CN103860616B - 刺五加提取物及其制备与应用 - Google Patents

Abstract

本发明关于一种刺五加提取物，其中多糖含量为50wt%~80wt%。本发明还提供一种从刺五加中提取有效成分的方法、从提取有效成分筛选在免疫增强方面具有良好效果的刺五加多糖，以及刺五加多糖颗粒剂的制备。用本发明公开的刺五加提取物可应用于预防和治疗禽畜传染性法氏囊病毒、传染性支气管炎病毒，还可以提高禽畜生长性能。在药理评价方面表现的突出免疫作用特点，本发明的刺五加提取物应用于制备在兽医临床上广泛使用的药物，具有广阔的市场前景和价值。

Description

刺五加提取物及其制备与应用

技术领域

本发明属于中药提取及应用技术领域，具体地说涉及从刺五加中提取有效组分多糖及其应用于相关药品领域。

背景技术

鉴于日前国内外迫切要求解决滥用抗生素、化学药物和激素类药品带来的肉、蛋和奶畜产品中药物残留、耐药性及毒副作用等问题，当前在现代畜禽养殖中，世界范围内兴起了一股回归自然的热潮，人们崇尚自然，重视生态安全与食品安全，国内外形成了食用产品要求“高品质、低药物残留、绿色无公害”这一消费潮流。

而中药免疫增强剂是一类十分重要的免疫活性物质，不仅具有调节淋巴细胞、吞噬细胞、白细胞介素、抗体水平等重要功能，而且相对于化学药物免疫增强剂而言，无毒副作用，无残留污染，并且其资源丰富、作用广泛、标本兼治、不易产生耐药性等特点，近年来得到越来越多的研究和推广。中药免疫增强剂在提高细胞免疫功能治疗人与动物的肿瘤、免疫抑制性传染病、寄生虫病方面有很好的研究价值和开发前景。

近年来，对中草药免疫增强剂的有效成分和作用机理进行了许多研究，已发现的免疫活性有效成分主要有多糖类、苷类、生物碱、有机酸、萜类及醇类等成分。实验证实黄芪多糖，人参皂苷，大蒜素，甘草酸等有显著增强机体免疫功能的作用，同时还可增强食欲、促进机体代谢、提高饲料利用率，增强养殖动物体质和生长发育，起到全方位提高机体免疫力和抗应激能力。

自20世纪60年代以来，国内外对传统中药刺五加的化学成分进行了大量研究，分离得到了大量有效成分。其中含有：刺五加苷（如刺五加皂苷、异秦皮定、紫丁香树脂等）、刺五加多糖(Acathopanax senticosus Polycharides,ASPS)、刺五加黄酮类物质，另外还含有挥发油、多种氨基酸及微量元素等丰富的活性物质，并验证了其良好的药理作用。刺五加中活性成分的良好药理活性引起人们更加重视对刺五加的研究。

中国专利CN1377574A公开了一种以刺五加根、茎为原料，经水提醇沉法得到刺五加提取物，在水产养殖中的应用。中国专利CN1449792A公开了一种在免疫调节、抗应激、抗衰老、解毒方面应用的由沙棘油与刺五加提取物组成的组合物，采用75%乙醇回流提取法制得，该专利中用醇提物与原生药的质量比进行定量分析。中国专利CN101559095A公开了一种具有免疫增强作用的刺五加和黄芪的兽药复方制剂，采用水提醇沉法制得每100g原生药材制得最终产品100g。现有技术虽有公开刺五加和其他药材组合，用做兽药复方制剂，但目前缺乏单独以刺五加提取物入药，用刺五加多糖作为指标成分控制产品质量，并进行相关药理活性实验的数据，例如用刺五加多糖作为有效成分的免疫增强剂尤其在防治禽畜病毒感染性疾病和提高禽畜生长性能方面未见报道。传统的水提醇沉法制备刺五加多糖，虽然操作工艺简单，但是产品中杂质较多，多糖含量较低。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种刺五加提取物，其特征在于，该提取物中多糖含量为50wt%~80wt%，优选为70wt%~80wt%，更优选为75wt%~80wt%。

优选地，该刺五加提取物中还原糖含量为4wt%~9wt%。

优选地，该刺五加提取物不含单糖。

本发明还提供一种刺五加提取物的制备方法，其包括如下步骤：

A刺五加药材前处理：药材经粉碎后用易挥发有机溶剂超声提取至提取液无色，去除提取液，得经处理过的药材；

B刺五加多糖提取工艺：于上述经步骤A处理过的药材中加入化学助剂Na₂CO₃与Na₂B₄O₇的混合物，用0~80wt%乙醇提取，收集提取液；

C刺五加多糖分离工艺：取步骤B所得提取液，用盐酸调制pH为2.0~5.0，然后进行固液分离，收集液体；

D将步骤C所得液体进行浓缩、干燥，即得刺五加提取物。

进一步地，该制备方法还包括如下步骤：

E于上述步骤D所得刺五加提取物中加入乙醇含量为95wt%以上的乙醇溶液进行醇沉，然后进行固液分离，取沉淀，干燥，即得。优选95wt%～99wt%乙醇。

上述制备方法中，优选以刺五加茎皮作为原料。

优选地，所述易挥发有机溶剂为沸程为30～60℃的石油醚。粉碎目数为：5～100目，优选为5～10目；在所述步骤B的提取过程中优选使用搅拌辅助提取。

本发明还提供一种含有刺五加提取物的药用组合物，其包含所述刺五加提取物和药学上可接受的辅料或其它药物。

本发明还提供一种含有刺五加提取物的制剂，其由刺五加提取物和药学上可接受的辅料制成，所述制剂为散剂、丸剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、合剂、注射剂、滴丸剂、酒剂、酊剂、茶剂、鼻用制剂、凝胶剂、栓剂或气雾剂。

本发明提供一种刺五加提取物在制备防治禽畜病毒感染性疾病的药物中的应用。

所述病毒为传染性法氏囊病毒、传染性支气管炎病毒。

本发明还提供一种刺五加提取物在制备提高禽畜生长性能的产品中的应用。本发明产品不但可以提高产蛋率，并且加入刺五加提取物制备的颗粒后孵化率能够显著提高。

本发明还提供一种刺五加提取物在制备提高禽畜免疫力药物中的应用。

本发明的有益效果至少包括:

本发明的刺五加提取物制备方法中，根据被提取成分化学性质，利用了化学方法，有效地除去蛋白质、色素等杂质，方便的分离各个有效成分，并且提高刺五加多糖的含量。该方法流程简单，操作方便，环境污染少，适于工业化的生产工艺，实现了刺五加天然植物资源中有效成分的充分利用。

本发明提供的刺五加有效组分化学成分简单明确，在药理研究上更易于阐明其作用机制，在生产中更易于药物的质量控制。

本发明还提供一种具有免疫增强作用的兽用刺五加颗粒剂的制备，颗粒剂稳定性和安全性都很好，临床主要用于增强疫苗免疫效果、增强机体免疫力、抗应激的功效，用于治疗鸡及其他畜禽的各种免疫抑制性疾病，增强疫苗的免疫效果；治疗由运输、转群、气候突变等引起的免疫力低下，食欲下降等症。

具体实施方式

下列提供的实施例说明了本发明的具体实施方案，但本发明不限于下述实施例的范围。

实施例1

刺五加不同部位的黄酮、多糖提取：分别称取按照实施例2法处理过的刺五加叶，根/皮，茎/皮各100g，按照实施例3法分别提取，具体结果见下表。

样品部位	黄酮含量%	多糖含量%
			叶柄	6.13	2.91
根皮	20.19	4.10

茎皮

11.56

8.0

实施例2

刺五加茎皮前处理：称取刺五加茎皮，经粉碎，过5～10目筛，置于超声清洗器中或置于提取器中，用石油醚（30～60℃）提取至无色，倾掉石油醚，药材取出干燥，得到处理好的刺五加样品。60℃下干燥3h得处理后的刺五加药材(即粗粉刺五加药材)，备用。

实施例3

刺五加的活性成分总多糖的提取制备：取实施例2所制备的粗粉刺五加药材（5～10目）200g，与4%（占总物料干重）助剂(Na₂CO₃/Na₂B₄O₇，1:1,W/W)混合加入到提取罐中，加人50倍10000mL的15wt%乙醇水溶液，50～60℃搅拌1.5h，抽滤，得提取液，药渣重复提取2次，合并提取液，用稀盐酸调制pH为4.0，静置，离心沉淀，得刺五加药效成分之一黄酮。离心得到的上清液浓缩至1.0g生药/mL，加入3倍量的95wt%的乙醇醇沉，4℃静置过夜，高速低温离心分离（8000转/min,30min，4℃），得沉淀，真空干燥后即得刺五加提取物12.5g，总糖含量为80.0%，还原糖含量为：4.03%，总糖提取率为：5.00%。

实施例4

刺五加的活性成分总多糖的提取制备：取实施例2所制备的粗粉刺五加药材（5～10目）200g，与4%（占总物料干重）助剂(Na₂CO₃/Na₂B₄O₇，1:1,W/W)混合加入到提取罐中，加人50倍10000mL水，50～60℃搅拌1.5h，抽滤，得提取液，药渣重复提取2次，合并提取清液，用稀盐酸调制pH为4.0，静置，离心沉淀，得刺五加药效成分之一黄酮。离心得到的上清液喷雾干燥后即得刺五加多糖20.5g，总糖含量为75.1%，还原糖含量为8.96%，总糖提取率为：7.70%。

实施例5

刺五加的活性成分总多糖的提取制备：取实施例2所制备的粗粉刺五加药材（5～10目）200g，与4%（占总物料干重）助剂(Na₂CO₃/Na₂B₄O₇，1:1,W/W)混合加入到提取罐中，加人50倍10000mL15wt%乙醇水溶液，50～60℃搅拌1.5h，抽滤，得提取液，药渣重复提取2次，合并提取液，用稀盐酸调制pH为4.0，静置，离心沉淀，得刺五加药效成分之一黄酮。离心得到的上清液冷冻干燥后即得刺五加提取物22.5g，总糖含量为77.1%，还原糖含量为6.76%，总糖提取率为：8.67%。

实施例6

刺五加根皮前处理：称取刺五加根皮，经粉碎，过5～10目筛，置于超声清洗器中或置于提取器中，用石油醚（30～60℃）提取至无色，倾掉石油醚，药材取出干燥，得到处理好的刺五加样品。60℃下干燥3h得处理后的刺五加药材(即粗粉刺五加药材)，备用。

刺五加的活性成分总多糖的提取制备：取上述刺五加根皮制得的粗粉（5～10目）200g，与4%（占总物料干重）助剂(Na₂CO₃/Na₂B₄O₇，1:1,W/W)混合加入到提取罐中，加人50倍10000mL15wt%乙醇水溶液，50～60℃搅拌1.5h，抽滤，得提取液，药渣重复提取3次，合并提取液，用稀盐酸调制pH为4.0，静置，离心沉淀，得刺五加药效成分之一黄酮。离心得到的上清液浓缩至1.0g生药/mL，加入3倍量的99wt%的乙醇醇沉，4℃静置过夜，高速低温离心分离（8000转/min,30min，4℃），得沉淀，真空干燥后即得刺五加提取物18.5g，总糖含量为60.7%，还原糖含量为4.06%，总糖提取率为：5.61%。

对比例1（醇碱水提醇沉）

配制碱溶液：配制5wt%的稀乙醇，加碳酸钠调pH值在11～12得醇碱溶液。

取经粉碎的刺五加药材（5～10目）200g加入到3000mL圆底烧瓶中，加入2500mL醇碱溶液，浸泡24h，后油浴升温至90℃提取1.5h，离心倾出提取液，药渣重复提取两次。合并提取液，浓缩至约0.05g生药/mL，高速低温离心分离，然后对离心所得上清液浓缩至1.0g生药/mL，加入3倍量的95wt%的乙醇醇沉，4℃静置过夜，高速低温离心分离（8000转/min,30min，4℃），得沉淀，真空干燥后即得刺五加提取物11.2g，总糖含量为57%，还原糖含量为4.58%，总糖提取率为：3.19%。

对比例2（醇碱水提法）

配制碱溶液：配制5wt%的稀乙醇，加碳酸钠调pH值在11～12得醇碱溶液。

取经粉碎的刺五加药材（5～10目）200g加入到3000mL圆底烧瓶中，加入2500mL醇碱溶液，浸泡24h，后油浴升温至90℃提取1.5h，倾出提取液，药渣重复提取两次。合并提取液，浓缩至约0.05g生药/mL，高速低温离心分离，然后对离心所得上清液喷雾干燥后即得刺五加提取物16.3g，总糖含量为23.3%，还原糖含量为9.32%，总糖提取率为：1.89%。

对比例3（水提醇沉）

取经粉碎的刺五加药材（5～10目）100g，在2000mL水中，80℃恒温水浴锅中浸提8h，采用sevag法去蛋白，将提取液与等体积氯仿正丁醇混合液(体积比为4:1)振荡，放置过夜，去除上清液及在界面处的蛋白质，收集下层多糖液，用旋转蒸发仪减压浓缩至50mL，加入体积为2倍浓缩液体积的95wt%乙醇沉淀多糖，得到的分级多糖沉淀定容于250mL，采用苯酚硫酸法测定多糖的浓度，通过计算出多糖的总量得到刺五加多糖得率。总糖含量为47.36%，还原糖含量为：4.93%，总糖提取率为：0.54%。

实施例7

总多糖含量的测定

对照品溶液的制备取105℃干燥至恒重的无水葡萄糖0.25g，精密称定，置50ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，置50ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，备用。

供试品溶液的制备取刺五加多糖提取物0.5g，精密称定，置50ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，置50ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，备用。

测定法精密量取对照品溶液与供试品溶液各2ml，分别置25ml量瓶中，各加5%苯酚溶液1ml，硫酸5ml，摇匀，置水浴中加热15min，取出，冰水冷却5min，用水稀释至刻度，摇匀；另取水2.0ml，同上平行操作作为空白对照，照紫外-可见分光光度法（2010版兽药典附录26页），在490nm波长处测定吸收度，计算，即得。

本品以干燥品计算，含总多糖量以葡萄糖计，不少于55.0%。

实施例8

游离单糖的鉴别

取本品，加水制成每1ml含40mg的溶液，作为供试品溶液；另取葡萄糖对照品，加水制成每1ml含5mg的溶液，作为对照品溶液，照薄层色谱法（2010版兽药典附录32页）实验，吸取供试品溶液10μl，对照品溶液2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正丁醇-0.1mol/L磷酸二氢钠溶液-丙酮（4:1:5）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以a-萘酚试液，在100℃加热5分钟，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，不得显相同颜色的斑点。

实施例9

还原糖含量的测定

DNS试剂配制：将6.3克DNS和262ml 2mol/L氢氧化钠，加到500ml含有182克酒石酸钾钠的热水溶液中，再加上5克重苯酚和5克亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加水定容到1000ml，即制成3,5-二硝基水杨酸试剂，贮于棕色瓶中备用。

葡萄糖标准溶液：准确称取干燥至恒重的葡萄糖1g，加少量蒸馏水溶解后定容至250mL，使葡萄糖浓度为1mg/mL。

葡萄糖标准曲线的绘制：分别吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0mL葡萄糖于25mL量瓶中，用蒸馏水补加至2mL，再加入3,5-二硝基水杨酸溶液3mL，沸水显色5min，流水迅速冷却后用水定容至25mL，摇匀，在540nm波长处测定吸光值。以2.0ml蒸馏水代替葡萄糖标准溶液按同样显色方法操作为空白调零，在540nm处比色，以葡萄糖量（mg）为横坐标，以吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。

还原糖量的测定：吸取2mL样液（可稀释适当倍数），置于25mL容量瓶中，再加入3,5-二硝基水杨酸溶液3mL，沸水显色5min，然后以流水迅速冷却，用水定容至25mL，摇匀。以试剂空白调零，在540nm处比色，参照葡萄糖标准曲线求出还原糖的量。

计算出样品管光密度值的平均值，在标准曲线上分别查出相应的还原糖毫克数，按下式计算出样品中还原糖和总糖的百分含量。

本品以干燥品计算，还原糖量不超过15.0%。

实施例10

刺五加颗粒剂的制备：取实施例3制备的刺五加提取物2.5g与0.25g微粉硅胶粉碎，混合均匀，加3mL无水乙醇拌料润湿，搅拌制成软材，用10目筛制粒，室温下真空下干燥，整粒，包装即得。

实施例11

刺五加颗粒剂的制备：取实施例4制备的刺五加提取物2.5g与0.25g无水硫酸镁粉碎，混合均匀，加3mL无水乙醇拌料润湿，搅拌制成软材，用10目筛制粒，室温下真空下充分干燥，整粒，包装即得。

实施例12

刺五加颗粒剂的制备：取实施例5制备的刺五加提取物2.5g与0.25g甘露醇粉碎，混合均匀，加3mL无水乙醇拌料润湿，搅拌制成软材，用10目筛制粒，室温下真空下充分干燥，整粒，包装即得。

实施例13

刺五加颗粒剂的制备：取对比例1制备的刺五加提取物2.5g与0.125g甘露醇、0.125g微粉硅胶粉碎，混合均匀，加3mL无水乙醇拌料润湿，搅拌制成软材，过10目筛制粒，室温下真空下充分干燥，整粒，包装即得。

实施例14

刺五加颗粒剂的制备：取对比例2制备的刺五加提取物2.5g、0.125g甘露醇、0.125g无水硫酸镁粉碎，混合均匀，加3mL无水乙醇拌料润湿，搅拌制成软材，过10目筛制粒，室温下真空下充分干燥，整粒，包装即得。

实施例15

刺五加颗粒剂的制备：取对比例3制备的刺五加提取物2.5g、0.25g甘露醇，粉碎，混合均匀，加3mL无水乙醇拌料润湿，搅拌制成软材，过10目筛制粒，室温下真空下充分干燥，整粒，包装即得。

实施例16

刺五加可溶性粉剂的制备：取实施例3制备的刺五加提取物2.5g、0.25g甘露醇粉碎，混合均匀加入到25mL水中，搅拌溶解，滤过，冷冻干燥，分装即得。

实施例17不同方法制备得的刺五加提取物的刺五加颗粒临床实验

为了观察不同制备方法得到的五加提取物对SPF鸡感染传染性法氏囊病病毒的抑制效果，本实验采用IBDV强毒株人工感染28日龄SPF鸡致其发病，于攻毒前后在其饮水中加入不同方法制备所得刺五加提取物及对照药物，观察该药物对SPF鸡感染传染性法氏囊病病毒的抑制效果。具体实验见下：

1.方法

1.1刺五加颗粒及毒株处理

刺五加颗粒制剂制备使用实施例3,4,5所得多糖为原料，按照实施例10、11、12制得刺五加颗粒。使用方法：0.2g溶解于1000mL水中混饮。

对照药物为对比例1、2、3所得的刺五加提取物，按照实施例13、14、15制得刺五加颗粒。使用方法：0.2g溶解于1000mL水中，混饮。

将IBDV强毒株：鸡传染性法氏囊病毒标准毒株J1C7株（保藏编号：CCVV AV6），毒价：2×10^5.0/0.1ml，购自中国兽医药品监察所，将原病毒进行10倍稀释，-20℃保存备用。

1.2实验动物分组与处理

将供试鸡(25日龄SPF鸡)随机分为9组，每组40只。自由采食与饮水。分组与给药情况（见表1）。

表1攻毒和给药方案

1.3观察指标

攻毒后第3d将各组实验鸡每组取5只剖杀，分别采集法氏囊观察病理变化，计算病变发生率。攻毒后第14d将所有实验鸡称重、剖杀，观察病理变化，分别采集法氏囊观察病理变化，计算病变发生率；将采集的法氏囊、脾脏、胸腺称重，计算法氏囊等免疫器官指数。同时分别计算各组产蛋率，进行对比。

2.结果

2.1发病情况、临床症状与病理变化

表2攻毒后第3d法氏囊眼观病理变化

攻毒3d后，分别观察各组鸡的状况：

健康对照组：精神、食欲均正常；预防组，精神、饮食欲基本正常；

药物对照组：对比例1得到的多糖组，有1只鸡精神沉郁、活动减少，饮食欲减损；对比例2、3得到的多糖组，有个别鸡粪便白色带血，精神、饮食欲基本正常；

实施例3、4、5得到的多糖组：精神、饮食欲均正常，无异常反应；

攻毒对照组：开始表现轻微临床症状，发现有相当一部分鸡粪呈白色、灰绿色或带血，有1只鸡死亡，死亡鸡剖检，法氏囊严重发黄、有胶冻样渗出物、剖开后内部呈豆腐渣样、有大量粘液和出血点。

2.2给药后病变情况

攻毒后第14d剖检病理变化

表3攻毒后第14d法氏囊眼观病理变化

攻毒14d后，分别观察各组鸡的状况：

健康对照组：精神、食欲均正常；预防组，精神、饮食欲基本正常；

药物对照组：对比例1得到的多糖组，有几只鸡精神沉郁、活动减少，饮食欲减损；对比例2、3得到的多糖组，有个别粪便白色带血，有多只鸡精神沉郁、活动减少，饮食欲减损；

实施例3、4、5得到的多糖组：精神、饮食欲均正常，无异常反应；

攻毒对照组：开始表现临床症状，发现大部分鸡粪呈白色、灰绿色或带血，有多只鸡死亡，死亡鸡剖检，法氏囊严重发黄、有胶冻样渗出物、剖开后内部呈豆腐渣样、有大量粘液和出血点。

2.3免疫器官指数

脾脏指数、胸腺指数计算方法同法氏囊指数（见表4）。

表4各实验组免疫器官指数差异性比较(±S)

注:aa表示与健康对照组之间比较P＜0.01,差异极显著；a表示与健康对照组之间比较P＜0.05,差异显著；

bb表示与攻毒对照组之间比较P＜0.01,差异极显著；b表示与攻毒对照组之间比较P＜0.05,差异显著。

法氏囊指数,实施例3，4，5得到的多糖与对比例1,2,3药物对照组得到的多糖之间比较P＜0.01，差异极显著；实施例3，4，5得到的多糖与预防组之间比较P＞0.05，无显著性差异；对比例1,2,3药物对照组得到的多糖之间比较P<0.05，有显著性差异。

脾脏指数,实施例3，4，5得到的多糖与对比例1,2,3药物对照组得到的多糖之间比较P＜0.01，差异极显著；实施例3，4，5得到的多糖与预防组之间比较P＞0.05，无显著性差异；对比例1,2,3药物对照组得到的多糖之间比较P<0.05，有显著性差异。

胸腺指数,实施例3，4，5得到的多糖与对比例1,2,3药物对照组得到的多糖之间比较P＜0.01，差异极显著；实施例3，4，5得到的多糖与预防组之间比较P＞0.05，无显著性差异；对比例1,2,3药物对照组得到的多糖之间比较P<0.05，有显著性差异。

从表中可以看出实施例3、4、5、对比例1和2均具有免疫增强作用，其中实施例3、4、5方法所得的产品的免疫增强作用比对比例1和2的强，实验表明本发明所保护的实施例3、4、5方法所得的产品相比现有技术所制得的产品具有更佳的免疫增强效果。

实施例17

为了观察不同制备方法得到的刺五加提取物对猪群免疫力及生产性能影响的效果，本实验在猪日粮中加入不同方法制备所得刺五加提取物及对照药物，观察该药物对实验组猪群的猪瘟抗体水平、日增重、死淘率、饲料报酬和经济效益。具体实验见下：

1材料和方法

1.1供试材料

刺五加提取物使用实施例3，4，5所得多糖原料。使用方法：按1.5%水平添加给药，对应分别记为；实验1组，实验2组，实验3组；

对照药物为对比例1，2，3所得刺五加提取物，使用方法：按1.5%水平添加给药，对应分别记为；对照1组，对照2组，对照3组；

供试猪及饲料由市场购买，猪瘟弱毒细胞苗及猪瘟血凝抗原、猪瘟标准阴性血清及稀释液等试剂均购自由购自中国兽医药品监察所。

1.2实验方法

选择胎次、体重相近，血缘相同的“杜长大”三元杂交商品代仔猪140头作为实验动物，按随机区组设计分为7个组，每组20头，其中3个实验组、3个药物对照组及1个空白对照组。

实验猪群日粮配方(%):玉米60、豆粕30、鱼粉3、麸皮4.2、骨粉1.5、食盐0.3、预混料1。

7组仔猪分圈饲养，专人负责饲养管理及观察记录。每日早上8:00、中午12:00、晚18:00和21:30饲喂4次，自由采食，自由饮水。舍内保持统一光照强度和光照时间。日清圈2次，保持猪舍干燥卫生、空气新鲜及适宜的环境温湿度。并按照常规的免疫程序接种疫苗，即20日龄用猪瘟弱毒疫苗首免，50日龄加强免疫1次。

3个实验组与3个对照组均分别按1.5%添加水平给药。具体方法是，在猪免疫接种前5d开始按上述要求剂量给药，连续给药10d为一个周期。在加强免疫前5d，再连续用药10d。空白对照组仅仅按照常规的免疫程序接种疫苗，即20日龄用猪瘟弱毒疫苗首免，50日龄加强免疫1次。

实验全期100d，其中预试期10d，正式实验期90d。观察记录项目有:①生产性能，主要包括日增重、饲料报酬(料重比)。②死淘率，主要包括实验组和对照组的猪群精神状态、食欲等临床观察及发病头数、死亡头数等指标。③猪瘟抗体水平，采用间接血凝反应法，在仔猪15日龄(免疫前),30日龄(免疫后),70日龄(二次免疫前)采血，进行猪瘟抗体水平检测。

2结果与分析

2.1猪瘟抗体水平

表1猪瘟抗体水平检测结果

由表1可以看出，6个组的母源抗体水平均在1:8～1:64之间，比较平稳。免疫后第一次检测(30日龄)，抗体水平呈上升趋势，实验1,2,3组及对照1组提高明显，抗体水平也较高，达到1:256以上，其中实验1,2,3组抗体水平整体提高明显，尤其实验1组达1:128的有6头，占到20%，效果最好。第二次检测(70日龄)，抗体水平又有不同程度的提高，实验组1,2,3抗体水平提高最明显，尤以实验1组提高明显，抗体水平1:128的有7头，占到该实验组头数的35%；大于1:256的有6头，占到30%；1:32以下者为零。而对照药物组，虽然抗体水平有所增加，但低于实验组，比空白对照组抗体水平有一定提高。说明本发明制得的刺五加提取物作为免疫增强剂对猪瘟抗体产生、免疫抗病能力的提高具有明显的促进作用。

2.2生产性能及死淘率

表2日增重、饲料报酬及死淘率比较

组别	实验头数(头)	存活头数(头)	始重(Kg)	末重(Kg)	增重(Kg)	日增重(g)	耗料(Kg)	料重比
									实验1组	20	20	1.21±0.31	39.1±1.62	37.89	421	76.50	2.02∶1
实验2组	20	19	1.19±0.34	35.9±1.41	34.47	386	72.88	2.10∶1
									实验3组	20	20	1.17±0.36	36.8±1.53	35.63	396	76.50	2.15∶1
对照1组	20	18	1.18±0.34	35.1±1.31	33.92	376	74.28	2.19∶1
									对照2组	20	17	1.20±0.34	37.9±1.42	36.7	407	79.64	2.17∶1
对照3组	20	17	1.21±0.34	35.9±1.51	34.69	385	76.32	2.20∶1
									空白对照组	20	17	1.32±0.34	30.3±1.58	29.01	322	65.63	2.26∶1

从表2可以看出，实验1,2,3组平均日增重为401g，对照1,2,3组平均日增重为389g，实验1,2,3组比对照1,2,3组提高12g，比空白对照组322g提高79g，明显实验1,2,3组增幅最大。其中实验1组提高幅度最大，日增重达到421g，比空白对照组提高99g。每公斤增重耗料实验1,2,3组分别为2.10,2.02和2.15kg，比空白对照组的饲料转化率分别提高7.08,10.62和4.80个百分点；每公斤增重耗料对照1,2,3组分别为2.19,2.17和2.20kg，比空白对照组的饲料转化率分别提高3.09,3.98和2.65个百分点，表明实验1,2,3组饲料转化率整体都高与对照1,2,3组。实验组死淘率平均比对照组降低。说明本发明制得的刺五加提取物在提高猪群的日增重速度、饲料转化率及仔猪成活率效果明显，对保证养猪业持续、稳定、高效发展具有十分重要的作用。

实验结果表明，实验组与对照组水平相互比较，实验组1,2,3的日增重、公斤增重耗料、猪瘟抗体水平趋势及经济效益等项指标均优于对照组1,2,3，说明本发明方法得到的刺五加提取物比对照组的在提高猪群的日增重速度、饲料转化率及仔猪成活率等方面的效果更好。

实施例18

为探讨本发明刺五加颗粒的临床作用，进行了刺五加颗粒的疫苗联用临床研究。结果表明能提高鸡传染性支气管炎血清抗体效价，增强其免疫保护作用，增强其抗应激能力。其效果优于常规方法得到刺五加多糖。具体实验见下：

1.实验方法

1.1实验药物

刺五加颗粒制剂制备使用实施例3,4,5所得多糖为原料，按实施例10、11、12制得刺五加颗粒。

对照药物为对比例1、2、3所得的刺五加提取物，按照按照实施例13、14、15制得刺五加颗粒。使用方法：0.2g溶解于1000mL水中，混饮。

鸡传染性支气管炎病毒：1BV-M41标准强毒，购于中国兽医药品监察所，复活后测得E₁D₅₀=1×10^6.7/0.1mL。

1.2实验分组

选择14日龄健康SPF鸡400只，实验随机分为8组，第1组为疫苗对照组，第2组为本发明实施例3实验组，第3组为实施例4实验组，第4组为实施例5实验组，第5组为对比例1实验组，第6组为对比例2实验组，第7组为对比例3实验组，第8组为攻毒对照组。

1组：疫苗对照组:鸡新城疫、传染性支气管炎二联灭活疫苗(La Sota株-M41株)（普莱柯生物工程股份有限公司生产，批号：（2012）160022124）

2组：实施例3供试药品组:1L水0.2g颗粒混饮+鸡新城疫、传染性支气管炎二联灭活疫苗(La Sota株-M41株)（来源、批号同上）;

3组：实施例4试药品组:1L水0.2g颗粒混饮+鸡新城疫、传染性支气管炎二联灭活疫苗(La Sota株-M41株)（来源、批号同上）;

4组：实施例5供试药品组:1L水0.2g颗粒混饮+鸡新城疫、传染性支气管炎二联灭活疫苗(La Sota株-M41株)（来源、批号同上）;

5组：对比例1对照药物组:1L水0.2g颗粒混饮+鸡新城疫、传染性支气管炎二联灭活疫苗(La Sota株-M41株)（来源、批号同上）;

6组：对比例2对照药物组:1L水0.2g颗粒混饮+鸡新城疫、传染性支气管炎二联灭活疫苗(La Sota株-M41株)（来源、批号同上）;

7组：对比例3对照药物组1.0L水0.2g混饮+鸡新城疫、传染性支气管炎二联灭活疫苗(La Sota株-M41株)（来源、批号同上）;

8组：攻毒实验对照组：不用药，不接种鸡新城疫、传染性支气管炎二联灭活疫苗(La Sota株-M41株)。

自由饮水，连续7天。除攻毒实验对照组外，对照组和实验组于用药第1d进行鸡新城疫、传染性支气管炎二联灭活疫苗(La Sota株-M41株)接种，每羽皮下注射0.3m1鸡新城疫、传染性支气管炎二联灭活疫苗(La Sota株-M41株)接种，接种16天后，分别随机选取实验组、免疫对照组、攻毒实验对照组鸡各50只，进行鸡传染性支气管炎病毒攻击保护实验。攻毒后连续观察16天，观察各组实验鸡的精神、采食、饮水、粪便、呼吸等临床情况。对病死鸡立即进行病理剖检。并于疫苗接种前1d和接种后第5,15,30d采集血样，测定抗体效价。

2.实验结果

2.1攻毒对照组

鸡接种鸡传染性支气管炎病毒72h后，攻毒对照组病鸡出现鸡传染性支气管炎病毒临床症状。病鸡出现明显的咳嗽，部分鸡出现罗音、呼吸困难等症状，病鸡精神沉郁，食欲减少，对死亡鸡只进行剖检，出现鸡传染性支气管炎典型病理变化。病鸡剖检可见:气管下段和支气管中有黄色干酪样渗出物，有的气管下段和支气管处有环状出血，气囊增厚。

2.2实验性治疗组

1～7组在给药和接种疫苗后，与攻毒对照组比较，出现症状减轻或消失，结果见表5。实施例3,4,5刺五加颗粒、对照药物组及疫苗对照组对人工感染鸡传染性支气管炎病毒的有效率显著高于攻毒对照组(p<0.01);实施例3，4，5组有效率显著高于对比例1,2,3对照药物组(p<0.01);实施例3，4，5,组的有效率无统计学差异(p>0.05)。

表5鸡传染性支气管炎强毒攻击保护实验结果

2.3刺五加颗粒剂对鸡新城疫、传染性支气管炎二联灭活疫苗(La Sota株-M41株)抗体水平的影响

鸡新城疫、传染性支气管炎二联灭活疫苗(La Sota株-M41株)抗体水平检测结果见表6。由表6可知，在免疫接种前测得的各实验组以及空白对照组抗体水平相当，从免疫5d开始，实验2，3，4组IHA抗体效价水平均显著高于对照组(P<0.05)，而且实验组的抗体产生速度快，持续时间长。5，6组和疫苗对照组差异不显著(P>0.05)，实验2,3,4组和药物对照组5,6,7组之间两两差异显著(P<0.05)，说明实施例3，4，5所得产品按照混饮1L水1g刺五加颗粒剂对鸡传染性支气管炎病毒抗体产生、免疫抗病能力的提高具有明显的促进作用，均优于对比例1,2,3所制备的刺五加对照药物的效果。

表6刺五加颗粒剂对鸡传染性支气管炎病毒抗体水平的影响

注：各实验组与疫苗对照比较，用*表示，*表示差异显著(P<0.05)；

对照药物组和实验组间比较，用#表示，#表示差异显著(P<0.05)。

3结论

以治愈、显效、有效、无效作为疗效判定标准，观察攻毒后病鸡的临床症状变化，对病死鸡进行剖检和病毒分离鉴定，并计算有效率和治愈率。结果表明:本发明实施例3，4，5所得产品即：刺五加颗粒每1L水0.2g混饮，对鸡新城疫、传染性支气管：炎二联灭活疫苗(LaSota株-M41株)有良好的免疫增强作用，与其它用药组相比，能显著提高鸡传染性支气管炎病毒病血清的抗体水平(p<0.01),增强其免疫保护作用，可以提高鸡传染性支气管病毒病血清抗体效价，提高动物机体抗应激能力。

以上临床实验结果表明，给鸡自由饮水刺五加颗粒，与鸡新城疫、传染性支气管炎二联灭活疫苗联用，连用5-7天，能够提高鸡的免疫功能，增强机体抗病力，增强其抗应激能力。

因此临床推荐刺五加颗粒按每1L水1g混饮，与疫苗联用，连用7天，可以提高动物机体的免疫力，增强其抗应激能力，提高疫苗的免疫保护力。

实施例19

为探讨本发明实施例3,4,5得到的刺五加提取物后，按照的实施例10,11,12制得的刺五加颗粒的临床作用，与目前常规提取对比例1,2,3得到刺五加提取物后按照实施例13,14,15制得刺五加颗粒对鸡的产蛋率及孵化率进行对比研究。结果表明本发明效果优于常规方法得到的刺五加提取物。

1.实验方法

1.1实验药物

刺五加颗粒制剂制备使用实施例3，4，5所得提取物为原料，按照实施例10，11，12制得刺五加颗粒。

对照药物为对比例1,2,3所得的提取物，按照按照实施例13,14,15制得刺五加颗粒。使用方法：0.2g溶解于1000mL水中，混饮。

使用方法：喂养时在饲料中添加，0.2g拌于1Kg饲料中喂养。

1.2实验分组

选择217日龄健康新罗曼蛋种鸡300只，实验随机分为6组，第1组为本发明实施例3实验组，第2组为实施例4实验组，第3组为实施例5实验组，第4组为对比例1药物对照组，第5组为对比例2药物对照组，第6组为对比例3药物对照组。

2.实验结果及结论

实验从2012年3月23日-3月28日为预饲期,饲喂基础日粮。正试期从2012年3月29日-5月28日,整个实验共60天。为减少实验日粮中刺五加提取物多糖对鸡生的应激,第1天先饲喂部分实验料,第2天全产部饲喂实验日粮。日喂4次,时间分别为4:30,11:00,13:30,17:30。每日17:30计算全天产蛋量、产蛋率、平均采食量称量蛋重等。

表7刺五加颗粒剂对鸡传染性支气管炎病毒抗体水平的影响

从本实验可以看出,刺五加提取物对蛋种鸡生产性能有一定影响。产蛋率总体变化不大，但比较看实验组1,2,3即：实施例3，4，5效果较好；从孵化率上看，明显加入刺五加提取物制备的颗粒后，孵化率提高显著。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种刺五加提取物在制备防治禽畜病毒感染性疾病的药物中的应用，其特征在于，该提取物中多糖含量为75wt%~80wt%，该提取物中还原糖含量为4wt%~9wt%，该提取物中不含单糖；其中，该病毒为传染性法氏囊病毒或传染性支气管炎病毒；包括如下步骤：

A.刺五加药材前处理：药材经粉碎后用易挥发有机溶剂超声提取至提取液无色，去除提取液，得经处理过的药材；

B.刺五加多糖提取工艺：于上述经步骤A处理过的药材中加入化学助剂Na₂CO₃与Na₂B₄O₇的混合物，用0~80wt%乙醇提取，收集提取液；

C.刺五加多糖分离工艺：取步骤B所得提取液，用盐酸调制pH为2.0~5.0，然后进行固液分离，收集液体；

D.将步骤C所得液体进行浓缩、干燥，即得刺五加提取物。

2.如权利要求1中的所述的刺五加提取物在制备防治禽畜病毒感染性疾病的药物中的应用，其特征在于，还包括如下步骤：

E.于上述步骤D所得刺五加提取物中加入乙醇含量为95wt%以上的乙醇溶液进行醇沉，然后进行固液分离，取沉淀，干燥。