CN105998041A

CN105998041A - 迷迭香酸-4-O-β-D-葡萄糖苷在制备预治流感药物中的应用

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Publication number: CN105998041A
Application number: CN201610345135.0A
Authority: CN
Inventors: 李耿; 黎雄; 赖小平
Original assignee: Guangzhou University of Chinese Medicine
Current assignee: Guangzhou University of Chinese Medicine
Priority date: 2016-05-21
Filing date: 2016-05-21
Publication date: 2016-10-12
Anticipated expiration: 2036-05-21
Also published as: CN105998041B; WO2017202113A1

Abstract

本发明涉及迷迭香酸‑4‑O‑β‑D‑葡萄糖苷在制备预治流感药物的应用；其中，所述的流感为H1N1亚型或H9N2亚型流感病毒感染引起的流感。本应用中所述的药物由迷迭香酸‑4‑O‑β‑D‑葡萄糖苷和医学上可接受的辅料组成，其中所述的迷迭香酸‑4‑O‑β‑D‑葡萄糖苷在药物中的质量百分含量为5％～10％。本发明所述的迷迭香酸‑4‑O‑β‑D‑葡萄糖苷在细胞和动物体内均有显著的抑制H1N1亚型或H9N2亚型流感病毒增殖的作用，对流感病毒感染小鼠具有显著保护作用，可用于制备预防和防治人和动物流感的药物，而且安全无毒，疗效稳定。

Description

迷迭香酸-4-O-β-D-葡萄糖苷在制备预治流感药物中的应用

技术领域

本发明涉及多酚类化合物，具体涉及迷迭香酸苷，特别是涉及迷迭香酸苷抗流感的用途。

背景技术

流行性感冒简称流感,是由流感病毒引起的呼吸道疾病，具有流行性广、传染性强、发病率高等特点，在儿童、老人和高危人群中的死亡率较高。流感病毒是人类健康的一大威胁。应对流感病毒的主要方式是疫苗和药物治疗。对可能大规模爆发的流感疫情来讲，药物治疗是最好的控制流感病毒传播的手段。目前，抗流感病毒药物包括已在俄罗斯上市的盐酸阿比朵尔和美国FDA批准的4个抗流感病毒药物，后者根据作用机制的不同分为M2离子通道蛋白抑制剂和神经氨酸酶(NA)抑制剂。近年来，对抗流感病毒药物的研究取得了较大进展。M2离子通道蛋白抑制剂是最早上市的流感临床治疗药物，但存在神经毒性，长期服用易产生耐药毒株和对B型流感无效等缺陷。目前抗病毒西药虽然品种较多，但多数选择性低和不良反应较大，中药在抗病毒方面有其独特优点，不良反应相对较低，不易形成耐药性。根据抗流感病毒途径可将中药分为两大类：一类具有直接抑制病毒作用，其中大多数为清热解毒类中药，如金银花，鱼腥草，板蓝根，大青叶，黄芩，黄连等；而另一类通过增强免疫细胞能力发挥间接抗流感病毒作用，如黄芪、丹参等都能诱生干扰素和免疫球蛋白。研究比较清楚的抗流感成分主要有两类：一是多酚类物质，不仅可抑制流感病毒蛋白质和RNA合成，同时也可抑制流感病毒的吸附作用；另一类是黄酮类物质，能抑制流感病毒唾液酸酶的活性和抑制膜融合作用。中药具有很好的抗病毒作用，既可直接杀死病毒而不伤及机体组织，又可调动免疫防御系统的积极性，激发机体的主动免疫机制，增强免疫力，通过主动防御间接发挥抗病毒作用。因而，中药在西药产生耐药性、病毒发生变异的情况下，仍具有潜在治疗作用，具有更广泛的适应性和优越性；并且中草药在我国资源丰富，价格低廉，展现了广阔的研究与开发前景。因此，研制疗效确切、安全高效的治疗流感病毒感染的药物十分必要。

中国药物化学杂志报导了一种迷迭香酸-4-O-β-D-葡萄糖苷(李先霞，黄明菊，李妍岚，等.肿节风中抗氧化活性成分研究[J].中国药物化学杂志，2010，20(1)：57-60.)，该化合物的结构如下式(Ⅰ)所示。李先霞的文章中还公开了该化合物的鉴定数据和抗氧化活性，但无公开它的其它生活性和用途。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供化合物迷迭香酸-4-O-β-D-葡萄糖苷的新用途，即在制药中的新应用。

上述在制药中的新应用即为，迷迭香酸-4-O-β-D-葡萄糖苷在制备预治流感药物的应用；其中，所述的流感为H1N1亚型或H9N2亚型流感病毒感染引起的流感。

上述应用中，所述的药物由迷迭香酸-4-O-β-D-葡萄糖苷和医学上可接受的辅料组成，其中所述的迷迭香酸-4-O-β-D-葡萄糖苷在药物中的质量百分含量为5％～10％。

上述应用中，所述的药物为注射液、颗粒剂、胶囊或片剂。

上述应用中，所述的迷迭香酸-4-O-β-D-葡萄糖苷由以下方法制得：

(1)取肿节风药材的干燥粉，用蒸馏水浸提2次，合并提取液，用乙醇沉淀，收集上清液；

(2)将所收集的上清液以水稀释至生药浓度为0.5-1g/ml溶液，上清洗至中性的大孔树脂，然后用乙醇梯度洗脱，收集2倍树脂床体积的30％乙醇洗脱液，加入乙醇使乙醇浓度达80％，静置过夜，取上清浓缩干燥，以60％甲醇复溶，上样于ODS柱，甲醇梯度洗脱，收集40％甲醇洗脱液并浓缩得总迷迭香酸苷；

(3)将总迷迭香酸苷经硅胶柱层析分离，分别以甲醇体积浓度为20％、30％和40％的乙酸-水洗脱，每个比例2个柱体积；合并甲醇体积浓度为30％的乙酸-水的层析组分，60℃减压浓缩至干，得到迷迭香酸-4-O-β-D-葡萄糖苷；其中所述的乙酸-水中乙酸的体积含量为0.05％。

本发明所述的迷迭香酸-4-O-β-D-葡萄糖苷(以下简称迷迭香酸苷)在细胞和动物体内均有显著的抑制H1N1亚型或H9N2亚型流感病毒增殖的作用，对流感病毒感染小鼠具有显著保护作用，可用于制备预防和防治人和动物流感的药物，而且安全无毒，疗效稳定。

附图说明

图1为迷迭香酸苷对A549细胞毒性作用的细胞存活率曲线图。

图2为迷迭香酸苷对MDCK细胞毒性作用的细胞存活率曲线图。

图3为各试验组对A549细胞保护作用的细胞存活率条形图。

图4为各试验组对A549细胞内H1N1亚型流感病毒增值的抑制作用的病毒抑制率条形图。

图5为各试验组对A549细胞保护作用的细胞存活率条形图。

图6为各试验组对A549细胞内H9N2亚型流感病毒增值的抑制作用的病毒抑制率条形图。

图7为各试验组对MDCK细胞保护作用的细胞存活率条形图。

图8为各试验组对MDCK细胞内H1N1亚型流感病毒增值的抑制作用的病毒抑制率条形图。

图9为未感染对照组小鼠感染6天后肺组织切片放大200倍显微照片。

图10为病毒感染对照组小鼠感染6天后肺组织切片放大200倍显微照片。

图11为阳性药对照组小鼠感染6天后肺组织切片放大200倍显微照片。

图12为50mg/kg/d迷迭香酸苷混悬液口服组小鼠感染6天后肺组织切片放大200倍显微照片。

图13为20mg/kg/d迷迭香酸苷混悬液口服组小鼠感染6天后肺组织切片放大200倍显微照片。

图14为迷迭香酸苷的质谱图。

图15为迷迭香酸苷的H谱图。

图16为迷迭香酸苷的C谱图。

具体实施方式

实施例1(迷迭香酸苷化合物制备及结构鉴定)

1、制备迷迭香酸苷化合物

(1)取肿节风药材的干燥粉10kg(40-60目)，用蒸馏水提取2次，合并提取液，弃药渣，加入乙醇沉淀，收集上清液；

(2)将所收集的上清液以水稀释至生药浓度为0.5-1g/ml溶液，上清洗至中性的大孔树脂D101，分别用1.5倍树脂床体积的20％乙醇，2倍树脂床体积的30％乙醇洗脱，收集2倍树脂床体积的30％乙醇洗脱液，加入乙醇使乙醇浓度达80％，静置过夜，取上清浓缩干燥，以60％甲醇复溶，上样于ODS柱，用甲醇梯度洗脱，收集40％甲醇洗脱液并浓缩得总迷迭香酸苷；其中，将大孔树脂D101清洗至中性的方法为：乙醇浸泡24小时后，用乙醇清洗树脂，洗至流出液与水1：5不浑浊为止，然后用去离子水洗至没有明显醇味。之后用5％HCl清洗树脂并浸泡4h，用去离子水洗至洗脱液为中性，后用2％NaOH洗脱树脂柱，并浸泡4h，最后水洗至中性；

(3)将总迷迭香酸苷经硅胶柱(100-200目)层析分离，分别以甲醇体积浓度为20％、30％和40％的乙酸-水洗脱，每个比例2个柱体积；合并甲醇体积浓度为30％的乙酸-水的层析组分，60℃减压浓缩至干，得到棕黄色针状晶体；其中所述的乙酸-水中乙酸的体积含量为0.05％。

2、化合物的结构鉴定

用质谱仪检测上述方法得到的棕黄色针状晶体，得到如下数据和图谱：

HR-ESI-MS m/z 521.12885[M-H]^-(理论值为C₂₄H₂₅O₁₃,521.13006).¹H-NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ:7.06(1H,s,H-2'),6.76(1H,d,J＝7.5Hz,H-5'),6.98(1H,d,J＝8.0,H-6'),7.42(1H,d,J＝16.0Hz,H-7'),6.22(1H,d,J＝16.0Hz,H-8'),6.51(1H,d,J＝7.5Hz,H-6),6.68(1H,br s,H-2),6.62(1H,d,J＝8.0,H-5),2.77(1H,m,H-7a),3.00(1H,m,H-7b),4.87(1H,d,J＝7.5Hz,H-8).¹³C-NMR(125MHz,DMSO-d₆)δ:125.9(C-1),115.4(C-2),144.3(C-3),145.4(C-4),115.9(C-5),120.4(C-6),37.0(C-7),74.6(C-8),172.2(C-9),128.9(C-1'),114.4(C-2'),145.7(C-3'),146.2(C-4'),116.3(C-5'),121.8(C-6'),149.1(C-7'),117.1(C-8'),166.5(C-9')。

其中，质谱、H谱和C依次见图14～16。

将上述质谱数据与李先霞等报导的化合物迷迭香酸-4-O-β-D-葡萄糖苷(李先霞，黄明菊，李妍岚，等.肿节风中抗氧化活性成分研究[J].中国药物化学杂志，2010，20(1)：57-60.)的数据基本一致，因此确定上述分离方法得到的棕黄色针状晶体为化合物迷迭香酸-4-O-β-D-葡萄糖苷(简称：迷迭香酸苷)，其化学结构如背景技术中的(Ⅰ)式所示。

实施例2(药效实验)

1、迷迭香酸苷对A549细胞毒性

常规复苏细胞后，待细胞生长够实验数目用Trypsin常规消化，用培养基调整细胞浓度为1.0×10⁵个/mL，以0.1mL/孔接种于96孔细胞培养板中。待细胞生长至紧密单层后，弃上清液加入用DMEM基础培养基稀释的各浓度药物0.1mL。取实施例1所制备的化合物按照3倍梯度稀释，6个梯度，每个梯度接种3个复孔，设置正常对照组和磷酸奥司他韦组，继续培养48h。终止实验后，以CPE观察法判断待测样品对细胞的毒性作用，以CCK8试剂盒检测细胞存活率，结果分别见表1，表2及图1。

表1迷迭香酸苷对A549细胞毒性作用(CPE观察法)

细胞出现病变按照以下5级标准记录：“－”为细胞生长正常，无病变出现；“±”为细胞病变少于整个单层细胞的10％；“+”为细胞病变约占整个单层细胞的25％；“++”为细胞病变约占整个单层细胞的50％；“+++”为细胞病变约占整个单层细胞的75％；“++++”为细胞病变约占整个单层细胞的75％以上。

表2迷迭香酸苷对A549细胞毒性作用(CCK8法)

2、迷迭香酸苷对MDCK细胞毒性

常规复苏细胞后，待细胞生长够实验数目用Trypsin常规消化，用培养基调整细胞浓度为1.0×10⁵个/mL，以0.1mL/孔接种于96孔细胞培养板中。待细胞生长至紧密单层后，弃上清液加入用DMEM基础培养基稀释的各浓度药物0.1mL。取实施例1所制备的化合物按照3倍梯度稀释，6个梯度，每个梯度接种3个复孔，设置正常对照组和磷酸奥司他韦组，继续培养48h。终止实验后，以CPE观察法判断待测样品对细胞的毒性作用，以CCK8试剂盒检测细胞存活率，结果分别见表3，表4及图2。

表3迷迭香酸苷对MDCK细胞毒性作用(CPE观察法)

表4迷迭香酸苷对MDCK细胞毒性作用(CCK8法)

3、迷迭香酸苷在A549细胞中对H1N1亚型流感病毒感染细胞的保护作用

常规复苏细胞后，待细胞生长够实验数目用Trypsin常规消化，用培养基调整细胞浓度为1.0×10⁵个/mL，以0.1mL/孔接种于96孔细胞培养板中。待细胞生长至紧密单层后，同时攻击50TCID₅₀病毒悬液0.1mL，于35℃吸附2h后，弃上清。加入用DMEM基础培养基稀释的各浓度药物0.1mL。取实施例1所制备的化合物按照2倍梯度稀释，10个梯度，每个梯度接种3个复孔，设置正常对照组和磷酸奥司他韦(75mg/粒，罗氏公司，生产批号：B3017)组，重新加入相应浓度的含药培养基继续培养48h。终止实验后，以CCK8试剂盒检测细胞存活率，以流感病毒表面蛋白检测试剂(NA)检测病毒含量，计算待测样品对病毒的抑制作用。结果分边见表5，表6及图3，图4。

表5迷迭香酸苷在A549细胞中对H1N1亚型流感病毒抑制作用(NA试剂盒法)

表6迷迭香酸苷在A549细胞中对H1N1亚型流感病毒感染细胞的保护作用(CCK8试剂盒法)

4、迷迭香酸苷在A549细胞中对H9N2亚型流感病毒增殖的抑制作用

常规复苏细胞后，待细胞生长够实验数目用Trypsin常规消化，用培养基调整细胞浓度为1.0×10⁵个/mL，以0.1mL/孔接种于96孔细胞培养板中。待细胞生长至紧密单层后，同时攻击50TCID₅₀病毒悬液0.1mL，于35℃吸附2h后，弃上清。加入用DMEM基础培养基稀释的各浓度药物0.1mL。取实施例1所制备的化合物按照2倍梯度稀释，10个梯度，每个梯度接种3个复孔，设置正常对照组和磷酸奥司他韦(75mg/粒，罗氏公司，生产批号：B3017)组，重新加入相应浓度的含药培养基继续培养48h。终止实验后，以CCK8试剂盒检测细胞存活率，以流感病毒表面蛋白检测试剂(NA)检测病毒含量，计算待测样品对病毒的抑制作用。结果分边见表7，表8及图5，图6。

表7迷迭香酸苷在A549细胞中对H9N2亚型流感病毒抑制作用(NA试剂盒法)

表8迷迭香酸苷在A549细胞中对H9N2亚型流感病毒感染细胞的保护作用(CCK8试剂盒法)

5、迷迭香酸苷在MDCK细胞中对H1N1亚型流感病毒增殖的抑制作用

常规复苏细胞后，待细胞生长够实验数目用Trypsin常规消化，用培养基调整细胞浓度为1.0×10⁵个/mL，以0.1mL/孔接种于96孔细胞培养板中。待细胞生长至紧密单层后，同时攻击50TCID₅₀病毒悬液0.1mL，于35℃吸附2h后，弃上清。加入用DMEM基础培养基稀释的各浓度药物0.1mL。取实施例1所制备的化合物按照2倍梯度稀释，10个梯度，每个梯度接种3个复孔，设置正常对照组和磷酸奥司他韦(75mg/粒，罗氏公司，生产批号：B3017)组，重新加入相应浓度的含药培养基继续培养48h。终止实验后，以CCK8试剂盒检测细胞存活率，以流感病毒表面蛋白检测试剂(NA)检测病毒含量，计算待测样品对病毒的抑制作用。结果分边见表9，表10及图7，图8。

表9迷迭香酸苷在MDCK细胞中对H1N1亚型流感病毒抑制作用(NA试剂盒法)

表10迷迭香酸苷在MDCK细胞中对H1N1亚型流感病毒感染细胞的保护作用(CCK8试剂盒法)

研究结果表明迷迭香酸苷对H1N1亚型及H9N2亚型流感病毒均具有抑制作用，且在不同细胞对流感病毒具有抑制作用，抑制作用随迷迭香酸苷浓度的增加而增强。

6、迷迭香酸苷对鸡胚毒性作用

取实施例1所制备的化合物加入无菌生理盐水配制成浓度为10mg/ml的药液，再用无菌生理盐水作10倍梯度稀释(10⁰～10^-3)，分别接种于10日龄SPF鸡胚，每个浓度接种4枚鸡胚，0.1ml/胚，对照组注射等体积生理盐水。蜡封后置恒温孵化箱中37℃继续孵育96h，每24h检胚1次，记录鸡胚死亡情况以及鸡胚生长发育情况。24h内死亡鸡胚弃除不计于药物毒性作用的致死数。以鸡胚可正常发育96h且无病变产生的最大浓度确定为抗病毒口服液的最大给药剂量(Cmax)，用于抗病毒药效实验。

表11迷迭香酸苷对鸡胚毒性试验

实验结果显示无鸡胚出现死亡，说明该浓度药物对鸡胚无毒性作用，可作为本实验用最高无毒浓度。

7、迷迭香酸苷对感染H1N1亚型流感病毒鸡胚保护作用

取100EID50的病毒液0.1ml与倍比稀释的迷迭香酸苷溶液0.1ml在微量离心管中混合均匀，取混合液0.2ml于尿囊腔接种10日龄SPF级鸡胚，每个浓度接种4枚鸡胚。同时用生理盐水0.1ml与流感病毒液0.1ml混合，作为病毒对照组。鸡胚接种完后，置37℃恒温孵育箱中孵育48h。每日照蛋，弃去24h内死亡鸡胚，24h以后死胚及48h后存活鸡胚均置4℃冰箱保存，测定尿囊液血凝效价，并观察胚体病理变化。记录鸡胚死死数及尿囊液血凝滴度，结果见表12,13。

表12迷迭香酸苷在鸡胚水平对H1N1亚型流感病毒抑制作用

表13迷迭香酸苷对H1N1亚型流感病毒感染鸡胚尿囊液血凝滴度影响

表13中“—”表示无血凝现象

收集各药物组鸡胚尿囊液，进行凝血试验，结果显示，病毒对照组血凝效价为1:2^-6，迷迭香酸苷各剂量组及利巴韦林对照组鸡胚尿囊液与正常对照孔现象现象一致，均未出现血凝现象，说明迷迭香酸苷可有效抑制H1N1亚型流感病毒在鸡胚扩增。

8、迷迭香酸苷对感染H1N1亚型流感病毒小鼠肺组织炎症的抑制作用

称取取实施例1所制备的化合物，用生理盐水溶解，制成注射制剂；阳性药利巴韦林注射液(100mg/mL，辰欣药业股份有限公司生产，生产批号：1502246441)，给药体积均为0.1ml/10g。13-15g KM小鼠50只，雌雄各半，分成5组，每组10只，分别为溶剂对照组(不含药物，含相同剂量的生理盐水)，病毒感染对照组，利巴韦林对照组，50mg/kg迷迭香酸苷腹腔注射组及20mg/kg迷迭香酸苷腹腔注射组。除溶剂对照组外，其他四组滴鼻感染2倍半数致死量(LD50)的H1N1亚型流感病毒。每天给药一次，感染后2h开始给药，连续给药6天，至第6天处死小鼠，解剖，取肺组织，称体重，肺重，显微观察肺组织切片。肺指数结果见表14，肺组织切片见图9-13，从表14和图9-13可以看出，迷迭香酸苷对流感病毒诱导的肺部炎症具有显著抑制作用。

表14迷迭香酸苷对病毒感染小鼠肺指数影响

表14中肺指数(％)＝小鼠全肺重(g)/小鼠体重(g)×100％；“#”表示和正常组相比，有显著性差异，p<0.05；“##”表示与正常组相比有极显著性差异，p<0.01；“*”表示和模型组相比，有显著性差异，p<0.05；“**”表示和模型组相比，有极显著性差异，p<0.01。

9、迷迭香酸苷对感染H1N1亚型流感病毒小鼠肺组织病毒增殖的抑制作用

称取取实施例1所制备的化合物，用生理盐水溶解，制成注射制剂；阳性药利巴韦林注射液(100mg/mL，辰欣药业股份有限公司生产，生产批号：1502246441)，给药体积均为0.1ml/10g。13-15g KM小鼠50只，雌雄各半，分成5组，每组10只，分别为溶剂对照组(不含药物，含相同剂量的生理盐水)，病毒感染对照组，利巴韦林对照组，50mg/kg迷迭香酸苷腹腔注射组及20mg/kg迷迭香酸苷腹腔注射组。除溶剂对照组外，其他四组滴鼻感染2倍半数致死量(LD50)的H1N1亚型流感病毒。每天给药一次，感染后2h开始给药，连续给药6天，末次给药后30min，处死小鼠，解剖，取出肺组织。取小鼠左肺肺组织样本(25mg)，用RT-PCR测定肺组织中病毒含量。计算病毒拷贝数见表15，实验结果说明，迷迭香酸苷能抑制病毒在小鼠肺中的扩增，有抑制病毒复制的功效。

表15肺组织中病毒拷贝数对数

表15中“*”表示和模型组相比，有显著性差异，p<0.05；“**”表示和模型组相比，有极显著性差异，p<0.01。

实施例3(注射剂)

1、处方：

迷迭香酸苷1000g，注射用水20L。

2、制备方法：

取迷迭香酸苷，加注射用水，搅拌使全溶，用G4垂熔漏斗抽滤至澄明。灌封、灭菌、灯检、包装，即成100mg/2ml的迷迭香酸苷注射液。

3、用法和用量：

每次2.0ml肌肉注射、静脉注射或静脉点滴，每天1-2次，5天一疗程。

实施例4(颗粒剂)

1、处方：

迷迭香酸苷100g，100g蔗糖，100g糊精，淀粉适量。

2、制备方法：

取迷迭香酸苷超微粉碎后加入蔗糖、糊精以及适量淀粉，制成颗粒，干燥、制粒，制成1000g，分装成1g每包。

3、用法和用量：

每次1-2包，口服，每天1-2次，7天为一疗程。

实施例5(胶囊剂)

1、处方：

迷迭香酸苷100g，淀粉888g,硬脂酸镁12g。

2、制备方法：

取迷迭香酸苷超微粉碎后用递加稀释法逐次加入已混匀的淀粉(过120目筛)及硬脂酸镁(过60目筛)，再经过100目筛充分混匀。调整装入量(使每粒胶囊含迷迭香酸苷100mg)装入空心胶囊，套合，封口，包装。

3、用法和用量：

每次2-4粒，口服，每天2-3次，7天为一疗程。

实施例6(片剂)

1、处方：

迷迭香酸苷100g，淀粉100g，滑石粉适量。

2、制备方法：

取迷迭香酸苷超微粉碎后加入淀粉，混合均匀，加滑石粉适量，压制成1000片。

3、用法和用量：

每次2-4片，口服，每天2-3次，7天为一疗程。

Claims

1.迷迭香酸-4-O-β-D-葡萄糖苷在制备预治流感药物的应用；其中，所述的流感为H1N1亚型或H9N2亚型流感病毒感染引起的流感。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的迷迭香酸-4-O-β-D-葡萄糖苷由以下方法制得：

3.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述的药物由迷迭香酸-4-O-β-D-葡萄糖苷和医学上可接受的辅料组成，其中所述的迷迭香酸-4-O-β-D-葡萄糖苷在药物中的质量百分含量为5％～10％。

4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的药物为注射液、片剂、胶囊或颗粒剂。