CN103720650A - 一种具有抗流感病毒作用的黄芩苷注射剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种具有抗流感病毒作用的黄芩苷注射剂，由黄芩苷、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、注射用水，经高温高压灭菌制成，其中黄芩苷按所需体积和设定浓度称取，磷酸二氢钠0.60克，磷酸氢二钠2.16克，添加注射用水100毫升，氢氧化钠调节pH至7.0。该种药物具有显著的体内外抗流感病毒的活性、生物利用度高、副作用和不良反应少等优点，其具有抑制病毒神经氨酸酶活力从而阻断病毒释放的作用，在防治流感病毒方面有独特的优势和广阔的发展前景。

Description

一种具有抗流感病毒作用的黄芩苷注射剂

技术领域

本发明涉及一种具有抗流感病毒作用的黄芩苷注射剂，黄芩苷溶解于磷酸盐缓冲液。

背景技术

流行性感冒是由流感病毒引起的一种严重威胁人类生命和健康的急性呼吸道传染病，传染性强，潜伏期短，发病率高，是第一个实行全球监测的传染病，至今对它的危害尚无法完全加以控制。流感主要通过近距离空气飞沫传播，也可通过口腔、鼻腔、眼睛等处粘膜直接或间接接触传播。流感症状多表现为畏寒高热，多伴头痛、全身肌肉关节酸痛、极度乏力、食欲减退等全身症状，常有咽喉痛、干咳，流涕以及其它上呼吸道感染症状，当流感痫毒蔓延至下呼吸道，则可能引起毛细支气管炎和间质性肺炎，此外流感还可诱发细菌性肺炎等并发症。世界卫生组织的数据显示，每年全球有6-12亿人感染发病，有300万-500万严重的流感病例，25万-50万人因流感死亡，直接经济损失达数百亿美元。近期人感染H7N9禽流感病毒病例的出现引起社会广泛关注。因此，抗流感药物的研发具有深远的意义和广泛的市场前景。

流感病毒是引起流感的病原体，流感病毒属正粘病毒科，是有包膜的单股、负链、分节段的RNA病毒，直径80-120nm，呈球形或丝状。流感病毒结构自外而内可分为包膜、基质蛋白以及核心三部分。在流感病毒感染后，病毒在敏感宿主细胞内复制：吸附、穿入、脱衣壳、大分子生物合成、装配以及释放。流感病毒根据其核蛋白的抗原性可以分为三类：甲(A)、乙(B)、丙(C)三型。其中甲型流感病毒最容易发生变异，在人群免疫压力下，每隔2-3年就会有流行病学上重要的抗原变异株出现，可感染人和多种动物，为人类流感的主要病原体，常引起大流行和中小流行。

流感病毒变异性强，给防治带来极大困难。病毒表面抗原连续不断地发生抗原性漂移和抗原性转变，需要每年开发新的疫苗，从而极大的限制了疫苗的应用和预防效果。目前临床上使用的抗流感病毒药物主要是M2质子阻断剂，如金刚烷胺和金刚乙胺；NA抑制剂，如奥司他韦和扎那米韦；核苷类药物，如利巴韦林；免疫调节类药物，如真菌多糖。金刚烷胺和金刚乙胺用于流感的预防和治疗已有30多年的历史，但因存在神经毒性，易产生耐药毒株和对乙型流感毒无效等缺陷，限制了其临床上的广泛应用。利巴韦林会在红细胞内发生反应，主要严重不良反应是溶血性贫血，这可能会恶化已经存在的心脏疾病，利巴韦林也会有导致畸形的作用。扎那米韦和奥司他韦等神经氨酸酶抑制剂能够同时抑制A型和B型流感病毒，不易引起耐药且耐受性好。但扎那米韦和奥司他韦在临床上的使用有一定的局限性，如扎那米韦的口服利用度低，体内分布容积小，肾脏清除快，只能作为局部用药；奥司他韦(商品名达菲)作为抗流感特效药，经受了禽流感和甲型H1N1流感的双重考验，但由于价格较高，难以在发展中国家推广，同时临床上大量耐药病毒株的出现也已被报道。

黄芩为常用中药，始载于《神农本草经》，唇形科植物黄芩的干燥根，主要有效成分是黄酮类化合物，主要有清热燥湿、泻火解毒、止血安胎之效，为中医治疗肺热咳嗽，高热烦渴的首选药。黄芩苷，分子式为C₂₁H₁₈O₁₁，分子量为446.37。黄芩苷是黄芩中提取的多酚羟基黄酮类中药单体，是黄芩的主要活性成分之一。现代科学研究结果证明黄芩苷有抑菌、抗炎、抗氧化、解热、调节免疫功能、抗HIV、抗肿瘤等活性，在清除氧自由基、减轻组织的缺血再灌注损伤、抗变态反应等多方面均有作用。对黄芩苷抗流感病毒作用的研究报道则较少，本实验对黄芩苷体内外抗流感病毒作用进行了研究。黄芩苷的抗病毒谱较广，资源丰富，在黄芩中含量超过9％，易于提取分离，是一种具开发潜力的抗病毒药物资源。

发明内容

本发明涉及一种具有抗病毒体内外药效的黄芩苷注射剂，由黄芩苷、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、注射用水，经高温高压灭菌制成，其中黄芩苷按所需体积和设定浓度称取，磷酸二氢钠0.60克，磷酸氢二钠2.16克，添加注射用水100毫升，氢氧化钠调节pH至7.0。

本发明首次开展了黄芩苷单独运用于抗流感病毒的研究，首次提出了黄芩苷以注射剂剂型运用于抗流感病毒的治疗。本发明通过体外实验证明了黄芩苷对甲型流感病毒A/FM/1/47(H1N1)和A/Bei jing/32/92(H3N2)具有明显的抑制作用，同时通过体内实验证明了黄芩苷注射给药对A/FM/1/47(H1N1)感染小鼠有生存保护和体重保护作用，可以明显延长生存时间，减缓肺部感染症状。综上，通过本发明制成的黄芩苷注射制剂具有抗病毒体内外药效，且毒副作用较小。黄芩苷注射给药可避免胃肠道对药物的破坏，避免肝的首过效应，生物利用度高，起效快。

权利要求

1.一种具有抗流感病毒作用的黄芩苷注射剂，其特征在于：由黄芩苷、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、注射用水，经高温高压灭菌制成，其中黄芩苷按所需体积和设定浓度称取，磷酸二氢钠0.60克，磷酸氢二钠2.16克，添加注射用水100毫升，氢氧化钠调节pH至7.0。

2.权利要求2的黄芩苷注射剂在制备治疗流感病毒感染性疾病药物中的应用。

附图说明

图1是黄芩苷注射剂对甲型流感病毒A/FM/1/47(H1N1)感染的MDCK细胞病变的抑制作用

图2是黄芩苷注射剂对甲型流感病毒A/Bei jing/32/92(H3N2)感染的MDCK细胞病变的抑制作用

图3是黄芩苷注射剂抗甲型流感病毒A/FM/1/47(H1N1)的抑制率

图4是黄芩苷注射剂抗甲型流感病毒A/Bei jing/32/92(H3N2)的抑制率

图5是黄芩苷注射剂对甲型流感病毒A/FM/1/47(H1N1)感染小鼠的体重保护作用

图6是黄芩苷注射剂对甲型流感病毒A/FM/1/47(H1N1)感染小鼠肺炎保护的影响的病理切片

具体实施方式

为了证明本发明的可靠性，进行了四项抗病毒实验。

实施例1

黄芩苷注射剂对甲型流感病毒A/FM/1/47(H1N1)和A/Bei jing/32/92(H3N2)感染MDCK细胞病变抑制作用和对细胞存活率影响

实验设置正常对照组、病毒对照组、阳性药奥司他韦4μg/ml、利巴韦林组2μg/ml和黄芩苷组80μg/ml、60μg/ml、40μg/ml、30μg/ml、20μg/ml。MDCK细胞按5×10⁴/ml浓度接种96孔培养板，每孔100μl，置37℃5％CO₂培养箱中培养24h形成细胞单层。弃上清后，加入100TCID₅₀流感病毒A/FM1/1/47(H1N1)或A/Bei jing/32/92(H3N2)感染细胞，37℃孵育2h后，除去病毒液，加入含有不同浓度的黄芩苷80μg/ml、60μg/ml、40μg/ml、30μg/ml、20μg/ml及阳性对照药利巴韦林组2μg/ml、奥司他韦组4μg/ml的维持培养基，正常对照组和病毒对照组仅加入维持培养基。MDCK细胞于37℃，5％CO₂培养箱中培养48h，逐日观察CPE，弃上清后，加入100μl10％甲醛固定1h，0.1％(w/v)结晶紫染色15min，酶标仪570nm测定吸光度。实验共重复3次。

实验结果表明流感病毒感染MDCK细胞后，导致MDCK细胞产生细胞病变并死亡，致使细胞数目明显减少。黄芩苷对流感病毒A/FM1/1/47(H1N1)和A/Bei jing/32/92(H3N2)在MDCK细胞中的增殖具有较强的抑制作用，表现出良好的CPE抑制(图1，图2)，显著提高了病毒感染细胞的存活率，且呈剂量依赖(图3，图4)，黄芩苷浓度为80μg/ml时，对流感病毒A/FM1/1/47(H1N1)的抑制率是83.7％，对流感病毒A/Bei jing/32/92(H3N2)的抑制率是38.0％，其中黄芩苷对H1N1的抗病毒药效优于H3N2，并且显著高于阳性药奥司他韦和利巴韦林。实验结果(表1)为黄芩苷和阳性药利巴韦林对MDCK细胞的半数细胞毒浓度(CC₅₀)、半数效应浓度(EC₅₀)和治疗指数(SI)。

表1黄芩苷注射剂对甲型流感病毒A/FM1/1/47(H1N1)和A/Bei jing/32/92(H3N2)感染MDCK细胞的EC₅₀、CC₅₀和SI

实施例2

黄芩苷注射剂对甲型流感病毒A/FM/1/47(H1N1)感染小鼠死亡保护率的影响

实验采用17-20g的ICR小鼠，随机分为6组，设为正常对照组、病毒对照组、奥司他韦组100mg/kg/d、利巴韦林组100mg/kg/d和黄芩苷低剂量组50mg/kg/d、黄芩苷中剂量100mg/kg/d、黄芩苷高剂量组200mg/kg/d。适应性培养7天后，开始实验。除正常对照组外，其其他各组小鼠用乙醚轻度麻醉，鼻腔内接种相当于8LD₅₀的含流感病毒的鸡胚尿囊液50μl/只，奥司他韦组于感染后1h采取灌胃给药，每日1次，1次0.2ml，共给药5天。利巴韦林组、黄芩苷各剂量给药组于感染后1h尾静脉给药，以后每日1次，1次0.2ml，共给药5天。病毒对照组及正常对照组同法给予0.2ml的磷酸缓冲盐溶剂。小鼠感染病毒后，连续14天观察生存状况，记录死亡数、死亡时间和平均存活时间。

实验结果(表2)表明黄芩苷对流感病毒感染导致的小鼠死亡有较好的保护作用，并能明显延长流感病毒感染小鼠的平均存活时间。奥司他韦组100mg/kg/d对小鼠的死亡保护率达60%，平均存活时间为11.3天(P<0.005)，利巴韦林组100mg/kg/d对小鼠的死亡保护率达70％，平均存活时间为12.1天(P<0.005)，黄芩苷高剂量组200mg/kg/d对小鼠的死亡保护率达50%，平均存活时间为10.7天(P<0.005)，黄芩苷中剂量组100mg/kg/d对小鼠的死亡保护率达30％，平均存活时间为8.7天(P<0.005)。与病毒组对照相比，给予黄芩苷高剂量组200mg/kg/d、黄芩苷中剂量组100mg/kg/d、阳性药奥司他韦组100mg/kg/d和利巴韦林组100mg/kg/d均可以降低小鼠的死亡率，提高小鼠的死亡保护率，显著延长存活时间。

表2黄芩苷注射剂对甲型流感病毒A/FM/1/47(H1N1)感染小鼠死亡保护率的影响

注：与病毒组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.005。

实施例3

黄芩苷注射剂对甲型流感病毒A/FM/1/47(H1N1)感染小鼠的体重保护作用

病毒感染小鼠后，引起小鼠病毒性肺炎，导致小鼠呼吸不畅、进食减少、体重减轻，体重保护是评价药物对病毒在体内增殖的抑制的一个有用的表观指标。实验结果(图5)表明，除了正常组小鼠，其他组的小鼠于第3天开始出现体重下降和疾病症状，表现为耸毛、食差、消瘦、蜷缩怕冷等，同时小鼠体重在第4、5天持续降低，病毒组小鼠体重下降幅度最大，由于黄芩苷、利巴韦林和奥司他韦抑制了病毒在小鼠肺部的增殖，各给药组小鼠体重下降的幅度比病毒组小，均一定程度上表现出保护小鼠的体重的作用。同时，各给药组的疾病感染的症状相对病毒组比较轻微，并且在第6天后，体重持续增加，部分小鼠的感染症状减少并消失。这就表明黄芩苷组、奥司他韦组和利巴韦林组对小鼠的体重都有一定程度的保护作用。

实施例4

黄芩苷注射剂对甲型流感病毒A/FM/1/47(H1N1)感染小鼠的肺炎保护作用

流感病毒在小鼠肺部增殖，引起病毒性肺炎，导致肺脏肿大、病变，肺重增加，小鼠消瘦，体重减轻，重症时致死。对小鼠体内感染流感病毒的肺炎保护作用作为药效考察的常用指标，通常以肺指数值的大小表示肺病变的严重程度，肺脏组织学检查也作为考察黄芩苷的体内抗流感病毒活性的指标。实验采用的试验动物分为正常对照组、病毒对照组、阳性药奥司他韦组100mg/kg/d、利巴韦林组100mg/kg/d和黄芩苷低剂量组50mg/kg/d、黄芩苷中剂量100mg/kg/d、黄芩苷高剂量组200mg/kg/d。小鼠的感染和给药方法同上一实验。小鼠感染病毒后，第五天禁食禁水8h，小鼠称重，摘眼球放血致死，取出全肺，用生理盐水漂洗，干净滤纸擦拭干净，称重。计算肺指数以及肺指数抑制率，送去做病理切片以及肺评分。

实验结果表明(表3)给与不同浓度的黄芩苷可以一定程度的抑制肺指数，病变情况有所减轻，肺评分减少，对感染小鼠的肺部保护作用呈剂量依赖的增强。其中，病毒组小鼠的肺指数为2.9，奥司他韦组小鼠的肺指数为1.5(P<0.005)，利巴韦林组小鼠的肺指数为1.3(P<0.005)，黄芩苷高剂量组小鼠的肺指数为1.8(P<0.005)，黄芩苷中剂量组小鼠的肺指数为2.0(P<0.005)。病理切片结果表明(图6)对流感病毒感染所致小鼠肺组织炎性病变有一定的防治作用。正常肺组织由肺泡、肺内支气管分支及间质组成，结构清晰，肺泡腔无渗出物。肺内各级支气管上皮细胞无变性、坏死或脱落，腔内无渗出物，管周和血管周围无明显炎细胞浸润。而病毒对照组肺泡壁充血，中度炎细胞浸润，炎细胞类型主要为中心粒细胞和单核巨噬细胞，伴有重度充血。肺内支气管上皮细胞全部坏死、脱落，支气管周围有中度炎细胞浸润，炎细胞浸润类型同前。肺血管周围间隙增宽，呈现中度水肿，其内有重度同前类型的炎细胞浸润。随着黄芩苷给药剂量增加，病变状况有所减轻表现为肺泡壁充血，炎细胞浸润减少，肺评分减小，各给药组具有抗病毒所致肺部感染疾病的作用。其高剂量组、中剂量组、利巴韦林和奥司他韦组病变程度较模型组有较明显减轻。

表3黄芩苷注射剂对甲型流感病毒A/FM/1/47(H1N1)感染小鼠肺炎保护的影响

注：与病毒组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.005。

Claims (2)

1.一种具有抗流感病毒作用的黄芩苷注射剂，其特征在于：由黄芩苷、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、注射用水，经高温高压灭菌制成，其中黄芩苷按所需体积和设定浓度称取，磷酸二氢钠0.60克，磷酸氢二钠2.16克，添加注射用水100毫升，氢氧化钠调节pH至7.0。

2.权利要求2的黄芩苷注射剂在制备治疗流感病毒感染性疾病药物中的应用。

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