CN102836200A

CN102836200A - 余甘子在制备抗h1n1流感的药物中的应用

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Publication number: CN102836200A
Application number: CN2012103281120A
Authority: CN
Inventors: 许仕杰; 李耿; 赖小平; 姚海燕
Original assignee: GUANGDONG SONGSHANHU ZHENDE BIOLOGICAL MEDICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: GUANGDONG SONGSHANHU ZHENDE BIOLOGICAL MEDICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2012-09-06
Filing date: 2012-09-06
Publication date: 2012-12-26
Anticipated expiration: 2032-09-06
Also published as: CN102836200B

Abstract

本发明涉及余甘子在制药中的用途，具体涉及余甘子在制备抗H1N1流感的药物中的应用。本发明所述的抗H1N1流感的药物是余甘子黄酮提取物与常规用量的医学上可接受的辅料混合制成的临床上可接受的制剂。本发明所述的药物对H1N1型流感病毒致细胞病变（CPE）具有明显的抑制作用，在临床上可显著降低感染者肺指数，减轻感染者病毒性肺炎症状。

Description

余甘子在制备抗H1N1流感的药物中的应用

技术领域

本发明涉及中药单方余甘子，具体涉及余甘子在制药中的用途。

背景技术

流感是由流感病毒引发的一种比普通感冒更为严重的急性呼吸道传染病，其特点为起病急、传染性强、发病率高、病程长。目前防治流感的最有效手段是接种流感疫苗，但由于流感病毒变异性强，可使现有疫苗失效，从而加大了防治的难度。

目前，抗流感病毒的药物研究已取得初步成果，已有病毒唑和达菲等四种药物在国外正式上市。但是，流感病毒发生变异，对这些药物产生了不同程度的耐药性，且大多数的西药都可能导致严重的副作用。而天然产物在抗病毒方面有其独特作用，具有阻止病毒致细胞病变、抑制病毒复制、调节免疫功能、改善肺循环等综合功效，特别是毒副作用相对低，不易形成耐药性的优点，所以从天然产物及其提取单体化合物中筛选新型抗病毒药物具有潜在的优势。

流行感冒属于中医温病学的风温、春温的范畴，流感病毒相当于温病学的温邪。当气候突变，寒暖失常，机体腠理疏松，卫外不顾，易为温邪乘虚而入。“温邪上受，首先犯肺，逆传心包”，温邪从皮毛口鼻而入，肺卫首当其冲。若失治误治，病情发展，可传入气分，或热毒炽盛病邪直入气分，表现出高热头痛，咽痛咳嗽，周身酸痛。若进一步恶化，热入营血，出现热扰心神或热盛动风等危急症候。总结流感的证候特点：热毒炽盛，传变迅速，以肺系病变为主。

中医治疗流感，通过辨证辨识病因病机，根据温病学理论，制订治疗法则和方案。病初、中期多采取辛凉解表、清热解毒的治疗原则；病后期则采用清营凉血、壮水制火、扶正祛邪的治则，临床在预防时则用扶正的中草药进行组方、用药。

近年来,国内外开展了很多中医药抗流感病毒的实验研究。Nagai等报道，黄芩中提取的黄酮类化合物通过抑制病毒包涵体/溶酶体膜的融合，能减少流感病毒感染小鼠的病毒复制。Utsunomiya等报道，甘草皂苷可以提高流感病毒感染小鼠生存率，延长生存时间，降低肺病毒滴度；但体外实验表明，甘草皂苷对于病毒生存和复制无影响。李氏等报道，小儿热速清口服液对流感病毒感染小鼠具有一定的保护作用。Kobayashi等研究表明，银翘散及甘草、牛蒡子提取物治疗流感病毒感染小鼠，均能使生存时间延长、生存率提高。Nagai等研究表明，小青龙汤可以抑制流感病毒感染小鼠的肺内病毒复制，抑制病毒从鼻向肺传播，增加支气管肺泡灌冼液中IgA抗体含量。中药新药连花清瘟胶囊，对流感病毒甲三、副流感病毒Ⅰ型、呼吸道合胞病毒、腺病毒三型和七型、单纯疱疹病毒一和二型均显示出一定的抑制作用；对流感病毒甲三、副流感病毒Ⅰ型、呼吸道合胞病毒抑制作用强大；近期研究显示其还具有一定的抗禽流感（H5N1）病毒作用。

余甘子是大戟科植物油柑的果实，分布于我国的福建、广东、广西、云南等省及东南亚、印度等地。其营养价值丰富。经分析，发现含12种维生素、18种氨基酸、16种宏量和微量元素，富含鞣质、有机酸、酚类等，果仁中还含有不饱不口脂肪酸。余甘子的价值不仅体现在营养上，更重要的是还有药用价值，它是卫生部颁布的既是食品又是药品的一种果品。我国古代药膳《异物志》、《唐本草》、《本草拾遗》及《本草纲目》中对其药用价值均有论述。

现全世界有17个国家或民族在自己的传统药中使用余甘子。在这些药中，余甘子与35种治疗功效有关(便秘，止血，消化不良，肠胃炎，止泻，健胃，眼科疾病，镇咳，保肝，利尿，癌症，肿瘤，哮喘，解热，皮肤病，高血压，贫血，疟疾，胆囊疾病，黄疸，生殖系统疾病，妇科疾病，坏血病，鼻炎，感冒等)。通过现代医药学研究，发现余甘子具有抗氧化、抗衰老、降脂减肥、抗癌、降血糖、抗菌和抗乙肝病毒的作用，但未见余甘子及其提取物抗流感病毒的报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供余甘子的新用途，即在制药中的应用。

具体是，提供余甘子在制备抗H1N1流感的药物中的应用。

本发明所述的应用，其中所述的药物是余甘子黄酮提取物与常规用量的医学上可接受的辅料混合制成的临床上可接受的常见的制剂，如，片剂、胶囊、滴丸、软胶囊。

本发明所述的余甘子黄酮提取物可采用常见的从植物中分离黄酮的方法获得，本发明人推荐的方法如下：

一种余甘子黄酮提取物的制备方法，该方法由以下步骤组成：取余甘子原料药，加入7～10倍(质量体积倍)的水提取1～3次，滤过，收集滤液，浓缩至相当于每毫升（ml）药液中含余甘子原料药0.8～1.2g，加入盐酸溶液调节pH值至2～5，过滤；滤液过大孔吸附树脂柱，先用水洗至流出液的酸碱度为中性(PH=7)，再用体积浓度为70～80％的乙醇洗柱，收集乙醇洗脱液并浓缩至每毫升药液中含余甘子原料药0.8～1.2g，浓缩液用正丁醇萃取，浓缩萃取液，干燥，得粉末状余甘子黄酮提取物。

本发明所述的药物对H1N1型流感病毒致细胞病变（CPE）具有明显的抑制作用，在临床上可显著降低感染者肺指数，减轻感染者病毒性肺炎症状。

为了公众能更好地理解本发明的有益效果，下面将通过实施例和药理实验进一步阐明。

附图说

图1为测定总黄酮的标准曲线，其中，图例

为用实际检测结果绘制的曲线，图例——为回归后的标准曲线。

具体实施方式

例1

（Ⅰ）余甘子黄酮提取物的制备

取余甘子药材2000g，加入10倍量水提取3次，滤过，收集滤液，浓缩至2500ml，加入盐酸液调pH至3～4，滤过；滤液过D-101大孔吸附树脂柱，先用水洗至流出液的酸碱度为中性，再用加入体积浓度为70％的乙醇洗柱，收集乙醇洗脱液并浓缩至每毫升药液中含余甘子原料药1g，浓缩液用正丁醇萃取，浓缩萃取溶液，得，干燥，得粉末状余甘子黄酮提取物。

（Ⅱ）余甘子黄酮提取物中总黄酮的测定

1.仪器与试剂

1.1仪器

SPECTRONIC GENESYSTM 2紫外—可见光分光光度计（美国SPECTRONIC公司），CP225电子天平（德国赛多利斯公司）。

1.2试剂与样品

槲皮素对照品（广州中医药大学新药中心提供），余甘果提取物（广州中医药大学新药中心提供），亚硝酸钠（分析纯，天津市大茂化学试剂厂），硝酸铝（分析纯，天津市大茂化学试剂厂），氢氧化钠（分析纯，天津市福晨化学试剂厂），乙醇（分析纯，天津市大茂化学试剂厂），甲醇（分析纯，天津市大茂化学试剂厂）。

2方法

2.1余甘子黄酮提取物样品处理

称取步骤（Ⅰ）所得到的余甘子黄酮提取物100mg，精密称定，置100ml容量瓶中，60%乙醇50ml，超声溶解，放冷，定容，待用。

2.2可见分光光度法标准曲线的绘制

2.2.1对照品溶液的配备：精密称取120℃干燥恒重的槲皮素对照品0.05013g，用体积分数60％微热乙醇定容至100mL，摇匀，即得质量浓度为0.5013mg／mL的应用母液。

2.2.2质量分数5%NaNO₂溶液的配制：称取亚硝酸钠5g，置100ml容量瓶中，定容至刻度，摇匀，即得。

2.2.3质量分数10%Al（NO₃）₃溶液的配制：称取硝酸铝10g，置100ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度摇匀，即得。

2.2.41mol/LNaOH溶液的配制：称取氢氧化钠颗粒4g，置100ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度摇匀，即得。

2.2.5乙醇（60%）溶液的配制：移取63ml乙醇（95%）置100ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，摇匀，即得。

2.2.6乙醇（30%）溶液的配制：移取32ml乙醇（95%）置100ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，摇匀，即得。

2.3标准曲线的绘制

2.3.1精密移取槲皮素对照品母液0，1，2，3，4，5ml分别于6只10ml容量瓶中，各加体积分数60%乙醇至5ml，然后再各自加质量分数5%NaNO2溶液0.3ml，摇匀，放置6min。加质量分数10%Al（NO3）3溶液0.3ml，摇匀，放置6min。加1mol/LNaOH溶液4ml，加水0.4ml，摇匀，放置10—15min。每管不同质量浓度的槲皮素对照品总体积均为10ml。于510nm波长处测定光谱吸收比，结果见表1。

表1对照品槲皮素与吸光度

测得值经最小二乘法进行线性回归，分析得回归方程Y＝2.5371X－0.0385，其线性范围为0.5013～2.5065mg，相关系数r＝0.9986。上述方程所对应的标准曲线如图1所示。

2.3.2精密度试验精密吸取对照品溶液3ml，共5份，分别置10ml容量瓶中，按标准曲线绘制项下方法进行操作，随行空白，于510nm波长处测定其吸光度。结果如表2。

表2精密度测试结果

2.3.3样品测定精密移取余甘子黄酮提取物试液各2ml分别加入10ml容量瓶中，加60%乙醇定容至刻度，摇匀。精密移取相应稀释液3ml3份分别置10ml容量瓶中，加30%乙醇至5ml。然后再各加质量分数5%NaNO2溶液0.3ml，摇匀，放置6min。加质量分数10%Al（NO3）3溶液0.3ml，摇匀，放置6min。加1mol/LNaOH溶液4ml，加水0.4ml，摇匀，放置10—15min。同时以体积分数为60%乙醇显色试剂作对照，于510nm波长处测定吸光度，查标准曲线，然后计算出提取物中总黄酮含量，结果如下表3。

表3余甘子样品黄酮含量测定结果

（Ⅲ）治疗流感药物的制备（片剂）

1、处方：

步骤（Ⅰ）所得到的余甘子黄酮提取物100mg，淀粉200g。

2、制备方法

将提取物粉末加入淀粉，混匀，制成颗粒，60℃以下干燥，压制成1000片（0.20g/片），包薄膜衣，即得。

例2

（Ⅰ）余甘子黄酮提取物的制备

取余甘子药材1500g，加入8倍量水提取3次，滤过，收集滤液，浓缩至1500ml，加入盐酸液调pH至2～3，取酸性滤液过大孔吸附树脂柱，所用大孔树脂型号为D-101-I，先用水洗至流出液中性；再用加入70％浓度的乙醇洗柱；收集乙醇洗脱液并浓缩至每毫升药液中含余甘子原料药1.2g；浓缩物水液用正丁醇萃取；浓缩正丁醇萃取溶液，得余甘子提取物粉末。

（Ⅱ）余甘子黄酮提取物中总黄酮的测定

采用例1相同的方法对本例所述方法得到的余甘子黄酮提取物进行测定，所述提取物中总黄酮含量为50%。

（Ⅲ）治疗流感药物的制备（滴丸）

1、处方：

步骤（Ⅰ）所得到的余甘子黄酮提取物100mg，聚乙二醇（4000）170g，二甲硅油200ml。

2、制备方法

取170g聚乙二醇4000，70℃水浴加热使熔融，加入余甘子提取物，混匀，滴入冷却的二甲硅油中，制成滴丸1000丸（0.21g/丸）。服用剂量为：每天2次，每次2丸。

例3

（Ⅰ）余甘子黄酮提取物的制备

取余甘子药材1000g，加入7倍量水提取2次，滤过，收集滤液，浓缩至835ml，加入盐酸液调pH至4～5，滤过；取酸性滤液过大孔吸附树脂柱，所用大孔树脂型号为AB-8，先用水洗至流出液中性；再用加入80％浓度的乙醇洗柱；收集乙醇洗脱液并浓缩至每毫升药液中含余甘子原料药0.8g；浓缩物水液用正丁醇萃取；浓缩正丁醇萃取溶液，得余甘子提取物粉末。

（Ⅱ）余甘子黄酮提取物中总黄酮的测定

采用例1相同的方法对本例所述方法得到的余甘子黄酮提取物进行测定，所述提取物中总黄酮含量为44%。。

（Ⅲ）治疗流感药物的制备（胶囊）

1、处方：

步骤（Ⅰ）所得到的余甘子黄酮提取物100mg，淀粉350g，1号硬胶囊1000粒

2、制备方法

去余甘子提取物粉末，加淀粉至350g，混匀，制成颗粒，60℃以下干燥，过筛，装入1号胶囊，制成硬胶囊1000粒（0.35g/粒）。服用剂量为：每天2次，每次2粒。

例4（体外效果实验）

1、受试药物

1.1实验组所用药物

实验组1：实施例1所制得的余甘子黄酮提取物加蒸馏水制备成浓度为3g/ml生药量的水溶液。

实验组2：实施例2所制得的余甘子黄酮提取物加蒸馏水制备成浓度为3.2g/ml生药量的水溶液。

实验组3：实施例3所制得的余甘子黄酮提取物加蒸馏水制备成浓度为3.8g/ml生药量的水溶液。

1.2对照组所用药物：病毒唑，由湖北医药工业研究所提供，批号：060408。

2、实验方法

（1）药物对细胞毒性试验：将对流感病毒H1N1易感的MDCK细胞分别用0.25%胰酶1ml加Versene消化液4ml消化后，加生长液吹落、混匀，100ul/孔接种于96孔细胞培养板，37℃、5％CO2，中培养24h～48h后生长成单层细胞，弃去培养液，待用。将受试样品做2倍连续稀释6个浓度进行粗筛。每一浓度接种事先准备好的细胞3孔，每孔100ul。将阳性对照药病毒唑，按不同的浓度稀释，每浓度4孔，每孔100ul。同时设正常细胞MDCK，37℃，5％CO2，中培养。第二日起，在倒置显微镜下逐日观察细胞形态，以每孔小于25％，病变为+：25％～50％为++；50％～75％为+++；。75％～100％为++++(以病变++++为终点，观察时间为4d)。根据Reed-Muench法计算最大无毒浓度TC₀和半数有毒浓度TC₅₀。

（2）药物对流感病毒H1N1致细胞病变（CPE）的抑制作用：将MDCK细胞接种于96孔细胞培养板，每孔0.1ml。细胞数为2×10⁵个/ml，待24小时长成完整单层。以100TCID₅₀的病毒量吸附细胞1h，将药物用维持液稀释成不同浓度，抛掉原培养液后将无毒浓度下的不同浓度（倍比稀释）药液加入细胞孔中，0.1ml/孔。实验时设病毒对照、细胞对照、药物毒性对照及阳性药（病毒唑）对照。置37℃、5%CO₂培养箱中培养。每天在倒置显微镜下观察病变并记录。当病毒对照孔细胞出现+++病变时，继续观察4天则终止，未出现病变则用血凝试验测定。并计算治疗指数TI,治疗指数(TI)作为评价指标来衡量药物对病毒抑制的效力,指数大于1为有效,指数越大,安全范围越大。

3、实验结果

（1）药物的细胞毒性：实验组1提取液TC₀为300μg/ml，实验组2提取液TC₀为275μg/ml，实验组3提取液TC₀为226μg/ml。

（2）抑制作用：如下表

表4：余甘子黄酮提取物及病毒唑体外抗H1N1流感病毒药效结果

4结论：结果表明，病毒唑在4.1μg/ml浓度下对H1N1流感病毒有抑制作用；实验组均具有抑制流感病毒H1N1的作用，且实验组1和实验组2治疗指数略优于病毒唑。

由以上实验结果可看出，以黄酮类化合物为主要特征的实例1、2、3提取物对H1N1流感病毒所致细胞病变有明显的抑制作用，表明余甘子黄酮提取物在具有明显抗H1N1流感病毒的作用。

例5（体内效果实验）

1.受试药物

2.实验方法

（1）余甘子对H1N1流感病毒感染小鼠的治疗作用：将SPF级小鼠随机分成六组，分别为空白对照组、病毒唑组、病毒对照组、实验组1、实验组2、实验组3，每组12只。将小鼠用乙醚轻度麻醉，用H1N1亚型禽流感病毒鼠肺适应株15个LD50（LD50=10^-2.90）病毒浓度，滴鼻感染，每鼠4滴，约0.05ml。在攻毒后2小时开始给药。共给药4天，每天1次，0.2ml/10g体重灌胃给药，病毒对照组及空白组以等体积生理盐水灌胃。感染后4天，称小鼠体重，杀剖小鼠（杀剖前禁食禁水12小时），观察肺组织的病变程度，并取肺称重。按以下公式计算肺指数与肺指数抑制率：

（2）余甘子对H1N1感染小鼠的死亡保护作用：将SPF级小鼠随机分成六组，分别为空白对照组、病毒唑组、病毒对照组、实验组1、实验组2、实验组3，每组12只。将小鼠用乙醚轻度麻醉，用H1N1亚型禽流感病毒鼠肺适应株2个LD₅₀（LD₅₀=10^-2.90）病毒浓度，。病毒攻击6小时后连续给药10天，0.2ml/10g体重每天灌胃给药一次，病毒对照组及空白组以等体积蒸馏水灌胃。逐日观察动物发病情况并记录死亡数，共观察15天，按公式计算死亡保护率和生命延长率。

3实验结果

（1）对病毒性肺炎的治疗结果

解剖小鼠肺组织时发现，空白对照组小鼠肺组织红白色，无肿大，无瘀斑；病毒对照组小鼠肺组织颜色黯红色，肿大，有瘀斑；与病毒对照组比较，余甘子各个剂量组小鼠肺组织颜色变浅，肿大减小，瘀斑减少，说明炎症均有一定程度减轻。

各组小鼠肺指数和肺指数抑制率结果见下表5。统计结果显示，与空白对照组比较，病毒对照组的肺指数显著升高（P<0.01），提示成功复制小鼠病毒性肺炎模型；与病毒对照组比较，病毒唑组肺指数显著降低，提示造模成功。与病毒对照组比较，实验组1、实验组2、实验组3可显著抑制H1N1型流感病毒所致小鼠肺部炎症（P<0.01）。

表5余甘子提取物对病毒性肺炎小鼠肺指数的影响

注：与空白对照组比较，aP<0.01；与病毒对照组比较，bP<0.01；“-”表示无该项。

（2）对感染小鼠的死亡保护作用

攻毒后每天观察各组小鼠活动状态，发现空白对照组小鼠体重增加，行为敏捷，毛发有光泽，呼吸正常；病毒对照组，在感染后第3天开始，小鼠食欲明显下降，随后逐渐出现耸毛、甩头，呼吸短促现象，并伴随腹式呼吸，行动迟缓无力，弓背，消瘦，体重减轻，第5天开始出现死亡，部分小鼠死前出现明显的神经症状，如打转等。与病毒对照组比较，各给药组动物多数症状减轻。

各组死亡率、平均存活时间和生命延长率结果见下表6。统计结果显示：病毒对照组的小鼠在攻毒5天后全部死亡，与空白对照组比较，病毒对照组小鼠死亡数明显增加，平均生存时间显著减少（P<0.01），提示成功复制小鼠死亡保护模型；与病毒对照组比较实验组1、实验组2和实验组3小鼠存活时间显著延长（P<0.01），存活率也显著提高（P<0.01）。

表6余甘子水提物提取物对病毒感染小鼠的死亡保护结果

注：与空白对照组比较，^aP＜0.01；与病毒对照组比较，^bP＜0.01；“-”表示无该项。

4结论

实例1、2、3的余甘子黄酮提取物均能抑制小鼠肺指数，减轻感染小鼠病毒性肺炎症状，延长感染小鼠存活时间，降低死亡率，对H1N1型流感病毒有抑制作用。

Claims

1.余甘子在制备抗H1N1流感的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的药物是余甘子黄酮提取物与常规用量的医学上可接受的辅料混合制成的临床上可接受的制剂。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的药物是片剂、胶囊、滴丸或软胶囊。

4.一种权利要求2或3所述的余甘子黄酮提取物的制备方法，该方法由以下步骤组成：

取余甘子原料药，加入7～10倍的水提取1～3次，滤过，收集滤液，浓缩至相当于每毫升药液中含余甘子原料药0.8～1.2g，加入盐酸溶液调节pH值至2～5，过滤；滤液过大孔吸附树脂柱，先用水洗至流出液的酸碱度为中性，再用体积浓度为70～80％的乙醇洗柱，收集乙醇洗脱液并浓缩至每毫升药液中含余甘子原料药0.8～1.2g，浓缩液用正丁醇萃取，浓缩萃取液，干燥，得粉末状余甘子黄酮提取物。