CN106109862A - 一种治疗病毒性感冒的重楼提取物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种治疗病毒性感冒的重楼提取物,提取物制备方法包括:(a)将干燥的重楼根茎用55%乙醇溶液热回流提取,合并提取液,浓缩至无醇味得到乙醇提取浓缩液;(b)将步骤(a)所得乙醇提取浓缩液用水稀释,依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取,减压浓缩,分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物;(c)正丁醇萃取物用水溶解,过滤,用大孔树脂富集活性成分,先用10%乙醇冲洗8个柱体积除去大极性成分,再用70%乙醇洗脱12个柱体积,收集70%洗脱液,减压浓缩即得。该提取物可以应用于病毒性感冒,开发成治疗和预防病毒性感冒的药物。

Description

一种治疗病毒性感冒的重楼提取物
技术领域
[0001] 本发明涉及中药提取物领域,具体涉及一种重楼提取物及含有该提取物的药物制 剂,该提取物可以应用于治疗病毒性感冒。
背景技术
[0002] 重楼属植物是一类极具药用价值的植物,全世界共有24种,我国拥有19种,其中西 南各省区种类和资源极为丰富。国内外学者很重视对重楼的研究,其具有较强的生理活性 及独特的药用价值。重楼在李时珍所著的《本草纲目》中以蚤休之名收载,为下品;并以重台 根等异名被历代本草古籍记载。《中华人民共和国药典》收载该药为云南重楼Paris polyphy 1 la Smith var · yunnanen s i s (Franch · ) Hand ·-Maz z ·或七口i 枝花 P.polyphyllaSimth var · chinensis(F. )Hara的干燥根莖。又名蚤休、七Pi 枝花、草河车。 主产于长江流域及南方各省。秋季采挖,除去须根,洗净,晒干。切片生用。
[0003] 重楼具有清热解毒、消肿止痛、凉肝定惊之功效,用于臃肿、咽喉肿痛、毒蛇咬伤、 跌打伤痛、凉风抽搐等症。现已从该属植物中分离鉴定了 50余种化合物,主要有C27留体皂 苷、C21孕留烷苷、脂肪酸酯、留醇及其苷、黄酮苷、B 2蜕皮激素及多糖。其中留体皂苷44种, 占总化合物的80 %以上,留体皂苷元为螺留烷醇类、异螺留烷醇类、味留烷醇类以及变形螺 甾类,均有很强的生理和药理活性。现代药理研究重楼有止血、祛痰和抑菌、镇静镇痛、抗早 孕杀灭精子、抗细胞毒等作用,临床用于治疗功能性子宫出血、神经性皮炎、外科炎症以及 肿瘤等,都有显著的疗效。在我国,重楼是著名的中成药云南白药、季德胜蛇药片、宫血宁胶 囊等的主要组成药物。
发明内容
[0004] 本发明的目的在于提供一种重楼提取物,其制备方法和液相分析方法,含有该提 取物的药物制剂及利用该提取物制备治疗病毒性感冒的药物的用途。
[0005] 本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的:
[0006] -种重楼提取物,该提取物由以下方法制备:
[0007] (a)将干燥的重楼根茎用55%乙醇溶液热回流提取,合并提取液,浓缩至无醇味得 到乙醇提取浓缩液;(b)将步骤(a)所得乙醇提取浓缩液用水稀释,依次用石油醚、乙酸乙酯 和水饱和的正丁醇萃取,减压浓缩,分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取 物;(c)正丁醇萃取物用水溶解,过滤,用大孔树脂富集活性成分,先用10%乙醇冲洗8个柱 体积除去大极性成分,再用70%乙醇洗脱12个柱体积,收集70%洗脱液,减压浓缩即得。
[0008] 进一步地,步骤(c)中所述大孔树脂为AB-8型大孔树脂。
[0009] 为了能够通过建立HPLC指纹图谱的方法控制不同批次制备的提取物的批间差异, 所述提取物的液相分析方法为:
[0010] 色谱柱:Agilent Zorbax Extent_C18柱(4.6mmX250mm,5ym);
[0011 ]流动相:A为乙腈,B为0.5 %磷酸溶液;
[0012]梯度洗脱程序:0.01 ~5min,A 10% - 15% ;5~10min,A 15%-48% ;10~25min, A 48%-78%;25~30min,A 78% -10%;
[0013]流动相流速:1.0mL.min-S
[0014] 检测波长:280nm;
[0015] 柱温:30 °C;
[0016] 进样量:10yL。
[0017] 药物制剂,含有治疗有效量的所述提取物和药学上可接受的载体。
[0018] 所述的提取物在制备治疗病毒性感冒的药物中的应用。
[0019] 所述的药物制剂在制备治疗病毒性感冒的药物中的应用。
[0020] 本发明提取物用作药物时,可以直接使用,或者以药物制剂的形式使用。
[0021] 所述药物制剂含有治疗有效量的本发明重楼提取物,其余为药物学上可接受的、 对人和动物无毒和惰性的可药用载体和/或赋形剂。
[0022]所述的可药用载体或赋形剂是一种或多种选自固体、半固体和液体稀释剂、填料 以及药物制品辅剂。将本发明的药物制剂以单位体重服用量的形式使用。本发明提取物可 通过口服或注射的形式施用于需要治疗的患者。用于口服时,可将其制成片剂、缓释片、控 释片、胶囊、滴丸、微丸、混悬剂、乳剂、散剂或颗粒剂、口服液等;用于注射时,可制成灭菌的 水性或油性溶液、无菌粉针、脂质体或乳剂等。
[0023]本发明的优点:本发明通过对干燥的重楼根茎进行提取、除杂、富集处理,能得到 具有治疗病毒性感冒的提取物;本发明提供的液相分析方法可以用于建立该提取物的指纹 图谱,用于控制不同批次制备的提取物的批间差异。
附图说明
[0024]图1为重楼提取物HPLC液相图谱。
具体实施方式
[0025]下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容,但并不以此限定本发明保护范 围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明,本领域的普通技术人员应当理解,可以对 本发明的技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
[0026]实施例1:提取物制备
[0027]药材来源:重楼购自安徽亳州中药材市场,产地云南。
[0028]主要试剂:食品级乙醇购自上海凌峰化学试剂有限公司;医药级AB-8大孔树脂购 自天津波鸿树脂有限公司;乙腈为HPLC级,购于TEDIA; 85 %磷酸为HPLC级,购于TEDIA;色谱 用纯净水为哇哈哈纯净水。
[0029]制备方法:将8kg干燥的重楼根茎用55 %乙醇溶液热回流提取(25L X 3次),合并提 取液,浓缩至无醇味得到乙醇提取浓缩液(2L);将所得乙醇提取浓缩液用水稀释至3L,依次 用石油醚(3LX3次)、乙酸乙酯(3LX3次)和水饱和的正丁醇(3LX3次)萃取,减压浓缩,分 别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物232g;(c)正丁醇萃取物用1.5L水溶 解,医用脱脂棉过滤,用AB-8大孔树脂(2kg,柱体积1.5L)富集活性成分,先用10%乙醇冲洗 8个柱体积(12L)除去大极性成分,再用70 %乙醇洗脱12个柱体积(18L),收集70 %洗脱液, 减压浓缩,即得重楼提取物105g。
[0030]实施例2:液相色谱分析
[0031]供试品溶液配制:取实施例1方法制得的提取物5mg至50mL棕色容量瓶中,加30mL 10%乙腈水溶液超声溶解,冷却至室温后,继续加10 %乙腈水溶液定容。
[0032]分析方法:
[0033] 高效液相色谱仪:Agilent 1260,二元栗;
[0034] 色谱柱:Agilent Zorbax Extent_C18柱(4.6mmX250mm,5ym);
[0035] 流动相:A为乙腈,B为0.5 %磷酸溶液;
[0036] 梯度洗脱程序:0.01 ~5min,A 10% - 15% ;5~10min,A 15%-48% ;10~25min, A 48%-78%;25~30min,A 78% -10%;
[0037] 流动相流速:1 · OmL · min-1;
[0038] 检测波长:280nm;
[0039] 柱温:30°C;
[0040] 进样量:10yL。
[0041] 用制备的10批次的重楼提取物进行分析,进行色谱峰匹配,结果1~12号峰在10批 样品色谱图中均出现。因此标定12个峰为共有色谱峰,据此建立该提取物的HPLC质量控制 图谱,结果见图1。该10批次的重楼提取物药理活性相似。
[0042]实施例3:提取物药理试验 [0043] 一、实验材料
[0044] 1、细胞株及病毒:狗肾传代细胞(madin darby canine kidney,MDCK)、甲型流感 病毒(济防90-15)、乙型流感病毒(济防97-13)、流感病毒鼠肺适应株PR8均购自中国预防医 科院病毒研究所,病毒经鸡胚传代后_70°C低温冰箱保存备用。
[0045] 2、样品与试剂:重楼提取物制备方法见实施例1。阳性对照药利巴韦林片,O.lg/ 片,国药准字H20033538,江西汇仁药业有限公司生产,批号:1411025。01^11液体培养基,批 号:701998,GIBC0公司;细胞培养液,含10 %胎牛血清的DMEM液体培养基。维持液,除不含胎 牛血清外,其他均同细胞培养液。洗液为含有2 %双抗硫酸链霉素和硫酸卡那霉素的MEM培 养液。
[0046] 3、动物:清洁级昆明种小鼠120只,体质量16-20g,雌雄各半,由新疆实验动物研究 中心提供,动物合格证号:SCXK (新)2013-0002。
[0047] 4、仪器:BHC-1300IIA/B3型生物安全柜,苏净集团安泰公司;HH. CP-01型C02培养 箱,上海福玛试验设备有限公司;XDS-1B倒置显微镜,重庆光学仪器厂;MDF-382E型超低温 冰箱,日本三洋电器;UPH-II-5型纯水仪,成都超纯科技有限公司。
[0048] 二、方法与结果
[0049] 1、体外抗病毒实验
[0050] (1)测定对MDCK细胞的毒性
[0051]取重楼提取物用维持液配成5mg/mL的原液,利巴韦林配成4mg/mL的原液再用维持 液稀释成1: 2、1:4、1: 8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256共8个浓度,加到接种MDCK细胞并已 长成单层的96孔培养板中,100μL孔,每稀释度4个复孔,同时设细胞对照。将培养板置37 °C、5%⑶ 2培养箱中培养,每日观察细胞生长情况,观察4d,确定细胞不出现明显退变的最 低稀释倍数为最大无毒浓度TCo,并按Reed-Muench法计算50 %毒性浓度TC5Q。见表1。
[0052]表1重楼提取物细胞毒性测试结果
Figure CN106109862AD00061
[0055] (2)样品对病毒致细胞病变(CPE)的影响
[0056]取接种MDCK细胞并已长成单层的培养板,吸弃培养液,甲型流感病毒和乙型流感 病毒分别接种100倍半数组织感染浓度(TCID5Q)的病毒液100yL,置35 °C、5 %C02培养箱中吸 附lh后,吸弃病毒液,用洗液洗细胞表面2次,设14个组,分别为细胞对照组、病毒对照组、利 巴韦林取62.5yg/mL及以下5个2倍稀释度(31.3、15.6、7.8、3.9、2. Oyg/mL)共6个浓度给药 组、重楼提取物TC〇(312.5yg/mL)及以下 5个2 倍稀释度(156.3、78.1、39.1、19.5、9.8yg/mL) 共6个浓度的给药组,4孔/组。利巴韦林和重楼提取物各6个给药组分别加入不同稀释度的 药液,细胞对照组和病毒对照组加维持液,1〇〇μL7孔。培养板置35 °C、5 % C02培养箱中培养, 每日倒置显微镜下观察细胞病变情况,当病毒对照组细胞病变达4级时记录实验结果,按 Reed-Muench法计算半数抑制浓度IC5Q,选择指数SI = TC5〇/IC5〇,实验重复3次。结果,重楼提 取物样品对甲型流感病毒的IC5Q平均为74.6yg/mL,SI为16.8,对乙型流感病毒的IC 5Q平均 为98.6以8/11^,51为12.7。见表2。
[0057]表2重楼提取物对病毒致细胞病变的影响
Figure CN106109862AD00062
[0059] 2、体内抗病毒实验
[0060] (1)对小鼠流感病毒性肺炎模型的保护作用
[0061 ]取小鼠60只,体质量16-18g,按体质量、性别随机分为模型组、利巴韦林(60mg/kg) 组和重楼提取物100、200、400mg/kg 3个剂量(根据预试验确定)的给药组,重楼提取物组和 利巴韦林组按上述剂量灌胃给药,模型组灌胃等量的蒸馏水,每天2次,连续6d,对照组灌胃 等量的蒸馏水。于第3天给药后,各组小鼠用乙醚轻度麻醉,以2LD 5Q浓度的流感病毒鼠肺适 应株PR8滴鼻感染,0.05mL/只。记录感染后各组小鼠的死亡情况,计算死亡率、死亡保护率 及平均存活天数、生命延长率。结果,重楼提取物200、400mg/kg剂量组对流感病毒性肺炎小 鼠有明显的保护作用(P〈〇. 05)。见表3,与模型组比较,ΛΡ〈0.05,Mp〈0.01。
[0062]表3对小鼠流感病毒性肺炎模型的保护作用(ΐ 士 S,n = 12)
Figure CN106109862AD00071
[0064] (2)对流感病毒性肺炎小鼠肺指数的抑制作用
[0065] 取小鼠60只,体质量18_20g,按体质量、性别随机分为对照组、模型组、利巴韦林 (60mg/kg)组和重楼提取物100、200、400mg/kg 3个剂量的给药组,重楼提取物组和利巴韦 林组按上述剂量灌胃给药,模型组灌胃等量的蒸馏水,每天2次,连续6d,对照组灌胃等量的 蒸馏水。于第3天给药后,除对照组外,各组小鼠用乙醚轻度麻醉,以5LD 5Q浓度的PR8滴鼻感 染,每只0.05mL。第7天称取小鼠体质量后解剖,摘取全肺称重,计算肺指数值及抑制率。结 果显示,重楼提取物400mg/kg剂量组对流感病毒性肺炎小鼠肺指数有明显的抑制作用。见 表4,与对照组比较,P〈0.01;与模型组比较, ΛΡ〈0.05,Mp〈0.01。
[0066] 表4对流感病毒性肺炎小鼠肺指数的抑制作用(|土 S,n = 10)
Figure CN106109862AD00072
[0069] 实施例4:片剂的制备
[0070] 按实施例1方法制得提取物,按其与赋形剂重量比为1:10的比例加入赋形剂,制粒 压片。
[0071 ]实施例5: 口服液的制备
[0072]按实施例1方法先制得提取物,按常规口服液制法制成口服液。
[0073]实施例6:胶囊剂或颗粒剂的制备
[0074]按实施例1方法先制得提取物,按其与赋形剂重量比为1: 9的比例加入赋形剂,制 成胶囊或颗粒剂。
[0075]实施例7 :注射液的制备
[0076]按实施例1方法制得提取物,加注射用水,精滤,灌封灭菌制成注射液。
[0077]实施例8:无菌粉针的制备
[0078]按实施例1方法先制得提取物,溶于无菌注射用水中,搅拌使溶,用无菌抽滤漏斗 过滤,再无菌精滤,分装于安瓿,低温冷冻干燥后无菌熔封得粉针剂。

Claims (6)

1. 一种重楼提取物,其特征在于所述提取物由以下方法制备: (a)将干燥的重楼根茎用55%乙醇溶液热回流提取,合并提取液,浓缩至无醇味得到乙 醇提取浓缩液;(b)将步骤(a)所得乙醇提取浓缩液用水稀释,依次用石油醚、乙酸乙酯和水 饱和的正丁醇萃取,减压浓缩,分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物; (c)正丁醇萃取物用水溶解,过滤,用大孔树脂富集活性成分,先用10%乙醇冲洗8个柱体积 除去大极性成分,再用70%乙醇洗脱12个柱体积,收集70%洗脱液,减压浓缩即得。
2. 根据权利要求1所述的提取物,其特征在于:步骤(c)中所述大孔树脂为AB-8型大孔 树脂。
3. 根据权利要求1所述的提取物,其特征在于:所述提取物的液相分析方法为: 色谱柱:Agilent Zorbax Extent_C18柱(4.6mmX250mm,5ym); 流动相:A为乙腈,B为0.5 %磷酸溶液; 梯度洗脱程序:〇.〇1 ~5min,A 10% - 15%;5 ~10min,A 15%-48%;10 ~25min,A 48%-78%;25~30min,A 78% - 10%; 流动相流速:1. OmL · mirT1; 检测波长:280nm; 柱温:30°C; 进样量:10此。
4. 药物制剂,其特征在于:含有治疗有效量的权利要求1所述的提取物和药学上可接受 的载体。
5. 权利要求1所述的提取物在制备治疗病毒性感冒的药物中的应用。
6. 权利要求4所述的药物制剂在制备治疗病毒性感冒的药物中的应用。
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