CN101797246A

CN101797246A - 黄芩黄酮抗甲型流感病毒亚型感染的应用

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Publication number: CN101797246A
Application number: CN200910109928A
Authority: CN
Inventors: 曲敬来; 刘玉玲; 高雪
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2009-10-30
Filing date: 2009-10-30
Publication date: 2010-08-11
Anticipated expiration: 2029-10-30
Also published as: CN101797246B

Abstract

本发明公开了黄芩黄酮抗甲型流感病毒亚型感染的应用，以及黄芩素、黄芩苷及黄芩总黄酮提取物在制备抗流感病毒甲型新型H1N1、甲型H1N1和H3N2亚型的药物和卫生用品的应用。将黄芩素、黄芩苷及黄芩总黄酮提取物中的活性物质与药剂学上允许的赋形剂混合，制成患者可接受的制剂和卫生用品，临床上用于甲型新型H1N1、甲型H1N1和H3N2亚型流感的治疗和预防，疗效显著，安全性好。

Description

黄芩黄酮抗甲型流感病毒亚型感染的应用

技术领域

本发明涉及一类可用于抗甲型流感病毒亚型感染的黄芩黄酮类活性物质，属于生物医药技术领域，尤其是涉及到将黄酮类活性物质与药剂学上允许的赋形剂混合，制成患者可接受的制剂和卫生用品，用于治疗或预防甲型新型H1N1流感、甲型H1N1流感及甲型H3N2流感。

背景技术

流感病毒分为甲、乙、丙三种类型，致病株主要是甲、乙型，丙型基本不致病。其中甲型流感病毒是几次世界性流感流行的主要病原体，而且目前世界上流行的也多为甲型。目前为止，甲型流感病毒共有15种不同的血凝素和神经氨酸酶被分离鉴定，可分为多种亚型，如H1N1，H1N2，H2N2，H3N2等。自发现流感病毒，20世纪中有5次世界性大流行的记载，分别发生于1900、1918、1957、1968和1977年，其中以1918年的一次流行最为严重，死亡人数达2000万以上。我国从1953年至1976年已有12次中等或中等以上的流感流行，每次流行均由甲型流感病毒所引起，2003年爆发的禽流感也是一种由甲型流感病毒亚型引起的呼吸道传染病。

甲型H1N1流感是一种由病毒A(H1N1)引起的呼吸系统疾病。人感染甲型H1N1流感后的症状与普通人流感相似，包括发热、咳嗽、喉咙痛、身体疼痛、头痛、发冷和疲劳等，有些还会出现腹泻和呕吐，重者会继发肺炎和呼吸衰竭，甚至死亡。猪流感首发于1917年的澳大利亚，死亡人数估计5千万；1976年2月美国新泽西洲迪克斯堡新兵营中发生了一起猪(H1N1)亚型毒株流感事件，约200余人被感染，一人死亡；2005年12月至2009年1月，美国只发现过12例人感染猪流感病例，其中11人与猪有过直接接触；2007年菲律宾发现猪流感，死亡率占到受感染人的10％；2009年4月，墨西哥爆发大规模的猪流感，这种病毒已被证实经由人-人形式传播。在人际传播时，打喷嚏、咳嗽和物理接触都有可能导致新型猪流感病毒在人群间传播，给全球人类造成的社会及经济危害难以预计。2009年4月30日中国卫生部发布2009年第8号公告，明确将甲型H1N1流感(原称人感染猪流感)纳入传染病防治法规定管理的乙类传染病，并采取甲类传染病的预防、控制措施。通过相关流行病学调查，在人类中引发流行的最为常见除了甲型H1N1流感，甲型H3N2流感也给人类带来重大恐慌和损失。

目前，国内外对流感的防治方法就是根据抗原抗体学说运用疫苗来预防流感的发生，但疫苗在几次流感的预防观察中都未能控制流行，其原因是流感的抗原不断发生着变异，疫苗往往也就失去效力。而用于抗甲型流感病毒的药物，如金刚烷胺、甲基金刚烷胺、利巴韦林、病毒唑和干扰素等，基于病毒的变异性及药物的耐药等问题，使流感病毒的防治问题仍很严峻。从美国最近的甲型H1N1流感病毒感染者中分离出的病毒对金刚烷胺和金刚乙胺耐药，由Gilead公司推出的口服剂神经氨酸酶抑制剂oseltamivir早期应用对甲型流感有一定的防治作用，但因其价格昂贵，临床上应用不广。因而，抗甲型流感病毒药物研究具有重要的实际意义。

中药不仅具有耐药性低、副作用和不良反应少等优点，而且还有抑制病毒复制、调节免疫功能、改善血液循环、解热镇痛及抗菌消炎等综合功效，其在防治流感病毒方面具有独特的优势和广阔的发展前景。黄芩为唇形科(labiatae)植物黄芩(Scutellaria baicalensis Georgi)的干燥根，又名子芩、条芩、独尾芩、鼠尾芩、黄芩条等，具有清热、泻火、解毒、止血、安胎等作用，是中医治疗肺热的要药，在我国有上千年的使用历史，安全性好，被收载于《神农本草经》中并列为中品。黄酮是黄芩中的重要活性物质，主要包括黄芩苷(Baicalin)、黄芩素(Baicalein)、汉黄芩素(wogomin)、汉黄芩苷(Wogonoside)等四种成分，其中以黄芩苷和黄芩素活性较强。黄芩素化学名称为5，6，7-三羟黄酮黄芩苷。黄芩素7位羟基被取代后形成的黄芩素-7-O-葡萄糖醛酸苷即为黄芩苷。黄芩素为黄芩苷的苷元，两者具有类似的药理活性，化学结构式如下：

大量研究证实黄芩中的黄酮类成分具有抑制胰酶活性、抗菌、抑制炎症反应、抗病毒、清除自由基等广泛的药理作用，其中抗炎、抗病毒的主要活性物质为黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素。黄芩黄酮类成分具有广谱抗病毒活性，对多种病毒有灭活作用，对炎症的渗出、水肿均有明显的抑制作用，对各种病毒感染引起的发热有明显解热作用；并能增强机体细胞的免疫功能，提高白细胞、中性粒细胞及巨噬细胞对病毒的吞噬能力。对多种病毒如呼吸道流感病毒、肝炎病毒和艾滋病病毒均有不同程度的抑制作用，且相关研究已证实黄芩黄酮对引起手足口病的多种肠道病毒具有抑制作用，临床上可用于治疗及预防手足口病。还没有将黄芩黄酮用于抗甲型新型H1N1流感、甲型H1N1流感及甲型H3N2流感的相关研究或者报道。

发明内容

本发明涉及到一类黄芩黄酮活性物质在制备抗流感病毒甲型新型H1N1、甲型H1N1和H3N2亚型的药物和卫生用品的应用，解决现有技术存在的缺陷。

活性物质为黄芩黄酮，具体包括黄芩素(B)、黄芩苷(BG)和黄芩总黄酮提取物。

黄芩素和黄芩苷的单体可采用黄芩药材提取精制的方法获得，还可采用化学合成的方法制备。

所述的黄芩素和黄芩苷由黄芩药材中提取精制而得，或者通过化学合成方法制备；HPLC法测定提取或制备的黄芩素和黄芩苷，单体含量不得低于90％。

所述的黄芩总黄酮提取物系由黄芩药材经水和/或醇提取而得，提取物的活性成分包括黄芩苷和黄芩素、汉黄芩苷、汉黄芩素中的至少一种组成；HPLC法测定，以黄芩苷计算，提取物中总黄酮含量不得低于50％。

优选的方案是：黄芩黄酮选自黄芩素和黄芩苷中。

优选的方案是：黄芩黄酮为黄芩素。

更为优选的方案是：将黄芩黄酮类活性物质与药剂学上允许的赋形剂混合，制成患者可接受的制剂，通过口服、注射、吸入或粘膜给药。

更为优选的方案是：黄芩黄酮类活性物质制成各种卫生用品可接受的形式，包括消毒水、爽身粉、牙膏、香皂、肥皂、浴液、洗发香波、漱口水、护肤膏、防晒油、香水。

更为优选的方案是：黄芩黄酮类活性物质用于治疗或预防流感病毒甲型新型H1N1，和/或甲型H1N1，和/或甲型H3N2流感病毒的感染。

更为优选的方案是：所述制剂通过如下方法制备：将黄芩黄酮活性物质与脂质材料按比例混合，加适量有机溶剂溶解或分别用不同的有机溶剂溶解后再混合，在合适的温度条件下搅拌，旋转蒸发、喷雾干燥或冷冻干燥制得黄酮/脂质复合物，再与药剂学上允许的赋形剂混合，制成患者可接受的制剂。其中，“适量有机溶剂”中的“适量”具体地说，是指黄芩黄酮活性物质与脂质材料在溶液中的浓度以黄芩黄酮活性物质计算，控制在1mg/ml～100mg/ml，优选5mg/ml～40mg/ml；“合适的温度条件”系指控制在20℃～70℃，优选为20℃、35℃、45℃、55℃或70℃，更为优选为45℃或55℃。

更为优选的方案是，其特征在于黄酮/脂质复合物中复合物由重量百分比为5-75％的黄酮类活性物质和重量百分比为25-95％的脂质材料组成；脂质材料选自天然脂质、合成脂质以及它们的混合物，其中天然脂质材料包括大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、胆甾醇、胆酸、海藻酸钠和壳聚糖。

更为优选的方案是，其特征在于黄酮/脂质复合物中复合物由重量百分比为5-75％的黄芩素和重量百分比为25-95％的脂质材料组成；脂质材料选自天然脂质、合成脂质以及它们的混合物，其中天然脂质材料包括大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、胆甾醇、胆酸、海藻酸钠和壳聚糖。

更为优选的方案是，其特征在于：制剂通过如下方法制备：将黄芩素/脂质复合物溶于油中形成油相，加入水相、乳化剂、助乳化剂和稳定剂，经乳化制成水包油(O/W)脂肪乳剂。

黄芩总黄酮提取物，系指采用常规提取方法如水煎煮法、乙醇回流法、乙醇和/或水室温浸提法等，从黄芩药材中提取得到的混合成分；提取物的黄酮组分中，除黄芩苷外，还包含黄芩素、汉黄芩苷和汉黄芩素中的至少一种。采用HPLC法测定，总黄酮含量(以黄芩苷计)在50％以上。

本发明所述的黄芩黄酮活性物质，与药剂学上允许的赋形剂混合，制成患者可接受的制剂，通过口服、注射、吸入或粘膜给药。

本发明所述的黄芩黄酮活性物质，加入相关的赋形剂，可制成各种卫生用品可接受的形式，包括消毒水、爽身粉、牙膏、香皂、肥皂、浴液、洗发香波、漱口水、护肤膏、防晒油、香水等。

本发明所述的黄芩黄酮活性物质及其各种制剂形式、卫生用品形式，用于治疗或预防流感病毒甲型新型H1N1流感、流感病毒甲型H1N1和流感病毒甲型H3N2流感的感染。

本发明对涉及的黄芩黄酮类活性物质进行了体外抗病毒试验和体内试验观察。

体外抗病毒试验考察了黄芩素、黄芩苷及不同含量的黄芩总黄酮提取物对MDCK细胞(狗肾细胞)的细胞毒性作用，采用Reed and Muench法对药物半数有毒浓度TC₅₀进行了计算，并确定最大无毒浓度TC₀。在此基础上，考察了各受试药物对甲型流感病毒亚型的抑制效果，以Reed and Muench法计算药物对病毒生长抑制率及半数有效浓度IC₅₀。并计算药物选择指数(SI)。

体外抗病毒试验涉及的甲型流感病毒包括H1N1、H3N2亚型。

结果表明，黄芩素和黄芩苷单体及黄芩总黄酮提取物对流感病毒甲型H1N1、H3N2亚型均具有明显的抑制作用，安全性好。

四组受试样品比较，对病毒的抑制活性依次为黄芩素＞黄芩苷＞黄芩黄酮提取物(黄芩素和黄芩苷含量总和为73.4％)＞黄芩黄酮提取物(黄芩素和黄芩苷含量总和为50％)。

在体外抗流感病毒甲型试验基础上，本发明通过体内抗病毒方法又考察了各样品的药效学作用，实验结果表明：各试验药对FM1病毒所致小鼠肺炎有明显的治疗作用，与模型对照组相比，P＜0.05；对小鼠存活率有一定的延长作用；对病毒有明显的抑制效果，其肺指数与模型对照组相比分别为P＜0.05。

鉴于甲型新型H1N1流感、甲型H1N1流感及甲型H3N2流感目前尚无特效治疗药物和疫苗，本发明研究内容对甲型新型H1N1流感、甲型H1N1流感及甲型H3N2流感治疗及预防具有重要社会、经济价值和重大的现实意义。

具体实施例

以下内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，但本发明的权利要求并不只局限于这些具体实施例的内容。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

实施例1受试样品的含量测定

受试样品：黄芩素

黄芩苷

黄芩总黄酮提取物1

黄芩总黄酮提取物2

测定方法：取四组受试样品适量，精密称定，分别加甲醇溶解并稀释成浓度为1.0μg/mL的溶液，滤过，取续滤液作为供试品溶液；另取黄芩素、黄芩苷对照品适量，同法制备浓度相当的对照品溶液；分别量取对照溶液和供试溶液，照HPLC法测定，色谱柱为Agilent ZORBAX SB C18柱(25mm×4.6mm，5μm)，流动相及洗脱梯度见下表，流速1mL/min，进样体积20μL，检测波长275nm，室温检测。

黄芩素和黄芩苷含量分别根据各自的对照按外标法计算，黄芩总黄酮提取物的含量以黄芩苷为对照按外标法计算。

表1HPLC流动相组成及梯度

结果表明，黄芩素受样品含量为94.2％；黄芩苷受试样品含量为96.5％；黄芩总黄酮提取物1的黄酮总含量(以黄芩苷计)为50％；黄芩总黄酮提取物2的黄酮总含量为73.4％。

实施例2黄芩素对流感病毒甲型亚型的抑制作用

按照发明内容项下的体外抗病毒试验方法，依法考察黄芩素受试样品对流感病毒甲型H1N1、H3N2亚型所致细胞病变的抑制作用，考察结果见下表：

表2：黄芩素对流感病毒甲型H1N1、H3N2亚型的抑制作用

实施例3：黄芩苷对流感病毒甲型亚型的抑制作用

按照体外抗病毒试验方法，依法考察黄芩苷受试样品对流感病毒甲型H1N1、H3N2亚型所致细胞病变的抑制作用，考察结果见下表：

表3：黄芩苷对流感病毒甲型H1N1、H3N2亚型病毒的抑制作用

实施例4：黄芩总黄酮提取物1对流感病毒甲型亚型的抑制作用

按照体外抗病毒试验方法，依法考察黄芩总黄酮提取物1对流感病毒甲型H1N1、H3N2亚型所致细胞病变的抑制作用，考察结果见下表：

表4：黄芩总黄酮提取物1对流感病毒甲型H1N1、H3N2亚型的抑制作用

实施例5：黄芩总黄酮提取物2对流感病毒甲型亚型的抑制作用

按照体外抗病毒试验方法，依法考察黄芩总黄酮提取物2对流感病毒甲型H1N1、H3N2亚型所致细胞病变的抑制作用，考察结果见下表：

表5：黄芩总黄酮提取物2对流感病毒甲型H1N1、H3N2亚型的抑制作用

实施例6：黄芩素、黄芩苷、黄芩总黄酮提取物1、黄芩总黄酮提取物2抗FM₁对小鼠肺指数的影响

按照体内抗病毒试验方法，依法考察四个样品抗FM₁对小鼠肺指数的影响，考察结果见下表：

表6：四个样品抗FM₁对小鼠肺指数的影响

P值与模型组比较

实施例7：黄芩素、黄芩苷、黄芩总黄酮提取物1、黄芩总黄酮提取物2抗FM₁对小鼠存活率的影响

按照体内抗病毒试验方法，依法考察四个样品抗FM₁对小鼠存活率的影响，考察结果见下表：

表7：四个样品抗FM₁对小鼠存活率的影响

P值与模型组比较

实施例8：黄芩素、黄芩苷治疗甲型新型H1N1流感、甲型H1N1流感、甲型H3N2流感的临床疗效

1.1资料和方法

1.1.1临床资料

本组病例均为2009年确诊的甲型新型H1N1流感、甲型H1N1流感、甲型H3N2流感患者，年龄19±45岁，随机分为治疗组1(黄芩素干粉)30例，治疗组2(黄芩苷干粉)30例，对照组(达菲)10例，其中治疗组1、治疗组2再各分为治疗组A(甲型新型H1N1流感)10例、治疗组B(甲型H1N1流感)和治疗组C(甲型H3N2流感)10例，各组在性别、年龄、病程和病情分布上无统计学意义(P＞0.05)。

1.1.2诊断标准

(1)与新型H1N1、H1N1或H3N2患者有密切接触史。(2)一周内出现流感临床表现者。(3)从鼻咽拭子中分离到特定病毒，RT-PCR对标本检测，有新型H1N1、H1N1或H3N2病毒RNA存在，经过测序证实结果两次为阳性者。

1.2治疗方法

治疗组1给予黄芩素干粉10g，口服，每日两次；治疗组2给予黄芩苷干粉10g，口服，每日两次；对照组用达菲75mg口服，每日两次。疗程为5天。

1.3疗效标准

显效：24h内体温正常，咳嗽、咳痰等临床症状明显缓解，从鼻咽拭子中分离的病毒经RT-PCR检测，新型H1N1、H1N1、H3N2病毒RNA一次结果为阴性者。

有效：72h内体温正常，咳嗽、咳痰等临床症状有所缓解，从鼻咽拭子中分离的病毒经RT-PCR检测，新型H1N1、H1N1、H3N2病毒RNA一次结果为阴性者。

无效：治疗5d仍发热，咳嗽、咳痰等临床症状未缓解，从鼻咽拭子中分离的病毒经RT-PCR检测，新型H1N1、H1N1、H3N2病毒RNA结果仍为阳性。

1.4结果

运用本发明黄芩治疗流感病毒甲型新型H1N1流感、甲型H1N1流感及甲型H3N2流感，结果表明：比较七组的发热、咽痛、咳嗽、咳痰改善情况、血象改善情况，治疗组总有效率为73.3％，对照组达菲组为75.9％。与达菲组差异无统计学意义(P＞0.05)。在临床治疗观察中未发现毒副作用。临床结果提示：本发明黄芩素、黄芩苷治疗流感病毒甲型新型H1N1流感、甲型H1N1流感、甲型H3N2流感疗效满意。

Claims

1.黄芩黄酮在制备抗流感病毒甲型新型H1N1、甲型H1N1和H3N2亚型的药物和卫生用品的应用，其中黄芩黄酮包括黄芩素、黄芩苷及黄芩总黄酮提取物，黄芩素和黄芩苷的化学结构式如下：

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的黄芩素和黄芩苷由黄芩药材中提取精制而得，或者通过化学合成方法制备；HPLC法测定提取或制备的黄芩素和黄芩苷，单体含量不得低于90％。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的黄芩总黄酮提取物系由黄芩药材经水和/或醇提取而得，提取物的活性成分包括黄芩苷和黄芩素、汉黄芩苷、汉黄芩素中的至少一种组成；HPLC法测定，以黄芩苷计算，提取物中总黄酮含量不得低于50％。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：黄芩黄酮选自黄芩素和/或黄芩苷中。

5.根据权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于：将黄芩黄酮类活性物质与药剂学上允许的赋形剂混合，制成患者可接受的制剂，通过口服、注射、吸入或粘膜给药。

6.根据权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于：黄芩黄酮类活性物质制成各种卫生用品可接受的形式，包括消毒水、爽身粉、牙膏、香皂、肥皂、浴液、洗发香波、漱口水、护肤膏、防晒油、香水。

7.根据权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于：黄芩黄酮类活性物质用于治疗或预防流感病毒甲型新型H1N1，和/或甲型H1N1，和/或甲型H3N2流感病毒的感染。

8.根据权利要求7所述的的应用，其特征在于：所述制剂通过如下方法制备：将黄芩黄酮活性物质与脂质材料混合，加有机溶剂溶解或分别用不同的有机溶剂溶解后再混合，在20℃～70℃的温度条件下搅拌，旋转蒸发、喷雾干燥或冷冻干燥制得黄酮/脂质复合物，再与药剂学上允许的赋形剂混合，制成患者可接受的制剂。

9.根据权利要求8所述的的应用，其特征在于黄酮/脂质复合物中复合物由重量百分比为5-75％的黄酮类活性物质和重量百分比为25-95％的脂质材料组成；脂质材料选自天然脂质、合成脂质以及它们的混合物，其中天然脂质材料包括大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、胆甾醇、胆酸、海藻酸钠和壳聚糖。

10.根据权利要求9所述的的应用，其特征在于：制剂通过如下方法制备：将黄芩素/脂质复合物溶于油中形成油相，加入水相、乳化剂、助乳化剂和稳定剂，经乳化制成水包油(O/W)脂肪乳剂。