CN101596246B - 乌梅提取物和酸枣仁提取物复方制剂及其制备方法和应用 - Google Patents
乌梅提取物和酸枣仁提取物复方制剂及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种乌梅提取物和酸枣仁提取物的复方制剂，其含有如下重量份的组分：乌梅醇提物49-90份、酸枣仁醇提物9-50份、薄荷脑0.2-4.5份。上述乌梅提取物和酸枣仁提取物的复方制剂，是通过对乌梅和酸枣仁分别用70％-75％酒精经过适当的提取过程得到的提取物浸膏，与常规的辅料或载体，按照常规的制剂方法制备成的可溶性粉剂、颗粒剂、口服液、注射剂或冻干粉针剂。该复方制剂可应用于制备预防和治疗畜禽病毒病或细菌病的药物中，具有疗效好、见效快、安全性高、无残留、绿色环保等特点。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体的说，涉及乌梅提取物和酸枣仁提取物及复方制剂的制备方法和应用。
背景技术
进入21世纪以来，畜禽重大疫病在全球不断爆发，不仅严重地阻碍了畜牧业的健康发展，也引起了一系列的公共卫生突发事件，先后发生禽流感、猪链球菌病、口蹄疫等重大疫情，给人民健康、社会安定造成了极大的危害。因此，研究和创制生物兽药新产品，已成为保障我国畜牧业发展、维护人民的健康和生命安全、保持社会稳定和促进经济发展的重大需求。
乌梅(Fructus Mume)是由蔷薇科植物梅Prunus mume(Sieb.)Sieb.et Zucc.干燥未成熟果实加工而成。别名有梅实、熏梅、桔梅肉。全国各地都有栽培，主要产于我国四川、浙江、福建、湖南、贵州。该植物味酸、性涩、平，具有敛肺止咳、涩肠止泻、固崩止血、生津止渴、安蛔等功效。主要用于治疗久咳、虚热烦渴、久疟、久泻，痢疾、尿血、血崩、钩虫病等。体外筛选发现乌梅对多种致病菌有抑制作用，如痢疾杆菌、大肠杆菌、伤寒、副伤寒杆菌、百日咳杆菌、脑膜炎双球菌。也有报道对结核杆菌有抑制作用，还对某些致病性真菌有抑制作用，但没有应用于动物和人的疗效报道。乌梅的水提取液、醇提取液对肿瘤细胞有一定的抑制生长效应，且呈量效关系。目前乌梅主要用于治疗蛔虫和消化不良等效果较好。目前未见有关乌梅用于抗畜禽病毒或抗细菌性疾病的报道或专利。
酸枣仁为鼠李科植物酸枣Ziziphus jujuba Mill.var.spionA(Bunge)HuexH.F.Chou的干燥成熟种仁，主要分布于西北、东北、华北许多省区及南方的一些地区。化学研究表明，酸枣仁含有黄酮苷、三萜皂苷及有机酸等多种成分，其中三萜皂苷为主要的有效成分之一。现代药理实验证实，酸枣仁皂苷具有明显的免疫调节和抗组胺释放的活性。酸枣仁目前主要应用于镇静和催眠作用以及抗惊厥作用，同时用于血管保护及免疫增强。
国内已有关于用含有酸枣仁的中药组方治疗病毒性心肌炎、病毒性乙型肝炎的文献和专利，国外有关于酸枣树皮、叶片提取物或酸枣果实可抗真菌和病毒的文献报道，其中所述的酸枣仁提取物多是通过水或醇提取而得到的，其有效成分中主要含有酸枣仁皂苷，其黄酮类物质的比例小，均未见有在70％-75％乙醇基础上通过正丁醇萃取所得的提取物作为药物抗禽疱疹病毒、传染性法氏囊病毒药物或作为抗家禽大肠杆菌、鸡支原体的文献报道或专利。
中草药是我国医药学的宝贵遗产，具有天然性、多效性、毒副作用小、不易产生有害残留和耐药性等优点，广泛应用于兽医临床。对中草药进行深层次开发，特别是针对中药添加剂的研制开发正成为动物保健品行业的一个重要方向。如80年代美国开始从植物青蒿中提取青蒿素，随后实现化学合成和商品销售。荷兰从植物提取的牛蛭油，具有防治家禽大肠杆菌病、慢性呼吸道疾病和真菌病功效，已在中国注册销售。我国近年来也从植物中成功提取了广谱抗生素-大蒜挥发油有效部位群DADS/DATS的二次开发以及二类新兽药“茜草素”，然后用化学方法合成了有效成分“六茜素”，并研制出第二代六茜素，成功的应用于兽医临床。当前我们应充分利用我国丰富的中草药资源，针对目前畜禽疾病特点尤其是流行病和传染病，利用中兽药的理论和经验，结合现代医药的分析技术、合成技术和制备技术，研制安全、有效、质量可控的抗菌、抗虫和抗病毒的绿色安全型新兽药，提高我国兽药在国际上的竞争力。
开发天然中草药预防畜禽疾病是国家中兽药创新体系的组成部分，符合高效、毒性小、副作用少的国家产业结构调整方向，顺应绿色、环保的基本生产要求，产品的推广和应用可以解决抗生素药物残留、部分替代抗菌素，控制畜禽重大疫病流行和发生，提高我国畜禽产品出口的竞争力。
我们前期研究显示中药乌梅提取物具有抗菌、抗病毒活性成分，酸枣仁具有提高机体非特异性免疫功能，乌梅、酸枣仁配伍成复方将在提高免疫力，增强机体抵御外邪入侵防病治病中表现更加确实的功效，实验室验证也证实该复方具有良好的抗病毒、细菌性疾病活性。
发明内容
本发明目的是提供一种乌梅提取物和酸枣仁提取物的复方制剂。
本发明另一个目的是提供上述复方制剂的制备方法。
本发明的第三个目的是提供上述复方制剂的应用。
本发明提供的乌梅提取物和酸枣仁提取物的复方制剂，其含有如下重量份的组分：乌梅醇提物49-90份、酸枣仁醇提物9-50份、薄荷脑0.2-4.5份。
其中，所述乌梅醇提物通过如下方法制备：取乌梅，每次按体积重量比mL/g加入乌梅4倍-8倍量的70％-75％乙醇，浸泡提取2次-4次，每次1h-4h，煮沸2h-4h，取提取液抽滤，合并滤液减压浓缩，制得乌梅提取物浸膏。
所述酸枣仁醇提物通过如下方法制备：取酸枣仁粉碎过筛，脱脂，每次按体积重量比mL/g加入酸枣仁4倍-8倍量的70％-75％乙醇，浸泡提取3次-7次，每次1h-4h，除去酒精后，按体积重量比mL/g，加入酸枣仁3倍-6倍量的水搅拌均匀，再用酸枣仁2倍-6倍量的水饱和正丁醇萃取4次-6次，浓缩、风干，制得酸枣仁提取物浸膏。
本发明的乌梅酸枣仁复方制剂的有效成分为酸枣仁皂苷A，柠檬酸、黄酮类。其中，酸枣仁提取物中酸枣仁皂苷A的含量为3.45mg/g-18.24mg/g，黄酮类物质的含量为0.471mg/g-0.573mg/g；乌梅提取物中柠檬酸的含量为100-300mg/g、黄酮类物质为2.0-5.2mg/g。
上述所述复方制剂是将酸枣仁提取物、乌梅提取物与常规的辅料或载体，按照常规的制剂方法制备成可溶性粉剂、颗粒剂、口服液、注射剂或冻干粉针剂。其中优选口服液和颗粒剂。
本发明还提供了乌梅提取物和酸枣仁提取物的复方制剂的制备方法，其包括如下步骤：
1、乌梅提取物的制备：取乌梅，每次按体积重量比mL/g加入乌梅4倍-8倍量的70％-75％乙醇，浸泡提取2次-4次，每次1h-4h，煮沸2h-4h，取提取液抽滤，合并滤液减压浓缩，制得到乌梅提取物浸膏。
2、酸枣仁提取物的制备：取酸枣仁粉碎过筛，脱脂，每次按体积重量比mL/g加入酸枣仁4倍-8倍量的70％-75％乙醇，浸泡提取3次-7次，每次1h-4h，除去酒精后，按体积重量比mL/g，加入酸枣仁3倍-6倍量的水搅拌均匀，再用酸枣仁2倍-6倍量的水饱和正丁醇萃取4次-6次，浓缩、风干，制得酸枣仁提取物浸膏。
3、按重量份，取步骤1的乌梅提取物浸膏49-90份，步骤2的酸枣仁提取物浸膏9-50份，薄荷脑0.2-4.5份，混合，加入适当的辅料，制备成各种剂型。
其中，步骤2中所述脱脂是按体积重量比mL/g，加入酸枣仁2倍-8倍量的石油醚，浸泡脱脂5次-8次，每次3h-7h，脱脂完全后挥干石油醚。
上述乌梅提取物和酸枣仁提取物的复方制剂可应用于制备预防和治疗畜禽病毒病或细菌病药物中。其中，畜禽病毒包括禽流感病毒、法氏囊病毒和禽疱疹病毒。细菌包括鸡毒支原体和鸡大肠杆菌。禽流感病毒为H9亚型禽流感病毒；法氏囊病毒为BC-6/85型毒株；禽疱疹病毒为血清II型禽疱疹病毒。
所述的组合物为将酸枣仁提取物和酸枣仁提取物与常规的辅料或载体，按照常规的制剂方法制备成为可溶性粉剂、颗粒剂、口服液、注射剂或冻干粉针剂。其中优选口服液和颗粒制剂。上述复方制剂按照每天200mg/kg-500mg/kg体重的方式对家禽施药，连续4-5天口服或拌料给予。
本发明的乌梅提取物和酸枣仁提取物的复方制剂可以广泛用于养殖业，替代部分抗病毒药物，弥补我国目前疫苗预防效果不良造成的损失，替代抗菌素防治畜禽耐药细菌病，以控制传染病的流行和解决食品中抗菌素残留问题，从而保证食品安全，提高动物产品出口的竞争力。
使用本发明提供的方法，采用70％-75％乙醇提取酸枣仁获得的主要成分是酸枣仁皂苷A和黄酮类物质，黄酮类物质的含量高达0.573mg/g，酸枣仁皂苷A的含量高达18.24mg/g。酸枣仁皂苷具有明显的免疫调节和抗组胺释放的活性。酸枣仁目前主要应用于镇静和催眠作用以及抗惊厥作用，同时用于血管保护及免疫增强作用。黄酮类物质具有降血压、抗凝血、降血糖、抗炎、抗菌、抗病毒和抗肿瘤等生理功能。通过酸枣仁皂苷的免疫增强作用，提高机体的非特异性免疫，从而提高机体抗病能力；同时通过黄酮物质增强机体的抗炎能力，增强机体对炎症的主动修复能力。故可以通过这两种物质同时增强机体的非特异性免疫来增强机体抗病能力。
使用本发明的方法，采用70％-75％乙醇提取乌梅获得的主要成分是有机酸。有研究表明乌梅中的有机酸能降低日粮的pH值，提高酶的活性，改善胃肠道微生物区系，直接参与体内代谢，提高营养物质消化率，促进矿物质和维生素的吸收等功效。乌梅提取物中有机酸，以柠檬酸含量最高，柠檬酸直接参与机体能量、结构和酶促反应，是三羧酸循环中不可缺少的组分，是易于利用的能源，此外其具有杀菌、抑菌、防止饲料霉变的作用，可添加在饲料或饮水中发挥作用，广泛应用于猪、鸡的饲料中，牛、鱼的饲料中也有越来越多的研究应用。随着抗生素的禁用，有机酸替代抗生素，与一些抗生素产生协同作用从而将细菌抗药性的危险降低到最低限度的效用得到人们的重视。
本发明研究人员，通过了大量的实验室和临床验证，复方制剂的有效成分酸枣仁皂苷A；柠檬酸具有广谱抗细菌活性，有效防治畜禽支原体病、禽大肠杆菌病。同时，具有防治鸡法氏囊病、禽流感(H9亚型)，禽疱疹病毒病(新亚型)，表明复方乌梅酸枣仁制剂可以代替抗菌素和金刚烷胺、病毒唑防治家禽顽固性呼吸道疾病和病毒性疾病，从而有效提高家禽的成活率。
所述酸枣仁提取物中酸枣仁皂苷A的含量为3.45mg/g-18.24mg/g，黄酮类物质的含量为0.471mg/g-0.573mg/g；所述乌梅提取物中柠檬酸的含量为100-300mg/g、黄酮类物质为2.0-5.2mg/g。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。
实施例1酸枣仁提取物的制备
将酸枣仁(购自河北省安国市昌达药饮品有限公司)100g粉碎后过10目筛，筛过物加入酸枣仁6倍量(mL/g)石油醚浸泡脱脂6h，脱脂6次，脱脂完全后挥干石油醚。然后向药渣中每次加入酸枣仁6倍量(mL/g)的75％酒精浸泡提取，每次浸泡4h，连续提取4次，把所得提取物除去酒精后加入酸枣仁3倍量(mL/g)的水搅拌混匀，然后加入酸枣仁4倍量(mL/g)的水饱和正丁醇连续萃取4次，并浓缩，制得5g酸枣仁提取物浸膏，提取率为5％。
实施例2乌梅提取物的制备
取4Kg乌梅(购自河北省安国市昌达药饮品有限公司)，每次加入乌梅4倍量(mL/g)75％乙醇，浸泡提取2次，每次8小时，将提取液连同乌梅一并倒入三口烧瓶中，置于电子调温电热套上，煮沸1小时，取提取液抽滤，合并滤液减压浓缩，制得到乌梅提取物浸膏。
实施例3复方乌梅酸枣仁口服液的制备
取实施例1的酸枣仁提取物浸膏2g、实施例2的乌梅提取物浸膏18g，分别置于100mL的容量瓶中，分别用20mL75％酒精溶解，加入0.1g薄荷脑(购河北安国市长安中药材有限公司)，再加入80％的1，2-丙二醇定容至刻度，制备的药物中每毫升含生药为200mg。其中含乌梅浸膏为180mg；酸枣仁浸膏20mg；酸枣仁皂苷A含量为0.07mg/mL；柠檬酸含量为为0.13mg/mL。
复方为深褐色液体，pH值1.5-2.0，相对密度为1.06。
实施例4复方乌梅酸枣仁口服液的制备
取实施例1的酸枣仁提取物浸膏4g、实施例2的乌梅提取物浸膏16g，分别置于100mL的容量瓶中，分别用20mL75％酒精溶解，加入0.5g薄荷脑，再加入100％的1，2-丙二醇定容至刻度。药物由乌梅及酸枣仁提取物浸膏按照重量比8∶2配伍，药物浓度为每毫升含乌梅浸膏为160mg/mL；酸枣仁浸膏40mg/mL；酸枣仁皂苷A含量为0.13mg/mL；柠檬酸含量0.12mg/mL。
复方为深褐色液体，pH值不低于1.5-2.0，相对密度为1.07。
实施例5复方乌梅酸枣仁口服液的制备
取实施例1的酸枣仁提取物浸膏6g、实施例2的乌梅提取物浸膏14g，分别置于100mL的容量瓶中，分别用20mL75％酒精溶解，加入0.5g薄荷脑，再加入100％的1，2-丙二醇定容至刻度。药物由乌梅及酸枣仁提取物浸膏按照重量比7∶3配伍，药物浓度为200mg/mL。其中含乌梅浸膏为140mg/mL；酸枣仁浸膏60mg/mL；酸枣仁皂苷A含量为0.19mg/mL；柠檬酸含量为0.10mg/mL。
复方为深褐色液体，pH值1.5-2.0，相对密度为1.06。
实施例6复方乌梅酸枣仁口服液的制备
取实施例1的酸枣仁提取物浸膏10g、实施例2的乌梅提取物浸膏10g，分别置于100mL的容量瓶中，分别用20mL75％酒精溶解，加入0.5g薄荷脑，再加入100％的1，2-丙二醇定容至刻度。药物由乌梅及酸枣仁提取物浸膏按照重量比5∶5配伍，药物浓度为200mg/mL。其中含乌梅浸膏为100mg/mL；酸枣仁浸膏100mg/mL；酸枣仁皂苷A含量为0.34mg/mL；柠檬酸含量为0.08mg/mL。
复方为深褐色液体，pH为1.5-2.0，相对密度为1.07。
实施例7复方乌梅酸枣仁口服液的制备
取实施例1的酸枣仁提取物浸膏2g、实施例2的乌梅提取物浸膏18g，分别置于100mL的容量瓶中，分别用20mL75％酒精溶解，加入0.1g薄荷脑，后加入80％的1，2-丙二醇定容至刻度，制备的药物中每毫升含生药为200mg。其中含乌梅浸膏为180mg；酸枣仁浸膏20mg；酸枣仁皂苷A含量为0.07mg/mL；柠檬酸含量为0.13mg/mL。
复方为深褐色液体，pH为1.5-2.0，相对密度为1.07。
实施例8复方乌梅酸枣仁口服液的制备
取实施例1的酸枣仁提取物浸膏10g、实施例2的乌梅提取物浸膏10g，分别置于100mL的容量瓶中，分别用20mL75％酒精溶解，加入0.1g薄荷脑，再加入100％的1，2-丙二醇定容至刻度，制备的药物中每毫升含生药为200mg。其中乌梅浸膏含量为100mg/mL；酸枣仁浸膏100mg/mL；含酸枣仁皂苷A0.33mg/mL；柠檬酸含量为0.08mg/mL。
复方为深褐色液体，pH为1.5-2.0，相对密度为1.07。
实施例9复方乌梅酸枣仁口服液的制备
取实施例1的酸枣仁提取物浸膏2g、实施例2的乌梅提取物浸膏18g，分别置于100mL的容量瓶中，分别用20mL75％酒精溶解，加入0.5g薄荷脑，后加入80％的1，2-丙二醇定容至刻度，制备的药物中每毫升含生药为200mg。其中含乌梅浸膏为180mg；酸枣仁浸膏20mg；含酸枣仁皂苷A 0.07mg/mL；柠檬酸含量为0.13mg/mL。
实施例10复方乌梅酸枣仁颗粒的制备
将实施例1的酸枣仁提取物浸膏2.5g、实施例2的乌梅提取物浸膏22.5g、糊精50g、蔗糖25g充分混合，制备粒材、干燥、整粒，在整粒过程中喷入薄荷脑酒精溶液1mL，80℃烘干颗粒，将整粒后的颗粒置二维混合机中，混合20分钟，制成颗粒100g。
实施例11复方乌梅酸枣仁可溶性粉的制备
将实施例1的酸枣仁提取物浸膏10g、实施例2的乌梅提取物浸膏90g充分混合，真空浓缩、过滤、烘干，烘干后喷入薄荷脑酒精溶液1mL，之后进行粉碎，将粉碎后的可溶性粉置二维混合机中，混合20分钟，制成可溶性粉100g。
实验例1复方口服液中酸枣仁皂苷A的定性与定量检测
定性实验：
取实施例3的复方乌梅-酸枣仁口服液10mL于分液漏斗中，加入10mL石油醚(60℃-90℃)萃取三次，合并上清液。下层液体加入100mL的水饱和正丁醇溶液使之溶解，再加入50mL的正丁醇饱和氨水试液(浓氨水∶水＝2∶3，然后加入正丁醇饱和)，连续洗涤八次，每次取上层液。然后用旋转蒸发仪蒸干，用5mL甲醇溶解，作为供试品溶液。
以甲醇为溶剂，配制浓度1mg/mL的酸枣仁皂苷A溶液，作为对照品溶液。
照薄层色谱法(《中国药典》2005版一部)试验，吸取供试品溶液和空白对照液(甲醇)各10μL，对照品溶液5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以水饱和的正丁醇溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1％的香草醛硫酸溶液，立即检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显示相同颜色的斑点。
定量实验：
取甲醇，用0.45μm的微孔滤膜滤过，取滤液10μl用HPLC进样分析，作为空白对照。
精密称取酸枣仁皂苷A标准品2.20mg置于10mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，精密量取0.5mL、1mL、1.5mL、2mL、2.5mL置10mL容量瓶中，甲醇定容，制得浓度分别为0.11mg/mL、0.22mg/mL、0.33mg/mL、0.44mg/mL、0.55mg/mL的溶液，用0.45μm的微孔滤膜滤过，取滤液10μl用HPLC进样分析，测得峰面积分别为385497、792403、1168834、1510826、1976460，以峰面积为横坐标X、浓度为纵坐标Y，制得酸枣仁皂苷A的标准曲线为Y＝2.825681e-007X，R2＝0.997873。
取上述薄层色谱实验中的供试品溶液，用0.45μm的微孔滤膜滤过，取滤液10μl用HPLC进样分析，测得供试品溶液中酸枣仁皂苷A的峰面积为1391979，通过上述酸枣仁皂苷A的标准曲线，求得供试品溶液中的酸枣仁皂苷A的浓度为0.39333mg/mL。
在酸枣仁皂苷A的定量实验中，利用岛津高效液相色谱仪，SHIMADZU LC-20AT液相色谱系统；二极管阵列SPD-M20A检测器色谱工作站；
色谱柱：Shim-pack VP-ODS C18(4.6×150mm，5μm)；
流动相：甲醇∶水＝57∶43
流速：0.8mL/min
检测波长：200nm
柱温：25℃
按酸枣仁皂苷A峰计算理论塔板应不低于2000。
实验例2复方口服液中柠檬酸的定性与定量
定性实验：
取实施例3的复方乌梅酸枣仁口服液1mL于10mL容量瓶中，用超纯水定容至10mL。吸取1mL于10mL容量瓶中，再用超纯水定容至10mL，超声20min后，用0.45μm的微孔滤膜滤过后，备用，作为供试品溶液。
取柠檬酸标准品，以超纯水为溶剂，配制成浓度1mg/mL的柠檬酸溶液，作为对照品溶液。
照薄层色谱法(《中国药典》2005版一部附录VI B)试验，吸取供试品溶液和对照品溶液各10μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷∶乙酸乙酯∶乙醚∶甲酸6∶5∶2∶2.5的混合溶剂为展开剂，展开，取出，晾干，喷以0.04％溴酚蓝醇溶液，柠檬酸为黄色斑点，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
定量实验：
取超纯水，用0.45μm的微孔滤膜滤过，取滤液10μl用HPLC进样分析，作为空白对照。
精密称取柠檬酸标准品109.375mg置于25mL容量瓶中，加流动相(KH2PO4∶甲醇＝93∶7)溶解并定容，精密量取0.5mL、1mL、2mL、4mL、6mL置10mL容量瓶中，流动相(KH2PO4∶甲醇＝93∶7)定容，制得浓度分别为0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.8mg/mL、1.6mg/mL、2.4mg/mL的溶液，用0.45μm的微孔滤膜滤过，取滤液10μl用HPLC进样分析，测得峰面积分别为215365、442711、881188、1705902、2594900，以峰面积为横坐标X、浓度为纵坐标Y，制得柠檬酸的标准曲线为Y＝9.268309e-007X，R2＝0.9997960。
上述薄层色谱实验中的供试品溶液，用0.45μm的微孔滤膜滤过，取滤液10μl用HPLC进样分析，测得供试品溶液中柠檬酸的峰面积为1406717，通过上述柠檬酸的标准曲线，求得供试品溶液中柠檬酸的浓度为1.30379mg/mL。
在柠檬酸的定量实验中，利用岛津高效液相色谱仪，SHIMADZULC-20AT液相色谱系统；二极管阵列SPD-M20A检测器色谱工作站；
色谱柱：Shim-pack VP-ODS C18(4.6×150mm，5μm)；
流动相：KH2PO4∶甲醇＝93∶7
流速：0.6mL/min
检测波长：200nm
柱温：26℃
按柠檬酸峰计算理论塔板应不低于2000。
实验例3复方乌梅酸枣仁口服液对禽大肠杆菌体外抑菌作用试验
使用灭菌生理盐水将实施例3的复方乌梅酸枣仁口服液4mL稀释成浓度100mg/mL的药液备用。
最小抑菌浓度(MIC)测定：通过试管倍比稀释法确定复方乌梅酸枣仁口服液对肉鸡大肠杆菌分离株最小抑菌浓度(MIC)，取10支灭菌试管，编号为1#、2#、3#、4#、5#、6#、7#、8#、细菌对照和肉汤对照。于10支试管中各加入灭菌肉汤1mL。于1#试管中加入灭菌药液1mL，混匀后，取1mL放至2#试管中，依次倍比稀释，至8#试管，弃去1mL，对照管不加药液。除肉汤对照外，其余各管均加入大肠杆菌1mL。将试管放入37℃恒温摇床上培养24h，第2天观察结果。为消除药物本身的影响，将不能完全确定的试管液体转接于营养琼脂平板培养基上，37℃培养24h。次日观察平皿中有无细菌生长。将该试验重复3次，结果均为12.5mg/mL。因此，复方乌梅酸枣仁口服液对禽大肠杆菌的最小抑浓度为12.5mg/mL，为研究复方乌梅酸枣仁抗菌活性，进一步以体内试验验证。
实验例4复方乌梅酸枣仁口服液对鸡大肠杆菌病的治疗试验
将20日龄海兰褐鸡随机分为6组，分别为实施例3复方乌梅酸枣仁口服液高(400mg/kg)、中(200mg/kg)、低(100mg/kg)剂量组。利好组(作为阳性对照组，20％复方磺胺间甲氧嘧啶钠可溶性粉，四川拜耳动物保健有限公司生产，批号2008102409)、感染对照组(感染不给药)，空白对照组(不感染，不给药)，每组15只。腹腔注射大肠杆菌临床分离株(半数致死量为8×108CFU)，0.5mL/只，攻毒后立即给药，按下表2所示口服灌胃。连续给药7天，分上、下午两次给药。停药观察3天后剖检。
表2试验分组及给药情况
观察指标：
死亡率：凡在试验期间，出现大肠杆菌病症状并死亡，剖检后气囊、肝脏、心脏有典型病变特征，病料能分离出大肠杆菌的，判断为感染死亡，计算死亡率。
相对增重率：根据试验开始及结束时每只鸡的体重，计算增重及每组鸡的平均增重，并以空白对照组增重为100％，各组增重与之相比得到各组相对增重率，实验结果如表3所示。
大肠杆菌检出率：实验结束后剖检存活鸡，观察心包炎、肝周炎等情况，并取肝脏，无菌取材后分离培养细菌，统计肝脏大肠杆菌检出率情况，实验结果如表4所示。
表3对肉鸡生产性能的影响
相对增重率：根据试验开始及结束时每只鸡的体重，计算增重及每组鸡的平均增重，并以空白对照组增重为100％，各组增重与之相比得到各组相对增重率。
由表3可见，高、中、低剂量组相对增重率分别为17.8％、17.3％和14.2％，利好对照组为41.0％。
表4剖检存活鸡肝脏大肠杆菌检出率情况
由表4可见，人工感染大肠杆菌7天后，阴性对照组存活率25.0％，复方乌梅酸枣仁高剂量组存活率为87.5％，利好对照组存活率达到62.5％。在肝脏大肠杆菌检出率方面：复方乌梅酸枣仁口服液高、中、低剂量组，分别为80.0％，90.0％和100.0％。而利好对照组大肠杆菌检出出率为100.0％。可见，复方乌梅酸枣仁口服液能降低禽大肠杆菌引起的死亡率、降低肝脏细菌检出率，这显示了一定的疗效，可以部分替代抗菌素治疗大肠杆菌。
实验例5复方乌梅酸枣仁口服制剂防治家禽法氏囊病感染试验
25日龄SPF雏公鸡由北京市实验动物中心提供，随机平均分为6组，分别是按照实施例3复方乌梅酸枣仁口服液高(400mg/kg)、中(200mg/kg)、低(100mg/kg)剂量组，实施例8复方乌梅酸枣仁口服液(400mg/kg)组，卵黄抗体组(作为阳性对照组，洛阳普莱柯生物工程有限公司生产，批号080324)，感染对照组(感染，不给药)和空白对照组(不感染，不给药)，每组20只。人工感染IBDVBC-6/85.IBDV原种毒按10-2稀释，每只雏鸡点眼共0.2ml。出现临床症状后开始用实施例3的复方乌梅酸枣仁口服液，连续使用五天，试验期间，每天观察试验鸡的精神、食欲、活动及粪便情况，并做好记录，在试验开始和结束时，将试验鸡逐只称重，计算相对增重率。给药结束2天后剖检，并逐个观察法氏囊的病变与肌肉出血情况，并根据病变与出血程度进行评分，并计算分值。剖检重点观察法氏囊的病变情况，是否肿大或萎缩、出血、表面是否有胶冻样渗出物。观察胸肌和腿肌病变指数是否出血、出血程度，测定病变指数，给药方式如表5所示，实验结果如表6、7所示。
表5试验分组及药物用量情况
表6复方治疗法氏囊感染体重变化情况
注：相对增重率＝(试验组后体重-试验前体重)/空白对照组试验前后体重差×100％
表7酸枣仁口服液治疗法氏囊试验结果
注：法氏囊病变指数：严重出血4分；中度3分；轻度1分；胸肌和腿肌病变指数：严重出血3分/侧，中度出血2分/侧，轻度出血1分/侧；病变指数减少率＝(感染对照组病变指数-试验组病变指数)/感染对照组病变指数
本次试验选用的毒株为IBDV BC-6/85，人工感染后，测试药物组、卵黄抗体组及感染对照组的雏鸡出现症状，表现缩颈、闭眼、呆立不动、拉白色稀便。于攻毒后72h几乎100％发病。虽未发生死亡，但剖检可见法氏囊出血，有奶油样或干酷样物。腿部肌肉及胸肌呈条索状或斑点状出血。肾苍白种大、有尿酸盐沉积。攻毒对照组的鸡，法氏囊明显萎缩。有的法氏囊有出尿血斑，严重者外观象紫葡萄状。测试药物组感染法氏囊病毒后增重率依次为76.9％、95.7％、87.4％、69.7％，均比感染对照组(65.3％)高，其中实施例3中剂量组与阳性对照组(95.4％)相当。
综上所述，本发明的实施例3的复方乌梅酸枣仁口服液能降低法氏囊病变指数，与感染对照组相比有助于增重，表现一定疗效，有潜在的应用前景。
实验例6复方乌梅酸枣仁体外抑制鸡毒支原体试验
将实施例3制得的复方乌梅酸枣仁口服液，用灭菌生理盐水稀释成100mg/mL的溶液。取24h能在培养基中达到对数生长期的鸡毒支原体培养物做适当稀释，使浓度达到1×105cfu/mL作为本试验用菌液。取22支无菌试管，各管加入KM2培养基0.5mL。取0.5mL浓度为100mg/mL的复方乌梅酸枣仁溶液加入第2管，按2倍稀释法依次稀释至第13管，即第2-13管酸枣仁提取物浓度分别为：50mg/mL、25mg/mL、12.5mg/mL、6.25mg/mL、3.125mg/mL、1.56mg/mL、0.78mg/mL、0.39mg/mL、0.195mg/mL、0.098mg/mL、0.049mg/mL、0.025mg/mL。取0.5mL的1.6mg/mL的磷酸泰乐菌素溶液加入第14管，然后按2倍稀释法依次稀释至第21管，即第14-21管的磷酸泰乐菌素的浓度为：0.8、0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625mg/mL，然后在第1-21管中各加入0.5mL菌液及第22管中加入KM2培养基0.5mL，37℃培养。第1管为正常对照组，第22管为阴性对照组，把第14-21管作为磷酸泰乐菌素对照；重复3次。当正常对照组发生颜色改变(即培养液中酚红指示剂由红色变为橘黄色)且无混浊时，加药组不再出现颜色变化的最小药物浓度为最小有效抑制M P生长浓度(MIC)。结果如下表8所示。
表8复方乌梅酸枣仁体外对鸡毒支原体S6株MIC测定结果
敏感度标准：MIC≤7.81g/L为较高敏感；7.81＜MIC≤250g/L为中度敏感；MIC＞250g/L为不敏感
由表8可见，复方口服液和磷酸泰乐菌素体外对支原体的MIC分别为：6.25mg/mL和0.025mg/mL，其对支原体的抑菌效果与磷酸泰乐菌素对支原体的抑菌效果属于统一敏感度的，均属于高度敏感。
实验结果显示：复方乌梅酸枣仁口服液具有较好的体外抑制鸡毒支原体的作用。
实验例7复方乌梅酸枣仁口服液治疗肉鸡鸡毒支原体病试验
1、实验方法：1d AA肉鸡用于本试验，正常饲养条件下饲养，7日龄时攻毒鸡毒支原体S6株，使用24h能在液体培养基中达到对数生长高峰期(测定培养物含菌浓度约为108CCU/mL)的3代MG S6株培养物，经点眼、滴鼻和气囊注射接种于7日龄健康的AA型肉鸡，0.5mL/只，接种出现病症后，各组鸡分别按表9所示给药，分上午、下午两次给药，连续5d，停药后继续观察35d，在实验过程中，随时记录各组鸡的临床表现与发病、死亡情况；对病死鸡进行剖检，观察其病理变化，取鼻、气管分泌物、肺和气囊等组织进行MG分离培养，同时进行血清平板凝集试验以确定死亡原因；对未死亡鸡采血，分离血清，用平板凝集试验检测抗鸡毒支原体抗体。
2、疗效评价指标
(1)感染前、用药结束后(约第八天)分别进行外周淋巴细胞增殖实验和白细胞计数、分类，获得抗病可能的机理；
(2)血中抗体水平检测：试验结束时，每组随机抽检10只，测定血液中鸡毒支原体抗体反应情况。根据抗体反应阳性数计算每组鸡的抗体阳性反应率。
(3)平均增重：根据试验初和试验结束时各组鸡的体重，计算每组试验鸡的平均增重。
(4)气囊损伤减少率：试验结束时，各组随机抽取鸡5只，剖检观察气囊、肺、肝、心等主要器官病理变化，并对气囊的损伤程度进行分级评分。
按H.W.Yoder将气囊病理损伤划分5级。
0级：气囊正常，薄而透明，记0分。
1级：气囊仅有稍增厚的灰色区或黄色渗出斑点，记2分。
2级：部分气囊易见到灰色至黄色渗出，有时出现泡沫，气囊增厚，记4分。
3级：大部分气囊增厚，布满大量黄白色干酪样渗出物，记6分。
4级：几乎整个气囊布满黄白色干酪样渗出物，气囊严重增厚，记8分。
鸡气囊平均病理损伤计分＝所有鸡气囊损伤度总和/被检鸡数。
根据气囊损伤记分结果计算气囊损伤减少百分率。
气囊损伤减少百分率＝(感染对照组每只鸡气囊损伤平均分-试验组每只鸡气囊损伤平均分)/感染对照组每只鸡气囊损伤平均分。
表9治疗试验分组及处理
3、实验结果
(1)肉鸡生产性能的实验结果如表10所示。
表10对肉鸡生产性能的影响
由表10可见，复方药物组和泰乐菌素组病鸡完全成活，而复方低剂量组发病率为33.3％，低于感染对照组(36.4％)。测试复方药物组平均增重值均高于感染对照组，高、中剂量组甚至优于泰乐菌素组。
(2)鸡气囊损伤程度比较结果如表11所示。
表11各组鸡气囊损伤程度比较结果
注：气囊损伤分＝(胸气囊损伤分+腹腔气囊损伤分)/剖检鸡只数量；气囊损失减少率＝感染对照组-试验组气囊损伤积分/感染对照组气囊损伤积分
结果显示，复方药物三个剂量组气囊损伤计分明显低于感染对照组，高剂量组效果最佳(气囊平均损伤积分0.30，气囊损伤减少率91.96％)。
(3)试验鸡毒支原体阳性率的实验结果如下表12所示。
表12试验鸡毒支原体阳性率
结果显示，低剂量组、中剂量组使用后能有效降低血清的阳性率。而阳性对照组仍保持较高的阳性率。
(4)白细胞总数及分类计数结果，如表13所示。
表13白细胞总数及分类计数(第35d)
结果显示，中性粒细胞、单核细胞具有游走性和吞噬作用，除吞噬细胞和异物外，又能吞噬原虫及具有类脂质包膜的结核杆菌及麻风杆菌。用药组的嗜中性白细胞和单核细胞比感染对照组和健康对照组升高，预示着药物有提高机体非特异性免疫的功能。
综合所述，测试复方药物组与泰乐菌素阳性对照组相比，都明显提高感染鸡只的增重；复方药物组低、中、高三个剂量组气囊损伤减少率分别为74.53％，89.29％，91.96％，泰乐菌素对照组为71.58％，复方高、中剂量组比泰乐菌素阳性对照组气囊损伤轻；抗体水平检测发现，感染后21d，抗体检测阳性率都为100％，表明鸡毒支原体感染21d后发病模型成功，而感染后第28天，三组测试药物抗体阳性率分别为91.7％、70％、70％，泰乐菌素组为80％，感染对照组为100％，抗体阳性率降低预示着药物有助于提高机体免疫力、消除病原微生物感染功效。以上结果显示测试药物可以显著减低鸡毒支原体感染引起的发病率，中、高剂量组还可以增加肉鸡的体重。本产品用于出口商品肉鸡饲养的后期是该产品最大的优势，按照每天250～500mg/kg体重的方式对家禽施药，连续4-5d混饮或拌料给予，可实现部分替代抗菌素，减少药物的残留。
实验例8复方乌梅酸枣仁口服液治疗临床鸡毒支原体、禽流感(H9亚型)混合感染疗效观察
一、实验动物及实验分组情况：
1.1动物：14dAA肉鸡，饲养在地面铺有稻壳垫料上，按照常规肉鸡饲养标准进行。
1.2毒株：禽流感H9N2亚型用前使用鸡胚复壮，测定病毒对SPF鸡胚半数感染量分别为108.8ELD50/0.2mL。
1.3菌株：鸡毒支原体S6株，使用24h能在液体培养基中达到对数生长高峰期(测定培养物含菌浓度约为108CCU/mL)的3代MGS6株培养物。
1.4疾病模型复制：14d经点眼、滴鼻和气囊注射接种鸡毒支原体S6株，0.8mL/只，接种后14d出现半数病症后，实验组和感染对照组通过鼻腔分别接种100倍的108.8ELD50/0.2mL的禽流感H9N2病毒。
1.5给药方式：感染禽流感H9N2病毒48h后，分别给予实施例3的复方乌梅酸枣仁口服液(含薄荷脑)、乌梅酸枣仁口服液(不含薄荷脑)，同时以黄芪多糖为阳性对照组，连续给药5d。以感染未用药为感染对照组。分组及用药方法如下表14所示。
表14实验分组及给药剂量
二、试验方法及观察指标
药物饮水连用5d。空白对照组给予正常饮水。每天观察受试动物的精神、采食、饮水、粪便、呼吸情况和死亡情况，并记录。用药完毕后再观察5d，并做如下疗效指标评价：
2.1死亡率根据死亡鸡数计算死亡率。
2.2相对增重率：根据试验开始及结束时每只鸡的体重，计算增重及每组鸡的平均增重，并以不用药对照组增重为100％，各组增重与之相比得到各组相对增重率。
三、试验结果
从鸡群精神状况指标看，复方乌梅酸枣仁口服液组效果最好，该组鸡用药3d后，采食量增加，精神明显好转，其次为乌梅酸枣仁口服液组，以上两个用药组鸡群精神状况整体较黄芪多糖大群对照组好，但依然存在流泪、呼吸困难等症状。
表15试验期间发病率、增重率情况
相对增重率：根据试验开始及结束时每只鸡的体重，计算增重及每组鸡的平均增重，并以空白对照组增重为100％，各组增重与之相比得到各组相对增重率。
试验各组增重及死亡情况如表15所示：黄芪多糖对照组相对增重率为50.5％，复方乌梅酸枣仁组相对增重率最高，达到54.9％，并且没有死鸡现象，乌梅酸枣仁口服液组相对增重率为48.4％，死亡率为5.5％，黄芪多糖对照死亡率为12％，感染对照组死亡率高达33.3％。
试验结束后对存活的试验鸡进行剖检，发现黄芪多糖大群对照组病鸡气管出血严重，存在较多黄色粘液，有的甚至形成黄色干络样堵塞物；肺脏出血严重(约占4/5面积)，边缘有轻微渗出，肾脏明显肿胀；复方乌梅酸枣仁组、乌梅酸枣仁口服液组，两个受试药物组鸡气管出血症状都较黄芪多糖大群对照组轻，但依然存在较多黄色粘液，肺脏边缘有轻微渗，肾脏轻微肿胀。
综上可知，复方乌梅酸枣仁在治疗因人工感染鸡毒支原体、禽流感(H9亚型)等引起的呼吸道病上能有助于肉鸡增重，降低死亡率，表现较好疗效，有良好的应用价值。
实验例9复方乌梅酸枣仁口服液临床新型鸡疱疹病毒感染疗效观察
一、实验动物及实验分组情况：
1.1动物模型：临床15d蛋雏鸡，经过腹腔攻毒新型家禽疱疹病毒0.3mL/只(10-3.5EID50)。其特征性的病变为：咳嗽、精神不振、顽固性的呼吸道病和特征性黄色腹泻。
1.2药物分组：见表15。试验采用腹腔攻毒后5d，出现50％的发病后，在饮水给药，连续使用5d，分组及用药方法如下表15所示。
表15实验分组与剂量
二、观察指标
连续用药5d后再观察10d，评价指标如下：
死亡率根据死亡鸡数计算死亡率。
相对增重率：根据试验开始及结束时每只鸡的体重，计算增重及每组鸡的平均增重，并以不用药对照组增重为100％，各组增重与之相比得到各组相对增重率。
三、试验结果
复方乌梅酸枣仁口服液治疗效果如表16所示。
表16复方乌梅酸枣仁口服液治疗效果
相对增重率：根据试验开始及结束时每只鸡的体重，计算增重及每组鸡的平均增重，并以空白对照组增重为100％，各组增重与之相比得到各组相对增重率。
由表16可得出如下结论：
1、在临床症状的治愈上，复方乌梅酸枣仁口服液缓解禽疱疹病毒引起的呼吸道症状呈剂量-效应关系，口服5d后，能有效缓解呼吸困难，提高感染鸡只的采食量。
2、在成活率方面，复方乌梅酸枣仁口服液高、中、低剂量组分别为86.0％，80.0％和86.0％，而黄芪多糖对照组为53.3％。结果显示复方乌梅酸枣仁口服液对家禽新型疱疹病毒的治疗效果高于黄芪多糖对照组。
3、在相对增重率方面，复方乌梅酸枣仁口服液高、中、低剂量组分别为93.6％，85.5％和89.7％，黄芪多糖对照组为62.4％。
综合临床症状、成活率、相对增重率三个方面的测试治疗，显示复方乌梅酸枣仁口服液对新流行的家禽新型疱疹病毒病具有治疗价值。
Claims (6)
1.一种乌梅提取物和酸枣仁提取物的复方制剂，其特征在于，其活性组分为：乌梅醇提物49-90份、酸枣仁醇提物9-50份、薄荷脑0.2-4.5份；
所述乌梅醇提物通过如下方法制备：取乌梅，每次按体积重量比mL/g加入乌梅4倍-8倍量的70％-75％乙醇，浸泡提取2次-4次，每次1h-4h，煮沸2h-4h，取提取液抽滤，合并滤液减压浓缩，制得到乌梅提取物浸膏；
所述酸枣仁醇提物通过如下方法制备：取酸枣仁粉碎过筛，脱脂，每次按体积重量比mL/g加入酸枣仁4倍-8倍量的70％-75％乙醇，浸泡提取3次-7次，每次1h-4h，除去酒精后，按体积重量比mL/g，加入酸枣仁3倍-6倍量的水搅拌均匀，再用酸枣仁2倍-6倍量的水饱和正丁醇萃取4次-6次，浓缩、风干，制得酸枣仁提取物浸膏。
2.如权利要求1所述的复方制剂，其特征在于，所述复方制剂的剂型为可溶性粉剂、颗粒剂或口服液。
3.一种权利要求1或2所述的复方制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)乌梅醇提物的制备：取乌梅，每次按体积重量比mL/g加入乌梅4倍-8倍量的70％-75％乙醇，浸泡提取2次-4次，每次1h-4h，煮沸2h-4h，取提取液抽滤，合并滤液减压浓缩，制得到乌梅提取物浸膏；
(2)酸枣仁醇提物的制备：取酸枣仁粉碎过筛，脱脂，每次按体积重量比mL/g加入酸枣仁4倍-8倍量的70％-75％乙醇，浸泡提取3次-7次，每次1h-4h，除去酒精后，按体积重量比mL/g，加入酸枣仁3倍-6倍量的水搅拌均匀，再用酸枣仁2倍-6倍量的水饱和正丁醇萃取4次-6次，浓缩、风干，制得酸枣仁提取物浸膏；
(3)按重量份，取步骤(1)的乌梅提取物浸膏49-90份，步骤(2)的酸枣仁提取物浸膏9-50份，薄荷脑0.2-4.5份，混合，加入适当的辅料，制备成各种剂型。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述脱脂是按体积重量比mL/g，加入酸枣仁2倍-8倍量的石油醚，浸泡脱脂5次-8次，每次3h-7h，脱脂完全后挥干石油醚。
5.权利要求1或2所述的复方制剂在制备预防和治疗畜禽病毒病或细菌病药物中的应用，其特征在于，所述的畜禽病毒为禽流感病毒、法氏囊病毒和禽疱疹病毒；所述细菌为鸡毒支原体和鸡大肠杆菌。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述禽流感病毒为H9亚型禽流感病毒；所述法氏囊病毒为IBDV BC-6/85型毒株；所述禽疱疹病毒为禽疱疹病毒血清II型。
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