草、桑叶、菊花、紫苏、藿香、薄荷、葛根、甘草、生姜、大枣构成，方义如下：君药：金银花为忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.、红腺忍冬Lonicerahypoglauca Miq.、山银花Lonicera confusa DC.或毛花柱忍冬Lonicera dasystylaRehd.的干燥花蕾或带初开的花，性味甘、寒，归肺、心、胃经，具有清热解毒，凉散风热的功效。金荞麦茎叶为蓼科植物金荞麦Fagopyrum dibotrys(D.Don)Hara的茎叶，性味苦、辛、凉，归肺、脾、肝经，具有清热解毒，健脾利湿，祛风通络的功效。臣药：鱼腥草为三白草科植物蕺菜Houttuynia cordata Thunb.的干燥地上部分，性味辛，微寒，归肺经，具有清热解毒，消痈排脓，利尿通淋的功效。母菊为菊科植物西洋甘菊Matricaria recutita L.的花或全草，性味辛、微苦，凉，具有清热解毒，止咳平喘的功效。夏枯草为唇形科植物夏枯草Prunella vulgaris L.的干燥果穗，性味辛、苦、寒，归经归肝、胆经，具有清火，明目，散结，消肿的功效。佐药：桑叶为桑科植物桑Morus alba L.的干燥叶，性味甘、苦，寒，归肺、肝经，具有疏散风热，清肺润燥，清肝明目的功效。菊花为菊科植物菊Chrysanthemum morifoliumRamat.的干燥头状花序，药材按产地和加工方法不同，可分为“亳菊”、“滁菊”、“贡菊”、“杭菊”、“怀菊”，性味甘、苦、微寒，归肺、肝经，具有散风清热，平肝明目，清热解毒的功效。紫苏为唇形科植物紫苏Perilla frutescens(L.)Britt的干燥叶(或带嫩枝)，性味辛，温，归肺、脾经，具有解表散寒，行气和胃的功效。藿香为唇形科植物广蕾香Pogostemon cablin(Blanco)Benth.或藿香Agastache rugosa(Fisch.et Mey.)O.Kuntze的干燥地上部分，性味辛，微温，归肺、脾、胃经，具有芳香化湿，和胃止呕，祛暑解表的功效。薄荷为唇形科植物薄荷Mentha haplocalyx Briq.的干燥地上部分，性味辛，凉，归肺、肝经，具有散风热，清头目，利咽喉，透疹，解郁的功效。使药：葛根为豆科植物野葛Pueraria lobata(Willd.)Ohwi或甘葛藤Pueraria thomsonii Benth.的干燥根，性味甘、辛，凉，归脾、胃经，具有解肌退热，生津，透疹，升阳止泻的功效。甘草为豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.、胀果甘草Glycyrrhiza inflata Bat.或光果甘草Glycyrrhiza glabra L.的干燥根，性味甘，平，归心、肺、脾、胃经，具有补脾益气，清热解毒，祛痰止咳，缓急止痛，调和诸药的功效。生姜味为姜科植物姜Zingiber officinale Rosc.的新鲜根茎，辛，微温，归肺、脾、胃经，具有解表散寒，温中止呕，化痰止咳的功效。大枣为鼠李科枣属植物枣Ziziphus jujuba Mill.的干燥成熟果实，性味甘，温，归脾、胃经，具有补中益气，养血安神的功效。总体上，该处方具有清热解毒、宣肺化痰、调和营卫之功效，临床上可用于抗病毒，如流感病毒、鼻病毒、冠状病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、冠状病毒等，或用于这些病毒所导致之疾病，特别是呼吸道感染的防治。考虑到中药的市场流通、贮藏等因素，临床所应用中药多为干品。若能很好做到保鲜而不腐烂，本中药组合物采用组方中药之相应鲜品，亦为可行，甚至效果更好。

根据实施例，本发明提供的抗病毒中药组合物，由以下重量份的原料药制备而成：金银花1～50份、金荞麦茎叶1～50份、鱼腥草1～30份、母菊1～30份、夏枯草1～30份、桑叶1～30份、菊花1～30份、紫苏1～30份、藿香1～30份、薄荷1～30份、葛根1～30份、甘草1～30份、生姜1～30份、大枣1～30份。优选：金银花1～30份、金荞麦茎叶1～30份、鱼腥草1～25份、母菊1～25份、夏枯草1～25份、桑叶1～20份、菊花1～20份、紫苏1～20份、藿香1～20份、薄荷1～20份、葛根1～20份、甘草1～15份、生姜1～15份、大枣1～15份。再优选：金银花1～25份、金荞麦茎叶1～25份、鱼腥草1～20份、母菊1～20份、夏枯草1～20份、桑叶1～15份、菊花1～15份、紫苏1～15份、藿香1～15份、薄荷1～15份、葛根1～15份、甘草1～10份、生姜1～10份、大枣1～10份。最优选：金银花18份、金荞麦茎叶18份、鱼腥草12份、母菊12份、夏枯草12份、桑叶9份、菊花9份、紫苏9份、藿香9份、薄荷9份、葛根12份、甘草6份、生姜6份、大枣6份。

根据实施例，本发明的中药组合物，可以单独或组合采取以下方法制备而成：

(1)组方中单味药粉碎，再混合，得组合物(粉末)。

(2)组方中全部药物混合后粉碎，得组合物(粉末)。

(3)组方中单味药分别以水和不同浓度的乙醇提取，将各单味药提取液分别浓缩，再将各单味药浓缩液混合后得组合物提取液(物)；或者各单味药提取液混合后再浓缩，得组合物提取液(物)。

(4)组方中全部药物混合以水和不同浓度的乙醇提取，将提取液浓缩，得组合物提取液(物)。

(5)以各种方式获得的提取液，可以根据制剂需要的进行浓缩、干燥等。

采用上述方法进行提取，可以选用水或5％～95％乙醇水溶液、甲醇提取，优选水、25％～75％乙醇水溶液提取。若作为汤剂使用，优选以水作为溶剂提取；若作为其他制剂使用，以水作为溶剂亦可，优选10％～50％乙醇水溶液，最优选25％乙醇水溶液。

上述中药组合物(液体、浸膏、粉末)辅以药学上可接受的辅料载体，采用常规制剂技术即可制成各种口服、注射、外用制剂，如气雾剂、汤剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、合剂等常见剂型，可以通过口服、直肠或肠胃外、鼻吸入、雾化吸入、喷雾方式施用于需要之场所或人员。所述的药学上可接受的辅料载体是指药学领域常规的药物载体，例如：稀释剂、赋形剂如水等，填充剂如淀粉、蔗糖等；粘合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠等；吸收促进剂如季铵化合物；表面活性剂如十六烷醇；吸附载体如高岭土和皂粘土；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙和镁、和聚乙二醇等；抛射剂如氟利昂、碳氢化合物(丙烷、正丁烷、异丁烷)；潜溶剂如丙二醇、甘油、乙醇等。另外，为了制剂需要，还可加入其它辅剂如香味剂、甜味剂等。

本发明实验研究表明：该中药组合物具有显著抑制常见可导致呼吸道感染的病毒之药理作用，并具有调节动物免疫功能，提高免疫功能低下小鼠的免疫水平，尤其是提高呼吸道黏膜免疫功能之作用。该中药组合物选用的中药(药用植物)原料均为药食两用品种，无毒副作用，安全性高，成本低廉，具有显著的优势。鉴于病毒性上呼吸道感染多发，缺乏特异性的防治手段，因此本发明中药组合物具有很好的应用前景。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明，这些实施例应理解为仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等效变化和修改同样落入本发明权利要求所限定的范围。

实施例1提取液制备

分别称取金银花180g、金荞麦茎叶180g、鱼腥草120g、母菊120g、夏枯草120g、桑叶90g、菊花90g、紫苏90g、藿香90g、薄荷90g、葛根120g、甘草60g、生姜60g、大枣60g，加入10倍药材总重量的25％乙醇水溶液，热回流提取2次，每次1小时，合并提取液，浓缩，并用蒸馏水调整浓度相当于生药浓度1.0g/mL。该提取液可以直接作为汤剂使用，也可以作为中间体，根据制剂需要调整浓度，加入适合辅料，加工成适宜的剂型。

实施例2提取液制备

分别称取金银花1000g、金荞麦茎叶100g、鱼腥草50g、母菊300g、夏枯草80g、桑叶20g、菊花50g、紫苏600g、藿香60g、薄荷50g、葛根90g、甘草150g、生姜120g、大枣300g，加入12倍药材总重量的50％乙醇，热回流提取2次，每次1小时，合并提取液，浓缩，并用蒸馏水调整浓度相当于生药浓度2.0g/mL。该提取液可以直接作为汤剂使用，也可以作为中间体，根据制剂需要调整浓度，加入适合辅料，加工成适宜的剂型。

实施例3提取液制备

分别称取金银花80g、金荞麦茎叶1000g、鱼腥草100g、母菊100g、夏枯草800g、桑叶200g、菊花200g、紫苏90g、藿香90g、薄荷20g、葛根800g、甘草60g、生姜600g、大枣20g，加入15倍药材总重量的水，热回流提取2次，每次1小时，合并提取液，浓缩，并用蒸馏水调整浓度相当于生药浓度浓度3.0g/mL。该提取液可以直接作为汤剂使用，也可以作为中间体，根据制剂需要调整浓度，加入适合辅料，加工成适宜的剂型。

实施例4提取液制备

分别称取金银花250g、金荞麦茎叶400g、鱼腥草50g、母菊30g、夏枯草300g、桑叶50g、菊花100g、紫苏300g、藿香90g、薄荷600g、葛根300g、甘草200g、生姜20g、大枣120g，加入8倍药材总重量的75％乙醇水溶液，热回流提取2次，每次1小时，合并提取液，浓缩，并用蒸馏水调整浓度相当于生药浓度1.5g/mL。该提取液可以直接作为汤剂使用，也可以作为中间体，根据制剂需要调整浓度，加入适合辅料，加工成适宜的剂型。

实施例5提取液制备

分别称取金银花50g、金荞麦茎叶50g、鱼腥草120g、母菊800g、夏枯草120g、桑叶90g、菊花90g、紫苏200g、藿香600g、薄荷90g、葛根250g、甘草600g、生姜50g、大枣60g，加入6倍药材总重量的60％乙醇水溶液，热回流提取2次，每次1小时，合并提取液，浓缩，并用蒸馏水调整浓度相当于生药浓度2.0g/mL。该提取液可以直接作为汤剂使用，也可以作为中间体，根据制剂需要调整浓度，加入适合辅料，加工成适宜的剂型。

实施例6提取液制备

分别称取金银花800g、金荞麦茎叶100g、鱼腥草30g、母菊250g、夏枯草800g、桑叶800g、菊花30g、紫苏20g、藿香20g、薄荷300g、葛根20g、甘草20g、生姜20g、大枣100g，加入12倍药材总重量的95％乙醇水溶液，超声提取2次，每次1小时，合并提取液，浓缩，并用蒸馏水调整浓度相当于生药浓度2.0g/mL。该提取液可以直接作为汤剂使用，也可以作为中间体，根据制剂需要调整浓度，加入适合辅料，加工成适宜的剂型。

实施例7提取液制备

分别称取金银花200g、金荞麦茎叶1200g、鱼腥草50g、母菊80g、夏枯草30g、桑叶300g、菊花300g、紫苏90g、藿香90g、薄荷120g、葛根200g、甘草60g、生姜60g、大枣600g，加入20倍药材总重量的10％乙醇水溶液，渗漉提取，合并提取液，浓缩，并用蒸馏水调整浓度相当于生药浓度0.5g/mL。该提取液可以直接作为汤剂使用，也可以作为中间体，根据制剂需要调整浓度，加入适合辅料，加工成适宜的剂型。

实施例8提取液制备

分别称取金银花60g、金荞麦茎叶60g、鱼腥草800g、母菊20g、夏枯草150g、桑叶100g、菊花600g、紫苏300g、藿香300g、薄荷100g、葛根80g、甘草30g、生姜60g、大枣10g，加入30倍药材总重量的95％乙醇水溶液，浸渍提取，合并提取液，浓缩，并用蒸馏水调整浓度相当于生药浓度1.5g/mL。该提取液可以直接作为汤剂使用，也可以作为中间体，根据制剂需要调整浓度，加入适合辅料，加工成适宜的剂型。

实施例9颗粒剂的制备

实施例1～8中任一实施例制备的提取液，浓缩，干燥成浸膏，取150g，加糊精300g，混匀，加入适量60％乙醇制成软材，过24目筛制粒，50℃干燥2小时，干燥颗粒过30目筛整粒，分装，即得。

实施例10胶囊剂的制备

实施例1～8中任一实施例制备的提取液，浓缩，干燥成浸膏，取150g，加糊精300g，混匀，加入适量60％乙醇制成软材，过24目筛制粒，50℃干燥2小时，干燥颗粒，填充装胶囊。

实施例11合剂/口服液/糖浆剂的制备

实施例1～8中任一实施例制备的提取液，浓缩，加适当制药辅料(白糖、蜂蜜、苯甲丙酸或羟苯乙酯等)，调整浓度，即可制成合剂、口服液或糖浆剂。

实施例12气雾剂的制备

实施例1～8中任一实施例制备的提取液，加入乙醇、香精、防腐剂等，调整浓度至1～100mg/mL，以丙、丁烷作为抛射剂，灌装气雾剂瓶，制成气雾剂。

实施例13本发明中药组合物抗病毒活性测定

1实验目的

观察本发明中药组合物对常见导致呼吸道感染病毒的抑制作用。

2实验材料

2.1试剂

DMEM培养基(TBD10565，天津灏洋)、双抗(青链霉素混合液，批号：BL-XB-0197，博光生物)、磷酸盐缓冲液(PBS，PB2004Y，天津灏洋)、胎牛血清(FBS，10099-141，美国Gibco公司)、EDTA-0.25％胰酶(BL-XB-0168，博光生物)、噻唑蓝染液(MTT，BL-SJ-0717，博光生物)、利巴韦林注射液(辰欣药业股份有限公司，1410206811)；注射用阿昔洛韦(湖北午时药业股份有限公司，1704031)。

2.2仪器

双光束紫外可见分光光度计(TU-1901型，北京普析通用仪器有限责任公司)、CKX-41型倒置显微镜(日本Olympus公司)；HFsafe-1200TE型生物安全柜、MCO-15AC型CO₂细胞恒温培养箱(SANYO Electric Biomedical Co.Ltd.Japan)、TGL16M型台式多管自动平衡离心机(安亭，上海)、BT25S电子天平(十万分一，Sartorius，德国)。

2.3细胞株和病毒株

人恶性胚胎横纹肌肉瘤细胞(RD细胞)、恒河猴胚胎肾细胞(MA104细胞)、人喉癌上皮细胞(Hep2细胞)购自上海生博生物医药科技有限公司。手足口病毒(EV71)、单纯疱疹病毒1型(HSV-1)、呼吸道合胞病毒(RSV)、柯萨奇病毒B3型(CV-B3)、柯萨奇病毒B5型(CV-B5)由山东省医学科学院基础医学研究所提供。细胞培养液：取450mLDMEM培养基，加入50mL胎牛血清，2mL双抗，混匀，4℃冷藏。细胞维持液：将细胞培养液用DMEM培养基稀释5倍。

3实验方法

3.1供试药物溶液的制备

取实施例1、2、3、4、6、8中药组合物提取液，用0.22μm微孔滤膜滤过，-20℃冰箱保存，备用。

3.2阳性对照药的制备

阿昔洛韦注射液用2％DMSO细胞维持液配制，浓度为50mg·mL^-1；利巴韦林注射液采用原液，浓度为50mg·mL^-1。

3.3细胞复苏与培养将保存细胞的冻存管从液氮罐取出，立即投入37～42℃温水中融化，使细胞快速通过冻融过程。在超净工作台内，将细胞悬液转移到离心管中进行离心，离心机设定参数为转速800r·min^-1、时间5min。离心完毕后吸除上清液，加入细胞培养液，吸管轻吹沉淀的细胞，并将新得到的细胞悬液转移到培养瓶内，置于CO₂恒温培养箱(培养条件为37℃、5％CO₂、相对湿度75％)中培养，待细胞在瓶底铺满后进行传代培养。

3.4病毒的扩增

取处于指数生长期、生长状态良好的细胞，弃去培养液，用PBS清洗3次，加入病毒液0.5mL，置CO₂恒温培养箱中培养，每隔15min轻轻摇晃培养瓶，使病毒液与细胞充分接触。另设细胞对照，加入0.5mL细胞维持液，同上法培养。培养1h后，补充加入4.5mL细胞维持液，继续培养。待24h后镜检，当感染病变的细胞数量>90％时，停止培养。将细胞反复冻融3～4次，将病毒液转移至离心管进行离心，离心机设定参数为转速1000r·min^-1、时间5min，取上清液定量分装于冻存管中，封口，-80℃超低温冰箱保存备用。

3.5病毒毒力的测定

将扩增的病毒用细胞维持液以10倍比稀释，共设10个浓度梯度，顺次接种于铺满单层细胞的96孔细胞培养板中，每个浓度重复3次，另设细胞对照。按“3.4”项下方法培养。待24h后镜检观察病变，当感染病变的细胞数量>90％时，停止培养。每孔加入10μL5 mg·mL^-1的MTT染液，继续培养4h，吸弃染液，每孔加入100μL DMSO，室温避光脱色l0 min，用微孔板分光光度仪测定其在490nm处A值。

3.6提取液对细胞毒性的测定

中药组合物提取液用细胞维持液按2×比稀释，共设10个浓度梯度，依次接种于铺满单层细胞的96孔细胞培养板中，每孔100μL，每个浓度重复3次，另设细胞对照。按“3.4”项下方法培养。待24h后镜检观察细胞状态，按“3.5”项下方法测定A值。

3.7提取液抗病毒活性的测定

中药组合物提取液从无毒浓度起，用细胞维持液以2×比稀释10个浓度，加入到已长成单层细胞的96孔细胞培养板中，每孔100μL，再加入100μL病毒液，每个浓度重复3次，同时设阳性药(利巴韦林或阿昔洛韦)对照组、病毒对照组及细胞对照组。按“3.4”项下方法培养。待24h后观察细胞病变，待病毒对照出现>90％的病变时，按“3.5”项下方法测定A值。

4实验结果

4.1病毒毒力测定结果

根据Reed-Muench公式计算病毒液的半数感染浓度(tissue culture infectivedose，TCID₅₀)，细胞存活率＝各组A值/正常细胞A值×100％；细胞病变率＝1-细胞存活率；比距＝(高于50％病变率-50％)/(高于50％病变率-低于50％病变率)×100％；TCID₅₀＝Antilg(lg高于50％病变率病毒稀释度+比距)，结果见表1。

表1. 4种病毒TCID₅₀测定结果

4.2提取液对细胞毒性测定结果

应用Reed-Muench公式计算药物半数中毒浓度(half toxic concentration，TC₅₀)，结果见表2。

表2.提取液对3种细胞的TC₅₀测定结果(mg·mL^-1)

4.3抗病毒活性测定结果

应用Reed-Muench公式计算药物半数有效浓度(half effective concentration，EC₅₀)和治疗指数(treatment index，TI)，EC₅₀＝[Antilg(lg高于50％病变率病毒稀释度-比距)]×供试品药液初始浓度(C)；TI＝半数毒性浓度(TC₅₀)/半数有效浓度(EC₅₀)，结果见表3、4。表明中药组合物对这些病毒的抑制作用显著好于常用药利巴韦林、阿昔洛韦。

表3.提取液对5种病毒的EC₅₀测定结果(mg·mL^-1)

表4.提取液对5种病毒的TI测定结果

实施例14本发明中药组合物对免疫功能低下小鼠的免疫功能调节作用研究

1实验材料

1.1实验动物

健康SPF级昆明种小鼠40只，由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供，体重18～22g。

1.2仪器试剂

BT25S电子天平(十万分之一，Sartorius，德国)、酶标仪(ELx800 BIO-TEX，美国)、流式细胞仪(FACSCALIBUR Becton Dickson，美国)、双光束紫外可见分光光度计(TU-1901型，北京普析通用仪器有限责任公司)、小鼠IFN-γELISA Kit(High-sensitive)96T(碧云天，PI507)、小鼠分泌型免疫球蛋白A(secretory immunoglobulin A,SIgA)ELISA试剂盒(南京建成，H108-2)、乳酸脱氢酶试剂盒(南京建成，A020-2-2)、小鼠CD3、CD4及CD8荧光标记抗体(美国RD公司)、环磷酰胺注射液(江苏恒瑞医药股份有限公司，150109)。

1.3供试药物

按实施例1制备的中药组合物提取液。

2实验方法

2.1动物分组与造模

40只小鼠随机平均分为4组：正常对照组、正常用药组、免疫低下模型组(模型组)、模型用药组，每组10只。正常饲养1周后，模型组和模型用药组小鼠腹腔注射环磷酰胺注射液，剂量为80mg/(kg·d)，1次/d，连续3d，复制免疫低下小鼠模型。

2.2给药及取材

造模结束后开始用药，模型用药组和正常用药组灌胃给予中药组合物提取液1mL/只，正常对照组与模型组给予同等剂量的生理盐水。给药1周后，眶静脉取血，抗凝管收集，4℃冷藏备用。脱颈处死小鼠，剖开胸腔，暴露气管，从气管中部剪倒“T”形切口，移液器吸取200μL的磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffered saline，PBS)从切口端向上冲洗鼻咽部，收集从鼻、咽部流出的冲洗液，冲洗3次，共600μL，2000r/min，离心10min，4℃保存备用。剖取小鼠脾脏，滤纸吸去表面残血，立即于精密天平称其湿质量，计算脏器质量指数。取小鼠抗凝血，加入CD₃、CD₄、CD₈荧光抗体，流式细胞仪检测CD₃ ⁺、CD₄ ⁺、CD₈ ⁺含量及CD₄ ⁺/CD₈ ⁺比值；LDH释放法测定自然杀伤细胞(natural killer,NK)活性率；ELISA方法测定血清INF-γ和呼吸道分泌物中SIgA含量。

2.3统计学方法

计量资料数据用

表示，采用SPSS 13.0统计软件对实验结果进行统计分析，采用单因素方差分析进行组间比较，检验水准α＝0.05。

3实验结果

对小鼠免疫功能的影响造模结束后l周，模型组小鼠的T细胞亚群CD₃ ⁺、CD₄ ⁺细胞数及CD₄ ⁺/CD₈ ⁺比值及血清INF-γ含量、NK细胞杀伤活性、脾指数以及鼻咽部分泌物中SIgA均显著低于正常组。造模动物用药1周后，CD₃ ⁺、CD₄ ⁺/CD₈ ⁺比值、NK细胞杀伤活性、脾指数、SIgA含量均显著升高，CD₄ ⁺、血清INF-γ与模型组比较呈现上升趋势，结果见表5、6。表明该中药组合物能显著提高免疫功能低下小鼠的免疫水平，尤其是可以提高呼吸道黏膜免疫功能。

表5.小鼠T淋巴细胞亚群含量测定结果

注：与正常对照组比较，^＊P<0.05，^＊＊P<0.01，与模型组比较，^#P<0.05

表6.小鼠INF-γ含量、NK细胞杀伤活性、脾指数及呼吸道SIgA含量

注：与正常对照组比较，^＊P<0.05，^＊＊P<0.01，与模型组比较，^#P<0.05。

Claims

1.一种抗病毒中药组合物，其特征在于，由以下重量份的原料药制备而成：金银花18份、金荞麦茎叶18份、鱼腥草12份、母菊12份、夏枯草12份、桑叶9份、菊花9份、紫苏9份、藿香9份、薄荷9份、葛根12份、甘草6份、生姜6份、大枣6份。

2.根据权利要求1所述的抗病毒中药组合物，其特征在于，所述的中药组合物为气雾剂。

3.权利要求1或2所述的中药组合物在制备抗病毒药物中的应用。

4.权利要求1或2所述的中药组合物在制备防治以病毒为主导致的呼吸道感染药物中的应用。