CN101129455B - 苦豆子提取物及其生产方法和应用 - Google Patents

Abstract

一种苦豆子提取物及其生产方法和应用。该苦豆子提取物含有生物碱类成分和黄酮类成分。该生产方法按第一步水或乙醇粗提、第二步用乙醇沉淀杂质、第三步用大孔吸附树脂吸附粗提物中的提取物；第四步用溶剂洗脱得到提取物的洗脱液、第五步将洗脱液浓缩回收乙醇得到苦豆子提取物。本发明能同时富集苦豆子粗提物中的生物碱类成分和黄酮类成分，工艺可靠，提取物中生物碱类成分和黄酮类成分的含量稳定；其生产成本大大降低，并解决了现有技术对人员和环境危害大等问题，更适合于产业化。本发明所得苦豆子提取物经实验研究表明具有显著的抗流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒以及爱滋病毒作用，且口服毒性较低，可应用于制备广谱抗病毒药物。

Description

苦豆子提取物及其生产方法和应用

技术领域

本发明涉及从植物中提取的提取物及其生产方法和应用的技术领域，是一种苦豆子提取物及其生产方法和应用。

背景技术

病毒感染是人类最常见的疾病之一，其症状可以从不显性感染直至危及生命，由于缺乏有效的治疗手段，病毒性疾病成为人类健康的巨大的威胁。

流感病毒是引起流感的主要病原体，其传染性强，致病力高，机体感染后往往会导致多系统的损害。由于目前还没有能有效预防和控制流感病毒感染的手段，每年的流感流行严重危害着人类的健康，并由此造成巨大的社会负担和经济损失。由于流感病毒的基因突变率很高，人类无法通过注射疫苗获得持久的免疫力。

呼吸道合胞病毒和副流感病毒是引起婴幼儿下呼吸道严重感染的重要病原，目前尚无有效的疫苗。

腺病毒主要引起人呼吸道和眼部感染，通过疫苗接种预防感染仍存在许多问题，目前无有效的治疗药物。

爱滋病毒是引起爱滋病的病因，人体感染后免疫功能被逐渐破坏，最终继发危及生命的各类并发症。到目前为止，爱滋病疫苗的研制还没有取得突破性的进展。

因为所有病毒均依赖宿主细胞进行复制和增殖，它们一方面干扰宿主细胞的代谢，一方面又与宿主共存亡，所以既能有效地杀灭病毒，同时又能使人体细胞免受伤害是现代科学还有待解决的难题。目前在国际上已得到公认的几种广谱抗病毒药如干扰素、利巴韦林等，对流感病毒、副流感病毒、合胞病毒等呼吸道病毒均有抑制活性，齐多夫定和拉米夫定对爱滋病毒有明显的抑制作用，但这些西药在临床使用中还存在一些无法克服的问题，如适应症有限，疗效不理想、副作用大或易产生耐药性等。可以说到目前为止，国际上还没有一种理想的抗病毒药物上市，而预防性疫苗的研究状况也不容乐观。此外，现有的抗病毒西药价格较高，限制了它们在临床的广泛使用，很多患者因负担不起昂贵的药费而得不到有效的治疗。所以说病毒性疾病的防治是世界医学领域的重大难题之一，特别是流感、爱滋病等，更是人类难以有效控制的世界性瘟疫。因此，开发高效广谱的抗病毒药物是国际医药学界迫切需要取得突破的科研课题。

与西药相比，中药在治疗病毒性疾病方面有其独到之处，不仅对病毒本身具有抑制作用，还可以通过调节机体的免疫功能控制疾病的发展，帮助人体对抗病毒的侵害。因此中药抗病毒研究在国际上越来越受重视。

目前，从苦豆子及其同属植物苦参中制备提取物的现有技术都是针对生物碱类进行纯化，其工艺流程复杂，使用多种有机溶媒萃取生物碱：药材经乙醇回流提取后，提取液作酸化处理，用20％的苯类溶剂提取生物碱；分出的酸水层碱化后，用20％的苯或氯仿或乙酸乙酯萃取生物碱；再将所得的萃取液合并转入10％的硫酸水溶液中，使生物碱成盐转入酸水中，收集酸水液作为总碱液(公开号CN1273870A的中国专利文献公开了发明名称为“苦豆子总碱液的制备工艺”的技术)；或者用苯、乙醚、环己烷、氯仿等溶媒分别萃取不同生物碱再合并(公开号CN1368502A的中国专利文献公开了发明名称为“苦豆子总碱的制备工艺”的技术)；或用稀盐酸渗漉提取，渗漉液通过阳离子树脂交换，树脂晾干后用20％的氨水碱化，将碱化树脂用氯仿回流提取生物碱，再将生物碱用95％的乙醇溶解精制苦参总碱(中国新医药2003年第2卷第六期公开了署名为邵方晓等的“苦参总碱浸膏提取工艺的研究”)。这些生产方法工序复杂、生产成本高，提取物所含有效成分单一(仅为生物碱类)，产品含量可控性差；另外大量使用苯、氯仿等毒性较大的有机溶剂，不仅回收再利用难，而且对人员和环境危害大，不适合规模化生产。

发明内容

本发明提供了一种苦豆子提取物及其生产方法和应用。该苦豆子提取物同时含有苦豆子中的生物碱类成分和黄酮类成分。该方法克服了上述现有技术之不足，生产工艺可靠，并特别解决了现有技术成本高、对人员和环境危害大的问题。本发明首次提出了弱极性大孔吸附树脂在苦豆子提取物生产方法中的应用。该苦豆子提取物特别能应用于制备广谱抗病毒药物。

本发明的技术方案之一是通过以下方式得到的：一种苦豆子提取物，其含有50％至70％的生物碱类成分和10％至20％的黄酮类成分。

下面是对上述技术方案之一的进一步优化和/或选择：

该苦豆子提取物按下述步骤得到：

第一步，将苦豆子的种子或全草以水或乙醇粗提，其中，水粗提为：将苦豆子的种子或全草加8倍量至12倍量水，在80℃至100℃下提取两次，每次2小时至3小时，过滤，合并滤液；乙醇粗提为：将苦豆子的种子或全草加8倍量至12倍量30％至70％的乙醇，在60℃至80℃提取两次，每次2小时至3小时，过滤，合并滤液；

第二步，将上述滤液浓缩后加相当于浓缩液体积1倍量至6倍量的无水乙醇，放置沉淀12小时至72小时，滤除沉淀得到乙醇溶液；

第三步，将上述乙醇溶液浓缩后以氢氧化钠和/或氨水调节PH值为7至14，上大孔吸附树脂层析柱吸附；

第四步，以相当于2至5个层析柱体积的去离子水冲洗上述层析柱，再以30％至90％的乙醇为洗脱剂洗脱层析柱，洗脱剂的用量相当于2至8个层析柱体积，流速为2至5个层析柱体积/小时，收集乙醇洗脱液并合并；

第五步，将上述乙醇洗脱液在80℃至100℃下浓缩成流浸膏，再在60℃至80℃下真空干燥，即得到所需的苦豆子提取物。

本发明的技术方案之二是通过以下方式得到的：

一种苦豆子提取物的生产方法按下述步骤进行：

第一步，将苦豆子的种子或全草以水或乙醇粗提；第二步，加乙醇沉淀粗提物中的杂质；第三步，以弱极性大孔吸附树脂吸附粗提物中的提取物；第四步，用乙醇从大孔吸附树脂上洗脱提取物得到洗脱液；第五步，将洗脱液浓缩回收乙醇得到苦豆子提取物；其中，弱极性大孔吸附树脂选用HPD400、HPD500、D-201、D-301、AB-8等型号的弱极性大孔吸附树脂中的一种。

下面是对上述技术方案之二的进一步优化和/或选择：

在上述第一步中，将苦豆子的种子或全草加8倍量至12倍量水在80℃至100℃下提取两次，每次2小时至3小时，过滤，合并滤液。

在上述第一步中，将苦豆子的种子或全草加8倍量至12倍量50％至90％的乙醇在60℃至80℃提取两次，每次2小时至3小时，过滤，合并滤液。

在上述第二步中，将滤液浓缩后加相当于浓缩液体积1倍量至6倍量的无水乙醇，放置沉淀12小时至72小时，滤除沉淀得到乙醇溶液。

在上述第三步中，将乙醇溶液浓缩后以氢氧化钠和/或氨水调节PH值为7至14，上大孔吸附树脂层析柱吸附。

在上述第四步中，以相当于2至5个层析柱体积的去离子水冲洗层析柱，再以30％至90％的乙醇为洗脱剂洗脱层析柱，洗脱剂的用量相当于2至8个层析柱体积，流速为2至5个层析柱体积/小时，收集乙醇洗脱液并合并。

在上述第五步中，将乙醇洗脱液在80℃至100℃下浓缩成流浸膏，并回收乙醇，在60℃至80℃下真空干燥，即得到所需的苦豆子提取物。

本发明的技术方案之三是通过以下方式得到的：弱极性大孔吸附树脂在苦豆子提取物生产方法中的应用。

下面是对上述技术方案之三的进一步优化和/或选择：

上述所用弱极性大孔吸附树脂可为D-201、D-301、HPD400、HPD500、AB-8等型号的弱极性大孔吸附树脂中的一种。

本发明的技术方案之四是通过以下方式得到的：上述苦豆子提取物应用于制备广谱抗病毒药物。

下面是对上述技术方案之四的进一步优化和/或选择：

上述苦豆子提取物用于制备针对流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒等呼吸道病毒或/和爱滋病毒的广谱抗病毒药物。

本发明所得苦豆子提取物不仅含有50％至70％的生物碱类成分，还含有10％至20％的黄酮类成分。该苦豆子提取物的生产方法采用了弱极性大孔吸附树脂吸附分离技术，能同时富集苦豆子粗提物中的生物碱类成分和黄酮类成分，工艺可靠，所得提取物有效成分含量稳定。该生产方法所需设备简单，使用的材料安全环保，并可通过树脂再生和乙醇回收反复利用，处理方法均简单易行。由于主要工业材料可循环利用，因而该生产方法的生产成本比现有技术大大降低，同时又解决了用氯仿、苯等溶剂萃取纯化生物碱所存在的溶剂损耗大、回收困难、生产成本高、对人员和环境危害大等问题。本发明生产方法比现有技术更适合于产业化。本发明所得苦豆子提取物经实验研究表明具有显著的抗流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒及爱滋病毒作用，且毒性较低。该苦豆子提取物可用于制备治疗流感和爱滋病等病毒性疾病的广谱抗病毒药物。

具体实施方式

本发明不受下述实施例的限制，可根据上述本发明的技术方案和实际情况来确定具体的实施方式。

下面结合实施例对本发明作进一步论述：

实施例1：苦豆子种子加8倍量水100℃煮提两次，每次2小时，过滤，合并滤液，浓缩至原体积的一半，加1倍量无水乙醇放置沉淀12小时，滤除沉淀，滤液浓缩后以氢氧化钠调节PH值为7，上大孔吸附树脂层析柱，待上样液全部吸附后，以5个层析柱体积去离子水冲洗层析柱，再以70％、80％、90％的乙醇进行梯度洗脱，每浓度乙醇用量为8个层析柱体积，流速为2个层析柱体积/小时，收集乙醇洗脱液，合并后80℃浓缩成流浸膏，60℃真空干燥，即得苦豆子提取物。弱极性大孔吸附树脂为D-201、D-301、HPD400、HPD500、AB-8牌号的弱极性大孔吸附树脂中的一种。

实施例2：苦豆子种子加10倍量水100℃煮提两次，每次2小时，过滤，合并滤液，浓缩至原体积的一半，加2倍量无水乙醇放置沉淀24小时，滤除沉淀，浓缩后以氢氧化钠调节PH值为9，上大孔吸附树脂层析柱，待上样液全部吸附后，以3个层析柱体积的去离子水冲洗层析柱，再以50％、60％、70％的乙醇进行梯度洗脱，每浓度乙醇用量为5个层析柱体积，流速为3个层析柱体积/小时，收集乙醇洗脱液，合并后80℃浓缩成流浸膏，60℃真空干燥，即得苦豆子提取物。弱极性大孔吸附树脂为D-201、D-301、HPD400、HPD500、AB-8牌号的弱极性大孔吸附树脂中的一种。

实施例3：苦豆子种子加12倍量水100℃煮提两次，每次2小时，过滤，合并滤液，浓缩至原体积的一半，加3倍量无水乙醇放置沉淀48小时，滤除沉淀，浓缩后以氢氧化钠调节PH值为11，上大孔吸附树脂层析柱，待上样液全部吸附后，以2个层析柱体积的去离子水冲洗层析柱，再以30％、40％、50％的乙醇进行梯度洗脱，每浓度乙醇用量为3个层析柱体积，流速为5个层析柱体积/小时，收集乙醇洗脱液，合并后80℃浓缩成流浸膏，60℃真空干燥，即得苦豆子提取物。弱极性大孔吸附树脂为D-201、D-301、HPD400、HPD500、AB-8牌号的弱极性大孔吸附树脂中的一种

实施例4：苦豆子种子加8倍量30％的乙醇80℃煮提两次，每次3小时，过滤，合并滤液，浓缩至原体积的一半，加4倍量无水乙醇放置沉淀24小时，滤除沉淀，浓缩后以氨水调节PH值为12，上大孔吸附树脂层析柱，待上样液全部吸附后，以5个层析柱体积的去离子水冲洗层析柱，再以70％、80％、90％的乙醇进行梯度洗脱，每浓度乙醇用量为5个层析柱体积，流速2个层析柱体积/小时，收集乙醇洗脱液，合并后80℃浓缩成流浸膏，60℃真空干燥，即得苦豆子提取物。弱极性大孔吸附树脂为D-201、D-301、HPD400、HPD500、AB-8牌号的弱极性大孔吸附树脂中的一种。

实施例5：苦豆子种子加10倍量50％的乙醇80℃煮提两次，每次3小时，过滤，合并滤液，浓缩至原体积的一半，加5倍量无水乙醇放置沉淀48小时，滤除沉淀，浓缩后以氨水调节PH值为13，上大孔吸附树脂层析柱，待上样液全部吸附后，以3个层析柱体积的去离子水冲洗层析柱，再以50％、60％、70％的乙醇进行梯度洗脱，每浓度乙醇用量为3个层析柱体积，流速为3个层析柱体积/小时，收集乙醇洗脱液，合并后80℃浓缩成流浸膏，60℃真空干燥，即得苦豆子提取物。弱极性大孔吸附树脂为D-201、D-301、HPD400、HPD500、AB-8牌号的弱极性大孔吸附树脂中的一种。

实施例6：苦豆子种子加12倍量70％的乙醇80℃煮提两次，每次3小时，过滤，合并滤液，浓缩至原体积的一半，加6倍量无水乙醇放置沉淀72小时，滤除沉淀，浓缩后以氨水调节PH值为14，上大孔吸附树脂层析柱，待上样液全部吸附后，以2个层析柱体积的去离子水冲洗层析柱，再以分别以30％、40％、50％的乙醇进行梯度脱，每浓度乙醇用量为2个层析柱体积，流速为5个层析柱体积/小时，收集乙醇洗脱液，合并后80℃浓缩成流浸膏，60℃真空干燥，即得苦豆子提取物。弱极性大孔吸附树脂为D-201、D-301、HPD400、HPD500、AB-8牌号的弱极性大孔吸附树脂中的一种。

实施例7：苦豆子全草加8倍量水100℃煮提两次，每次3小时，过滤，合并滤液，浓缩至原体积的一半，加1倍量无水乙醇放置沉淀12小时，滤除沉淀，浓缩后以氢氧化钠调节PH值为7，上大孔吸附树脂层析柱，待上样液全部吸附后，以5个层析柱体积的去离子水冲洗层析柱，再以70％、80％、90％的乙醇进行梯度洗脱，每浓度乙醇用量为8个层析柱体积，流速2个层析柱体积/小时，收集乙醇洗脱液，合并后80℃浓缩成流浸膏，60℃真空干燥，即得苦豆子提取物。弱极性大孔吸附树脂为D-201、D-301、HPD400、HPD500、AB-8牌号的弱极性大孔吸附树脂中的一种。

实施例8：苦豆子全草加10倍量水100℃煮提两次，每次3小时，过滤，合并滤液，浓缩至原体积的一半，加2倍量无水乙醇放置沉淀24小时，滤除沉淀，浓缩后以氢氧化钠调节PH值为9，上大孔吸附树脂层析柱，待上样液全部吸附后，以3个层析柱体积的去离子水冲洗层析柱，再以50％、60％、70％的乙醇进行梯度洗脱，每浓度乙醇用量为5个层析柱体积，流速3个层析柱体积/小时，收集乙醇洗脱液，合并后80℃浓缩成流浸膏，60℃真空干燥，即得苦豆子提取物。弱极性大孔吸附树脂为D-201、D-301、HPD400、HPD500、AB-8牌号的弱极性大孔吸附树脂中的一种。

实施例9：苦豆子全草加12倍量水100℃煮提两次，每次3小时，过滤，合并滤液，浓缩至原体积的一半，加3倍量无水乙醇放置沉淀48小时，滤除沉淀，浓缩后以氢氧化钠调节PH值为11，上大孔吸附树脂层析柱，待上样液全部吸附后，以2个层析柱体积的去离子水冲洗层析柱，再以30％、40％、50％的乙醇进行梯度洗脱，每浓度乙醇用量为3个层析柱体积，流速为5个层析柱体积/小时，收集乙醇洗脱液，合并后80℃浓缩成流浸膏，60℃真空干燥，即得苦豆子提取物。弱极性大孔吸附树脂为D-201、D-301、HPD400、HPD500、AB-8牌号的弱极性大孔吸附树脂中的一种。

实施例10：苦豆子全草加8倍量30％的乙醇80℃煮提两次，每次2小时，过滤，合并滤液，浓缩至原体积的一半，加4倍量无水乙醇放置沉淀24小时，滤除沉淀，浓缩后以氨水调节PH值为12，上大孔吸附树脂层析柱，待上样液全部吸附后，以2个层析柱体积的去离子水冲洗层析柱，再以70％、80％、90％的乙醇进行梯度洗脱，每浓度乙醇用量为5个层析柱体积，流速为2个层析柱体积/小时，收集乙醇洗脱液，合并后80℃浓缩成流浸膏，60℃真空干燥，即得苦豆子提取物。弱极性大孔吸附树脂为D-201、D-301、HPD400、HPD500、AB-8牌号的弱极性大孔吸附树脂中的一种。

实施例11：苦豆子全草加10倍量50％的乙醇80℃煮提两次，每次2小时，过滤，合并滤液，浓缩至原体积的一半，加5倍量无水乙醇放置沉淀48小时，滤除沉淀，浓缩后以氨水调节PH值为13，上大孔吸附树脂层析柱，待上样液全部吸附后，以3个层析柱体积的去离子水冲洗层析柱，再以50％、60％、70％的乙醇进行梯度洗脱，每浓度乙醇用量为3个层析柱体积，流速为3个层析柱体积/小时，收集乙醇洗脱液，合并后80℃浓缩成流浸膏，60℃真空干燥，即得苦豆子提取物。弱极性大孔吸附树脂为D-201、D-301、HPD400、HPD500、AB-8牌号的弱极性大孔吸附树脂中的一种。

实施例12：苦豆子全草加12倍量70％的乙醇80℃煮提两次，每次2小时，过滤，合并滤液，浓缩至原体积的一半，加6倍量无水乙醇放置沉淀72小时，滤除沉淀，浓缩后以氨水调节PH值为14，上大孔吸附树脂层析柱，待上样液全部吸附后，以2个层析柱体积的去离子水冲洗层析柱，再以30％、40％、50％的乙醇进行梯度洗脱，每浓度乙醇用量为2个层析柱体积，流速为5个层析柱体积/小时，收集乙醇洗脱液，合并后80℃浓缩成流浸膏，60℃真空干燥，即得苦豆子提取物。弱极性大孔吸附树脂为D-201、D-301、HPD400、HPD500、AB-8牌号的弱极性大孔吸附树脂中的一种。

实施例13，对上述实施例1至12所得苦豆子提取物进行总生物碱含量的测定：精密称取干燥至恒重的苦参碱对照品3.5毫克，置50毫升容量瓶中，加无水乙醇40毫升，密塞超声10分钟，放冷后加无水乙醇至刻度，摇匀，即得0.07毫克/毫升的对照品溶液，精密量取该对照品溶液0、1、2、3、4、5毫升分别置20毫升的具塞试管中，水浴加热挥尽乙醇，每管各加pH值7.6的溴麝香草酚蓝溶液2毫升，密塞振摇2分钟，每管再加氯仿6毫升、蒸馏水5毫升，密塞剧烈振摇5分钟，静置2小时后分取氯仿层，加无水硫酸钠0.5克，振摇1分钟，精密吸取上清液2.5毫升置10毫升容量瓶中，加氯仿至刻度，摇匀。以第一份溶液作为空白，于415纳米处测定吸收度，以浓度(C)对吸收度(A)进行回归，得回归方程。分别精密称取上述实施例1至12所得苦豆子提取物样品100毫克，置100毫升容量瓶中，加50％的乙醇80毫升，超声10分钟，放冷，加50％的乙醇至刻度，摇匀；取该溶液2.5毫升置25毫升容量瓶中，加无水乙醇至刻度，摇匀，得到浓度为0.1毫克/毫升的样品溶液。精密量取样品溶液1毫升，置20毫升具塞试管中，水浴加热挥尽乙醇，加pH值7.6的溴麝香草酚蓝溶液2毫升，密塞振摇2分钟，加氯仿6毫升、蒸馏水5毫升，密塞剧烈振摇5分钟，静置2小后分取氯仿层，加无水硫酸钠0.5克，振摇1分钟，精密吸取上清液2.5毫升置10毫升容量瓶中，加氯仿至刻度，摇匀，于415纳米处测定样品溶液的吸收度，代入上述回归方程，计算得上述实施例1至12所得苦豆子提取物样品中总生物碱的含量都在50％至70％的范围内。

实施例14，对上述实施例1至12所得苦豆子提取物进行总黄酮含量的测定：精密称取干燥至恒重的芦丁对照品25.16毫克，置50毫升的容量瓶中，加60％乙醇40毫升，置水浴上微热使溶解，放冷，加60％乙醇至刻度，摇匀，得到浓度为0.5032毫克/毫升的对照品溶液。精密量取该对照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0毫升，分别置10毫升的容量瓶中，各加60％乙醇至5毫升，加10％亚硝酸钠溶液0.3毫升，混匀，放置6分钟，然后再加入10％硝酸铝溶液0.3毫升，摇匀，放置6分钟，最后再加入1mol/L氢氧化钠溶液4毫升，加蒸馏水至刻度，摇匀，放置15分钟，以第1份溶液为对照，于500纳米处测定吸收度，以吸收度和浓度进行回归，得回归方程为。分别精密称取上述实施例1至12所得苦豆子提取物样品1.0g，置100毫升的容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀，得浓度为10毫克/毫升的样品溶液，精密量取该样品溶液1毫升，置10毫升的容量瓶中，加60％的乙醇至5毫升，再加10％的亚硝酸钠溶液0.3毫升，混匀，放置6分钟，加入10％硝酸铝溶液0.3毫升，摇匀，放置6分钟，再加入1mol/L氢氧化钠溶液4毫升，加蒸馏水至刻度，摇匀，放置15分钟，另取1毫升蒸馏水与样品溶液按同法处理，并以该溶液为对照溶液，在500纳米处测定样品溶液的吸收度，代入上述回归方程求出苦豆子提取物样品溶液的浓度，计算上述实施例1至12所得苦豆子提取物样品中总黄酮的含量都在10％至20％的范围内。

在本发明中：首次提出弱极性大孔吸附树脂在苦豆子提取物生产方法中的应用。特别是所用弱极性大孔吸附树脂最好为D-201、D-301、HPD400、HPD500、AB-8等型号的弱极性大孔吸附树脂中的一种。

将上述实施例所得一种新型的天然药物柧苦豆子提取物进行药效学试验，其过程和结果如下：

试验例1：本发明苦豆子提取物对5种呼吸道病毒致细胞病变的抑制作用。

实验目的：考察苦豆子提取物样品对流感甲、乙型流感病毒、1型副流感病毒、呼吸道合胞病毒和腺病毒3型的抑制活性。

实验原理：分别以狗肾传代细胞(MDCK)为流感病毒和副流感病毒的宿主，人宫颈癌细胞(Hela)为合胞病毒和腺病毒的宿主，通过观察样品对病毒引起细胞病变程度(CPE)的抑制作用，判断苦豆子提取物是否具有抗病毒作用。

材料和方法：

1、病毒株：流感甲型病毒(H₃N₂亚型粤防72243株)，流感乙型病毒(济防97-13株)，1型副流感病毒(HVJ-1)、呼吸道合胞病毒(RSV)、腺病毒3型(A₃)分别购自中国预防医学科学院病毒学研究所及儿科研究所。

2、样品：本发明所得苦豆子提取物；阳性对照药利巴韦林，浙江康裕药业有限公司生产，批号960501。

3、方法与结果

样品对MDCK细胞毒性的测定：

苦豆子提取物用培养液作2倍稀释，取2000微克/毫升至62.5微克/毫升6个浓度，加到接种MDCK和Hela细胞并已长成单层的培养板中，100微升/孔，每浓度4个复孔，同时设细胞对照。将培养板置37℃、5％C0₂条件培养四天，每日观察细胞生长情况，以细胞不出现明显退变的最小稀释倍数为最大无毒浓度(TC₀)。并按Reed-Mueneh法计算50％有毒浓度(TC₅₀)。

表1样品对培养细胞的TC₀和TC₅₀

药液	原液微克/毫升	TC<sub>0</sub>微克/毫升	TC<sub>50</sub>微克/毫升
				本发明所得苦豆子提取物	2000	250	925.6
利巴韦林	100		＞100

样品对病毒致细胞病变的影响：

实验设细胞对照组、病毒对照组和不同稀释度的给药组，每组4个平行孔。取已长成单层的MDCK细胞，接种流感甲型病毒10^-5(50％细胞培养感染量CCID₅₀的15倍)、流感乙型病毒10^-2(CCID₅₀的30倍)，于37℃吸附2小时后倾去病毒液，以不含血清的维持液洗细胞表面2次。细胞对照组、病毒对照组加等体积的维持液，给药组分别加入不同稀释度的药物。37℃、5％CO₂条件培养，每日观察细胞病变情况，细胞病变程度按六级标准判断(-：无病变；±：细胞病约占整个单层的10％以下；1：细胞病变约占整个单层的25％以下；2：细胞病变约占整个单层的50％以下；3：细胞病变约占整个单层的75％以下；4：细胞病变约占整个单层的75％以上)。

当病毒对照组细胞病变为4时记录实验结果。按Reed-Muench法计算半数有效浓度EC₅₀，并计算样品的选择指数TI(TC₅₀/EC₅₀)。

测试结果见下表：

苦豆子提取物对呼吸道病毒抑制作用

药液	病毒种	EC<sub>50</sub>微克/毫升	TI
				苦豆子提取物	甲型流感病毒	11.6	79.8
	乙型流感病毒	25.2	36.7
					HVJ-1	58.3	15.8
	RSV	31.6	29.3
					A<sub>3</sub>	64.7	14.3
利巴韦林	甲型流感病毒	1.26	＞79.4
					乙型流感病毒	8.3	＞12.0
	HVJ-1	27.6	＞3.6
					RSV	3.3	＞30
	A<sub>3</sub>	30.5	＞3.3

根据选择指数TI(TI越大，抗病毒作用越强)的计算结果可以苦豆子提取物在体外细胞培养中对甲型流感病毒和呼吸道合胞病毒的抗病毒作用与西药利巴韦林相当，对乙型流感病毒、1型副流感病毒、腺病毒3型的抗病毒作用优于利巴韦林。由于利巴韦林是国际公认的广谱抗病毒药，本实验结果说明苦豆子提取物对流感病毒等呼吸道病毒有广谱抗病毒作用。

试验例2：本发明苦豆子提取物在小鼠口服的半数致死量测定

取昆明小鼠，雌雄各半，体重18克至22克，经预试验获得1000％死亡到0％死亡的剂量范围，在此范围内设5个剂量组，剂量比为0.88，每组10只。各组给药剂量和死亡情况见下表：

分组	样本数(只)	剂量(毫克/千克)	死亡数	死亡率(p)
					1	10	672	1	0.1
2	10	764	4	0.4
					3	10	868	5	0.5

分组	样本数(只)	剂量(毫克/千克)	死亡数	死亡率(p)
					4	10	986	6	0.6
5	10	1120	8	0.8

以改良寇氏法计算苦豆子提取物的半数致死量LD₅₀为689毫克/千克，95％可信限为607毫克/千克至788毫克/千克；结果表明该苦豆子提取物口服给药毒性较低。

试验例3：本发明苦豆子提取物对流感病毒致小鼠死亡的保护作用

测定流感病毒鼠肺适应株FM₁的毒力，取感染后15天内小鼠死亡率在90％以上的浓度作为实验浓度。

取昆明种小鼠(19～21g)，随机分为正常对照组、病毒感染对照组、阳性药对照组和不同剂量的苦豆子提取物样品给药组，每组10只。除正常对照组外，各组小鼠以乙醚吸入法麻醉，流感病毒鼠肺适应株FM₁以上述实验浓度感染小鼠。样品分别以LD₅₀的1/50、1/100、1/150、1/200、1/400等剂量给药，观察记录小鼠死亡情况，找出使50％以上动物存活的剂量(认为其疗效不低于ED₅₀)，计算样品的治疗指数TI(LD₅₀/ED₅₀)。

结果，苦豆子提取物LD₅₀的1/150剂量(4.6毫克/千克)可使52％的动物存活，认为本发明苦豆子提取物的治疗指数为不低于150。在新药筛选中，一般样品在动物实验中的治疗指数大于2即认为有继续开发的价值。实验结果表明本发明苦豆子提取物对小鼠流感病毒性肺炎有显著的治疗作用。

试验例1和试验例3的结果说明该苦豆子提取物可用于制备抗流感病毒等呼吸道病毒的药物。

试验例4：本发明苦豆子提取物在人类嗜T淋巴细胞病毒I型感染的T细胞系MT-4细胞中对爱滋病毒HIV-1 P24抗原的抑制作用

MT-4细胞悬液计数，用100CCID₅₀的HIV-1 IIIB感染细胞，在37℃，5％CO₂培养箱中吸附1.5小时。用无血清的1640培养液洗去未吸附病毒，用培养液将感染病毒的细胞配成2×10⁵个细胞/毫升，接种于96孔细胞培养板内，每孔100微升；再分别加入3倍稀释的样品溶液和5倍稀释的阳性对照药齐多夫定(AZT)溶液100微升。每个稀释度重复3个孔，同时设细胞对照组和病毒对照组。培养板置于37℃、5％CO₂饱和湿度培养箱内培养。4天后吸出上清，-20℃冻存，待测HIV-1 P24抗原滴度。细胞加MTT染色测药物对细胞的毒性。

MTT染色测定细胞毒性：每孔加5毫克/毫升MTT10微升染色，37℃、5％CO₂饱和湿度培养箱内培养4小时后，每孔加入100微升50％DMF-17％Triton X-100脱色液，37℃过夜，酶标仪上波长为570纳米处测定0D值，计算药物半数有毒浓度(CC₅₀)。

测定样品在细胞培养内抑制HIV-1 P24抗原的EC₅₀：将冻存的感染病毒的MT-4上清液融化后进行稀释，按预实验结果调整稀释比例。按照HIV-1 P24抗原检测试剂盒说明测定HIV-1P24抗原滴度，加样组与病毒对照组比较，计算样品的EC₅₀及选择指数TI(CC₅₀/EC₅₀)，结果见下表：

样品	CC<sub>50</sub>(μg/毫升)	EC<sub>50</sub>(μg/毫升)	TI
				苦豆子提取物	960.5	0.61	1574.6
齐多夫定	14.0	0.0085	1647

本实验中阳性对照药齐多夫定为目前国际上公认有效的抗爱滋病毒药物，其对HIV-1 P24抗原的抑制结果CC₅₀、EC₅₀及TI值符合文献报道，说明本实验数据可信。苦豆子提取物对HIV-1 P24抗原的选择指数TT接近齐多夫定，说明该苦豆子提取物可用于制备抗爱滋病毒药物。

综上所述，以国内目前筛选抗病毒药常用的细胞模型和动物模型对本发明苦豆子提取物进行体内外抗病毒实验研究，结果表明本发明苦豆子提取物在培养细胞中对甲型流感病毒(粤防72243株)，乙型流感病毒(济防97-13株)、1型副流感病毒(HVJ-1)、呼吸道合胞病毒(RSV)、腺病毒3型(A₃)有明显的抑制作用，且本发明苦豆子提取物对上述病毒的选择指数均大于已上市的抗流感病毒西药利巴韦林(注：选择指数越大表明药物在细胞实验中的抗病毒作用越强)；本发明苦豆子提取物口服对小鼠流感病毒性肺炎模型具有明显的保护作用，使半数动物存活的给药剂量即半数有效剂量为4.6毫克/千克；另测定本发明苦豆子提取物给小鼠口服的半数致死量为689毫克/千克；半数致死量与半数有效剂量的比值即本发明苦豆子提取物在动物实验中的抗病毒治疗指数为150，故认为该苦豆子提取物的开发前景良好(注：治疗指数越大表明在动物实验中的治疗作用越好，通常治疗指数大于2即被认为是有开发前景的药物)。

另外，选择目前最常用的筛选外源性抗爱滋病药物的细胞系人类嗜T淋巴细胞病毒I型感染的T细胞系(MT.4细胞系)对该苦豆子提取物进行抗爱滋病毒作用的研究，以爱滋病病毒(HIV-1 IIIB株)感染MT.4细胞，并加入不同浓度的苦豆子提取物溶液，检测细胞培养上清液中的HIV-1P24抗原滴度，根据苦豆子提取物对HIV-1 P24抗原的抑制作用的选择指数大小判断其对爱滋病毒的抑制作用(选择指数越大，说明抗爱滋病毒作用越强)。结果本发明苦豆子提取物在MT.4细胞培养中对爱滋病病毒(HIV-1 IIIB株)有明显的抑制作用，对爱滋病毒HIV-1 P24抗原抑制作用的选择指数为1574.6，而已上市的抗爱滋病西药齐多夫定选择指数为1647，二者在细胞实验中抗爱滋病毒作用强度相当，说明该苦豆子提取物可同时作为抗爱滋病毒药物应用。

因此，本发明苦豆子提取物可用于制备针对流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒等呼吸道病毒和爱滋病毒的广谱抗病毒药物。

Claims (7)

1.一种应用于制备广谱抗病毒药物的苦豆子提取物，其特征在于含有50％至70％的生物碱类成分和10％至20％的黄酮类成分；其中，该苦豆子提取物按下述步骤得到：

第一步，将苦豆子的种子或全草以水或乙醇粗提，其中，水粗提为：将苦豆子的种子或全草加8倍量至12倍量水，在80℃至100℃下提取两次，每次2小时至3小时，过滤，合并滤液；乙醇粗提为：将苦豆子的种子或全草加8倍量至12倍量30％至70％的乙醇，在60℃至80℃提取两次，每次2小时至3小时，过滤，合并滤液；

第二步，将上述滤液浓缩后加相当于浓缩液体积1倍量至6倍量的无水乙醇，放置沉淀12小时至72小时，滤除沉淀得到乙醇溶液；

第三步，将上述乙醇溶液浓缩后以氢氧化钠和/或氨水调节PH值为7至14，上大孔吸附树脂层析柱吸附；其中，大孔吸附树脂采用HPD400、HPD500、D-201、D-301、AB-8型号的弱极性大孔吸附树脂中的一种；

第四步，以相当于2至5个层析柱体积的去离子水冲洗上述层析柱，再以30％至90％的乙醇为洗脱剂洗脱层析柱，洗脱剂的用量相当于2至8个层析柱体积，流速为2至5个层析柱体积/小时，收集乙醇洗脱液并合并；

第五步，将上述合并后的乙醇洗脱液在80℃至100℃下浓缩成流浸膏，再在60℃至80℃下真空干燥，即得到所需的苦豆子提取物。

2.一种苦豆子提取物生产方法，其特征在于按下述步骤进行：

第一步，将苦豆子的种子或全草以水或乙醇粗提；第二步，加乙醇沉淀粗提物中的杂质；第三步，将上述乙醇溶液浓缩后以氢氧化钠和/或氨水调节PH值为7至14，上大孔吸附树脂层析柱吸附；其中，大孔吸附树脂采用HPD400、HPD500、D-201、D-301、AB-8型号的弱极性大孔吸附树脂中的一种；第四步，用乙醇从大孔吸附树脂上洗脱提取物得到洗脱液；第五步，将洗脱液浓缩回收乙醇得到苦豆子提取物。

3.根据权利要求2所述的苦豆子提取物生产方法，其特征在于在第一步中将苦豆子的种子或全草加8倍量至12倍量水，在80℃至100℃下提取两次，每次2小时至3小时，过滤，合并滤液。

4.根据权利要求2所述的苦豆子提取物生产方法，其特征在于在第一步中将苦豆子的种子或全草加8倍量至12倍量30％至70％的乙醇，在60℃至80℃提取两次，每次2小时至3小时，过滤，合并滤液。

5.根据权利要求2或3或4所述的苦豆子提取物生产方法，其特征在于在第二步中将滤液浓缩后加相当于浓缩液体积1倍量至6倍量的无水乙醇，放置沉淀12小时至72小时，滤除沉淀得到乙醇溶液；在第四步中以相当于2至5个层析柱体积的去离子水冲洗层析柱，再以30％至90％的乙醇为洗脱剂洗脱层析柱，洗脱剂的用量相当于2至8个层析柱体积，流速为2至5个层析柱体积/小时，收集乙醇洗脱液并合并；在第五步中将乙醇洗脱液在80℃至100℃下浓缩成流浸膏，并回收乙醇，在60℃至80℃下真空干燥，即得到所需的苦豆子提取物。

6.弱极性大孔吸附树脂在权利要求2或3或4苦豆子提取物生产方法中的应用，其特征在于所用弱极性大孔吸附树脂为D-201、D-301、HPD400、HPD500、AB-8型号的弱极性大孔吸附树脂中的一种。

7.一种根据权利要求1所述的苦豆子提取物应用于制备针对流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒呼吸道病毒或/和爱滋病毒的广谱抗病毒药物。