CN103768084A

CN103768084A - 柴胡皂苷a在制备预防和治疗人及动物流感药物的用途

Info

Publication number: CN103768084A
Application number: CN201410035562.XA
Authority: CN
Inventors: 陈建新; 凌芳芳; 赵雅琴; 曾振灵; 廖明; 蒋红霞; 杜金艳
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2014-01-24
Filing date: 2014-01-24
Publication date: 2014-05-07
Also published as: WO2015109900A1

Abstract

本发明公开了柴胡皂苷a在制备预防和治疗人及动物流感药物的用途。药理试验表明，从中药柴胡中分离的柴胡皂苷a可以明显抑制流感及禽流感病毒在体内外的增殖，保护感染流感及禽流感病毒的小鼠，可用于制备防治人及动物流感的药物。本发明柴胡皂苷a用于制备预防和治疗人及动物流感药物，药效成分及作用机制明确，质量可控，安全无毒、疗效稳定；且有效成分柴胡皂苷a主要通过调节宿主细胞的炎症信号通路发挥作用，因此不易导致流感病毒株产生耐药性。

Description

柴胡皂苷a在制备预防和治疗人及动物流感药物的用途

技术领域

本发明属于药物技术领域，具体涉及柴胡皂苷a在制备预防和治疗人及动物流感药物的用途。

背景技术

流行性感冒（流感）是由流感病毒（Influenza Virus，IV）引起的一种具有高度传染性的急性呼吸道疾病，具有传播快、可跨种传播等特点，可导致人和动物高发病率和死亡率，对人类和动物的生命与健康构成了严重的威胁。二十世纪人类经历了四次全球性的大流行，即1918年的西班牙流感（H1N1）大流行，1957年的亚洲流感（H2N2）大流行，1968年的香港流感（H3N2）大流行及1977年的俄国流感(H1N1)大流行。其中以1918年的西班牙流感造成的伤亡最为严重，死亡人数高达4000万人（Watanabe T,Kawaoka Y.Pathogenesis ofthe1918pandemic influenza virus[J].PLoS Pathog,2011,7(1):e1001218.）。而进入二十一世纪的十余年来，新型流感的爆发明显加快，危害巨大。2003年底源于东南亚的高致病性H5N1亚型禽流感病毒快速蔓延至世界3个洲15个国家和地区，使成千上万只家禽和野禽死亡，并导致全球近400人感染死亡，病死率高达60%。2009年3月，新甲型H1N1流感疫情由北美向全球迅速扩散，形成了全球性流感大流行，该病毒具备猪流感、禽流感及人流感病毒的特征，并由猪传染给人，获得在人与人之间传播的能力（Poulakou G,Perez M,Rello J.Severeacute respiratory infections in the postpandemic era of H1N1[J].Curr.Opin Crit Care,2012,18(5):441-450.），该疫情导致全球约18,000余人感染死亡。而2013年4月起在我国华东地区爆发的高致病性H7N9亚型禽流感病毒由禽传给人，先后导致44人感染死亡。除了这些新爆发的流感疫情，全世界每年平均有25-50万人死于季节性流感引发的疾病。由此可见，流感作为一种病毒性传染病严重威胁着全球公众的健康，同时也给社会和国家带来了巨大的经济损失和沉重的负担。因此，流感的危害巨大，其防治工作任重道远。

到目前为止，接种流感疫苗是预防流感的基本手段，它可以预防同型流感病毒的感染，降低死亡率。然而，由于流感病毒的血清型众多、抗原极易发生漂移产生新的流行株，再加之部分人群接种疫苗之后免疫应答能力差，致使临床上接种流感疫苗后达不到预期的防治效果。同时，新的疫苗的研制及生产周期较长，一般至少需要4-6个月时间，往往滞后于病毒变异的速度，难以为新爆发的疫情及时提供疫苗（Bonhoeffer J,Bentsi-Enchill A,Chen R T,et al.Guidelines for collection,analysis and presentation of vaccine safety data insurveillance systems[J].Vaccine,2009,27(16):2289-2297.）。因此，流感的防治不能完全依靠疫苗预防。

对可能大规模爆发的新型流感疫情来讲，药物治疗是最好的控制流感病毒传播的手段。当前由美国食品药品署（FDA）批准的四种抗流感药物可分为两类。一类是以流感病毒基质蛋白（M2）为靶标的抗流感病毒药物，主要有金刚烷胺和金刚乙胺。金刚烷胺上市于1966年，是第一种人工合成的用于防治流感的药物。该药虽然曾广泛用于预防和治疗人及动物流感，但其对神经系统和消化系统均具有副作用。由于该药使用至今已长达三十年，已产生了严重的耐药性（Cheung C L,Rayner J M,Smith G J,et al.Distribution of amantadine-resistantH5N1avian influenza variants in Asia[J].J Infect Dis,2006,193(12):1626-1629.）。另一类是以流感病毒神经氨酸酶（NA）为靶标的抗流感病毒药物，主要有奥司米韦（商品名：“达菲”）、扎那米韦及帕拉米韦。该类药物投放市场初期的药效好，用药量少。但近年来越来越多的报道显示，该类药物也具有一定的副作用，并且已产生耐药性。因此，研制开发新型高效抗流感病毒药物迫在眉睫，刻不容缓。

中医中药是我国特有的医学资源，数千年来为保障中华民族的繁衍和人民的健康发挥了重要作用。但传统中医使用的药物往往是多味中药组成的制剂，虽然可能具有“君、臣、佐、使”的协同作用，但由于药效成分不明确、作用机制不清楚、药物质量难以控制，从而导致其临床上应用疗效不确切、不稳定。因此，从中药中寻找发现具有确切抗流感病毒作用的单体化学物，并以此为基础开发新药，成为近年来抗病毒药物研发的重要途径。近年来，我国医学工作者从传统中药筛选出了大量具有抗流感病毒效用的天然药物，这些药物包括桑叶、柴胡、野菊花、金银花、麻黄、板蓝根、鱼腥草、连翘、牛蒡子、黄芩、贯众、莪术等。但从中药中寻找到具有市场应用前景的抗流感病毒药物目前还很少。

柴胡是最常用的清热解表类中药，是伞形科（Umbelliferae）多年生草本植物，根入药。其味苦、辛，性微寒，归肝胆经，具有解表退热，疏肝解郁，升举清气之功效。药理研究证明其具有解热、抗炎、保肝、镇痛之功效，临床用于感冒，治少阳症，肝气郁结；气虚下陷证；胃及十二指肠溃疡等。研究表明，柴胡含有多种生物活性成分，包括挥发油（含酮类、醇类、烯烃和酸等化合物）、黄酮类及柴胡皂苷类化合物。其中，由柴胡水蒸气蒸馏液制备的“柴胡注射液”临床上广泛用于治疗人及家畜的各种发热性疾病，其活性成分是柴胡挥发油，但未见柴胡挥发油及注射液针对流感病例的治疗研究报告。冯煦等曾报道柴胡茎叶总黄酮对感染乙型流感病毒小鼠有治疗效果，但该文未明确总黄酮的成分。杨永安等曾申报“一种抗流感病毒的柴胡黄酮组合物及其制备方法”发明专利并获授权（ZL02137936.X），但其药效成分为柴胡总黄酮及斛皮苷的复合物，其具体药效成分及作用机制尚不明确。

柴胡中药理活性最为显著、研究报道最多的是柴胡皂苷类化合物。柴胡皂苷（Saikosaponins，SSs）是从柴胡干燥根中提到的一类成分，同时也是柴胡主要的化学指标和生物活性成分。大量研究表明，SSs具有解热、抗炎、抗病毒、抗菌、抗内毒素、免疫调节、镇静、抗癫痫、抗肿瘤、保肝、护肾等药理作用谢东浩,蔡宝昌,安益强,等.柴胡皂苷类化学成分及药理作用研究进展[J].南京中医药大学学报,2007(1):63-65.）。迄今为止，已经从不同属的柴胡中分离出近百种皂苷成分，包括SSa、SSb、SSc、SSd等，而其主要活性成分则为SSa和SSd（刘沁舡,谭利,白焱晶,等.柴胡属植物皂苷近10年研究概况[J].中国中药杂志,2002(1):11-15.）。目前，国内外对于柴胡皂苷的药理学研究大多集中免疫调节、抗炎、解热、护肝、保肾等方面，特别是柴胡皂苷的抗肿瘤活性研究较多。Motoo Y等[Motoo Y,Sawabu N.Antitumor effects of saikosaponins,baicalin and baicalein on human hepatoma cell lines[J].Cancer Lett,1994,86(1):91.]研究了柴胡皂苷不同组分对肝、胰腺肿瘤细胞的作用，发现肝肿瘤细胞50%抑制时，柴胡皂苷d浓度为20mg/mL,柴胡皂苷a的浓度为50mg/mL。柴胡皂苷a50mg/mL可抑制这两种肿瘤细胞的生长和DNA的合成。Tsai YJ等[Tsai YJ,Chen IL,Horng LY,et al.Induction of differention in rat C6glioma cellswith Saikosaponins[J].Phytother Res,2002,16(2):117.]用柴胡皂苷a、b1、b2、c、d诱导小鼠C6胶质瘤细胞分化。柴胡皂苷a、d可抑制细胞增殖，改变细胞形态，而且柴胡皂苷a可显著抑制谷氨酰胺合成酶和环核苷酸磷酸水解酶的活性。

有关柴胡皂苷的抗流感病毒作用及其机制研究未见报道，也未见相关的专利公开。

发明内容

为解决现有技术的缺点和不足之处，本发明的目的在于提供柴胡皂苷a在制备预防和治疗人及动物流感药物的用途。

为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：

一种结构如下的柴胡皂苷a在制备预防和治疗人及动物流感的药物中的用途：

优选的，所述用途为以柴胡皂苷a作为有效成分配以辅助剂制成注射液、片剂、胶囊剂或颗粒剂。

优选的，所述流感为H1N1亚型、H9N2亚型、H5N1亚型、H3N2甲型或H7N9甲型流感病毒引起的流感。

本发明柴胡皂苷a的分子式为：C₄₂H₆₈O₁₃，分子量为781，化学名为3β,16β,23-三羟基-13,28环氧基齐墩果烷11-烯3-O-β-D-葡萄糖-(1→3)-β-D-岩藻糖苷。

本发明柴胡皂苷a可以通过以下方法制备得到：（1）取柴胡根的干燥粉，用70%～95%的乙醇浸提3次，合并提取液，弃药渣，回收乙醇，得到流浸膏；（2）将流浸膏用10～20倍水分散后，用石油醚萃取，去除脂溶性成分，剩余水层上预先处理过的大孔型弱碱性阴离子交换树脂，然后用1.5～3倍树脂床体积的3%的Na₂CO₃水溶液冲洗，再用5～10倍树脂床体积的纯水冲洗，弃去水洗液，最后用5～10倍树脂床体积的70%的乙醇洗脱，收集洗脱液并浓缩，得到总柴胡皂苷；（3）将总柴胡皂苷经硅胶柱层析分离，得到柴胡皂苷a。

本发明的原理：从柴胡中寻找一种具有抗流感病毒作用的有效成分柴胡皂苷a，并探明其药理作用机制。实验中得到从中药柴胡中分离获得的活性成分柴胡皂苷a（Saikosaponin a）在细胞和动物体内有显著的抑制流感病毒增殖作用，对感染流感病毒小鼠具有显著保护作用，可用于制备防治人和动物流感的药物。

与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：

本发明柴胡皂苷a用于制备预防和治疗人及动物流感药物，药效成分及作用机制明确，质量可控，安全无毒、疗效稳定；且有效成分柴胡皂苷a主要通过调节宿主细胞的炎症信号通路发挥作用，因此不易导致流感病毒株产生耐药性。

附图说明

图1为实施例1中各试验组对细胞内H1N1亚型流感病毒增殖的抑制作用；

图2为实施例2中各试验组对细胞内H9N2亚型流感病毒增殖的抑制作用；

图3为实施例3中各试验组对细胞内H5N1亚型流感病毒增殖的抑制作用；

图4为实施例4中各试验组小鼠实验期间体重变化；

图5为实施例5中病毒感染对照组小鼠感染5天后肺组织切片放大5倍显微照片；

图6为实施例5中病毒感染对照组小鼠感染5天后肺组织切片放大20倍显微照片；

图7为实施例5中未感染对照组小鼠试验5天后肺组织切片放大5倍显微照片；

图8是实施例5中25mg/kg/d柴胡皂苷a混悬液口服组小鼠感染5天后肺组织切片放大5倍显微照片；

图9是实施例5中25mg/kg/d柴胡皂苷a混悬液口服组小鼠感染5天后肺组织切片放大10倍显微照片；

图10是实施例5中25mg/kg/d柴胡皂苷a混悬液口服组小鼠感染5天后肺组织切片放大20倍显微照片；

图11是实施例5中50mg/kg/d柴胡皂苷a混悬液口服组小鼠感染5天后肺组织切片放大5倍显微照片；

图12是实施例5中50mg/kg/d柴胡皂苷a混悬液口服组小鼠感染5天后肺组织切片放大10倍显微照片；

图13是实施例5中50mg/kg/d柴胡皂苷a混悬液口服组小鼠感染5天后肺组织切片放大20倍显微照片；

图14是实施例6中各试验组在A549细胞中对流感病毒核蛋白(NP)出核的抑制作用；

图15是实施例7中各试验组对流感病毒感染诱导A549细胞产生炎症因子TNF-α的抑制作用；

图16是实施例7中各试验组对流感病毒感染诱导A549细胞产生炎症因子IL-6的抑制作用；

图17是实施例7中各试验组对流感病毒感染诱导A549细胞产生炎症因子IL-8的抑制作用。

具体实施方式

下面结合实施例与附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

以下实施例中所用到的柴胡皂苷a通过以下方法制备得到：（1）取北柴胡根的干燥粉5kg（40～60目），依次用30L、20L和15L体积浓度为90%的乙醇水溶液浸提，合并提取液，弃药渣，减压蒸馏回收乙醇，得到流浸膏450g；（2）将流浸膏用6L水分散后，用10L石油醚分2次萃取，去除脂溶性成分，剩余水层上预先处理过的大孔型弱碱性阴离子交换树脂D382，树脂重量为3kg，然后用6L质量浓度为3%的Na₂CO₃水溶液冲洗，再用15L纯水冲洗，弃去水洗液，最后用15L体积浓度为70%的乙醇洗脱，收集洗脱液并减压蒸馏浓缩，得到总柴胡皂苷；（3）将总柴胡皂苷经硅胶（100～200目）柱层析，依次用氯仿-甲醇-水和乙酸乙酯-乙醇-水洗脱，得到柴胡皂苷a。

实施例1柴胡皂苷a在A549细胞中对H1N1亚型流感病毒增殖的抑制作用

待A549细胞生长至单层后，加入已用基础培养基稀释好的H1N1毒株病毒液（含100TCID50），100μL/孔，37℃孵育2h，弃去病毒上清，磷酸盐缓冲液（PBS液）清洗一遍，分别加入3.8μM及7.6μM的柴胡皂苷a，100μL/孔，分别记为SSa：3.8μM组和SSa：7.6μM组。实验同时设正常对照组（不加受试药物，不加流感病毒液）与流感病毒对照组（不加受试药物），每个受试浓度设三个平行。细胞继续培养，分别至8h、24h、48h、72h时，终止培养，观察其病变状况后，于-80℃和4℃反复冻融细胞板三次，使得细胞充分裂解，致使细胞内的病毒全部释放进入细胞上清，然后收集各孔上清液。

根据终点稀释法（Geiler J,Michaelis M,Naczk P,et al.N-acetyl-L-cysteine(NAC)inhibits virus replication and expression of pro-inflammatory molecules inA549cells infected with highly pathogenic H5N1influenza A virus[J].BiochemPharmacol,2010,79(3):413-420.），将所收集的细胞上清用基础培养基10倍倍比稀释，加入生长至单层的MDCK细胞，继续置于培养箱内培养。培养72h后，观察其CPE程度。细胞出现病变程度按以下6级标准记录：“-”为细胞生长正常，无病变出现；“±”为细胞病变少于整个单层细胞的10%；“+”为细胞病变约占整个单层细胞的25%；“++”为细胞病变约占整个单层细胞的50%；“+++”为细胞病变约占整个单层细胞的75%；“++++”为细胞病变约占整个单层细胞的75%以上。用Reed-Muench法计算出各个时间段内各试验组细胞培养液中的病毒滴度（TCID50）值。实验结果如图1所示，Vehicle代表病毒感染对照组。图中，与病毒感染对照组比较，“*”表示差异显著（P<0.05）。从图1中可看到，本发明的药物柴胡皂苷a对细胞内H1N1亚型流感病毒增殖有显著的抑制作用。

实施例2柴胡皂苷a在A549细胞中对H9N2亚型流感病毒增殖的抑制作用

感染用的病毒为H9N2亚型流感病毒株，其它实验步骤与实施例1相同。实验结果如图2所示，从图2中可看到，本发明的药物柴胡皂苷a对细胞内H9N2亚型流感病毒增殖有显著的抑制作用。

实施例3柴胡皂苷a在A549细胞中对H5N1亚型流感病毒增殖的抑制作用

感染用的病毒为H5N1亚型流感病毒株，感染时间为1h，其它实验步骤与实施例1相同。实验结果如图3所示。从图3中可看到，本发明的药物柴胡皂苷a对细胞内H5N1亚型流感病毒增殖有显著的抑制作用。

实施例4柴胡皂苷a对感染H1N1亚型流感病毒小鼠的保护作用

称取50mg柴胡皂苷a，加入1mL二甲基亚砜（DMSO）溶解，再加入10mL橄榄油混匀，制成注射油剂。18-20g BALB/c雌性小鼠40只分成4组，每组10只。分别为溶剂对照组（不含药物，含相同剂量的DMSO及橄榄油混悬液注射液），病毒感染对照组、25mg/d柴胡皂苷a皮下注射组及50mg/d柴胡皂苷a皮下注射组。除溶剂对照组外，其他三组滴鼻感染1.5倍半数致死剂量（MLD50）的H1N1亚型流感病毒。每天给药1次，感染前4小时给药，连续给药7天，连续观察21天并称体重。柴胡皂苷a对感染H1N1亚型流感病毒小鼠的保护率见表1，各组小鼠实验期间体重变化如图4所示。从表1和图4中可看到，本发明药物柴胡皂苷a对感染H1N1小鼠有显著的生命保护作用及抑制感染导致的小鼠体重下降。

表1 柴胡皂苷a对感染H1N1流感病毒小鼠的保护作用

实施例5柴胡皂苷a对感染H1N1亚型流感病毒小鼠肺组织炎症的抑制作用

取50mg柴胡皂苷a，加入1mL DMSO溶解，再加入质量浓度为0.2%羧甲基纤维素钠（CMCNa）高速漩涡制成混悬液。18-20g BALB/c雌性小鼠20只分成4组，每组5只。分别为溶剂对照组（不含药物，含相同剂量的DMSO制成的CMCNa混悬口服液，即图4中的正常组），病毒感染对照组、25mg/kg/d柴胡皂苷a混悬液口服组及50mg/kg/d柴胡皂苷a混悬液口服组。除溶剂对照组外，其他三组滴鼻感染1.5倍半数致死剂量（MLD50）的H1N1亚型流感病毒。感染前4小时给药，每天给药2次，连续给药6天，至第6天处死小鼠，解剖、取肺组织，称体重、肺重及肺组织固定切片，计算肺指数，显微镜观察肺组织切片。肺指数及肺指数抑制率结果见表2，肺组织切片显微观察见图5-13。从表2和图5-13可看到柴胡皂苷a对流感病毒感染诱导的肺部炎症具有显著的抑制作用。

表2 柴胡皂苷a对感染H1N1流感病毒小鼠肺炎的抑制作用

表2中肺指数(%)=小鼠肺重/小鼠体重×100%；“^*”表示与病毒组比较差异显著，P＜0.05；“^**”表示与病毒组比较差异极显著，P＜0.01。

实施例6柴胡皂苷a在A549细胞中对流感病毒核蛋白(NP)出核的抑制作用

取1×10⁴个A549细胞稀释悬液加至激光共聚焦培养皿（玻底直径为15mm）内，37℃、5%(体积分数)CO₂培养箱中培养过夜。待细胞长满至50%左右时，弃旧液，用PBS清洗两遍，然后加入H5N1亚型流感病毒稀释液（病毒感染复数MOI=0.1），100μL，吸附1h。终止培养后，吸弃上清液，用PBS清洗两遍，再加入溶解于PBS的柴胡皂苷a溶液，于37℃、5%(体积分数)CO₂培养箱中继续培养。

实验设病毒对照组、溶剂对照组（含0.4%DMSO）、3.8μM柴胡皂苷a组及7.6μM柴胡皂苷a组。除溶剂对照组外，其余三组均感染病毒。

于感染后8h终止培养。PBS清洗细胞爬片，每孔加入500μL质量浓度为4%的低聚甲醛固定10min；PBS清洗3次，加入质量浓度为0.25%的Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)透膜化，室温下15min；加入质量浓度为5%牛血清白蛋白(BSA)封闭杂蛋白，4℃封闭2h；PBS清洗3次，加入鼠源NP单抗(1：100稀释)，37℃孵育1h；PBS清洗3次，避光加入二抗(488标记山羊抗小鼠IgG)，37℃避光孵育1h；PBS清洗3次，避光加入DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)，染色10min，PBS洗净；甘油封片，激光共聚焦显微镜下观察。结果如图14所示，从图中可看到柴胡皂苷a对病毒核蛋白NP的出核具有显著抑制作用。

实施例7柴胡皂苷a在A549细胞中对流感病毒诱导的细胞炎症因子的抑制作用

取生长于对数期的A549细胞按常规消化，调整其密度至2×10⁶个细胞/mL接种于6孔细胞培养板，培养18-24h，待其铺满细胞培养皿，弃旧液，PBS清洗两遍，加入病毒感染复数MOI为0.1的H5N1流感病毒，37℃、5%(体积分数)CO₂培养1h，弃病毒液，PBS清洗两遍，加入SSa稀释液，置于培养箱，继续培养24h。实验同时设正常对照组（不加受试药物，不用流感病毒刺激）、和H5N1病毒对照组(不加受试药物)，每个受试浓度均设三个平行组。培养终止后，吸取各孔培养上清，4℃离心（1000rpm/min，5min），根据Human TNF-αELISAKit、Human IL-6ELISA Kit及Human IL-8ELISA Kit说明书测定各个样品中的TNF-α、IL-6及IL-8的含量。结果如图15-17所示，从图15-17可看到，柴胡皂苷a对流感病毒感染诱导A549细胞产生炎症因子TNF-α、IL-6及IL-8均具有显著的抑制作用。

流感病毒的增殖有赖于病毒NP蛋白在胞核中合成并转入胞浆中（出核），而流感病毒诱导的炎症因子大量分泌是导致严重肺炎及死亡的主要原因。抑制NP的出核可减少子代病毒的合成，抑制炎症因子的分泌可减轻病毒感染导致的肺炎炎症程度。因此，柴胡皂苷a对流感病毒具有很好的防治作用。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种结构如下的柴胡皂苷a在制备预防和治疗人及动物流感的药物中的用途：

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，以柴胡皂苷a作为有效成分配以辅助剂制成注射液、片剂、胶囊剂或颗粒剂。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述流感为H1N1亚型、H9N2亚型、H5N1亚型、H3N2甲型或H7N9甲型流感病毒引起的流感。