CN101391102A - 能防治家禽呼吸道疾病的免疫球蛋白复合剂的生产技术 - Google Patents

Abstract

本发明涉及兽药与饲料添加剂领域，具体是指特效防治家禽呼吸道疾病的免疫球蛋白复合制剂的生产方法。其特征是用特异性免疫球蛋白或含有特异性免疫球蛋白的未提取物按一定配比添加部分载体或填充物等混匀而成。本发明综合了免疫球蛋白与载体或填充物的优点，形成了新型的抗生素替代品，达到标本兼治，可以加快家禽呼吸道疾病的康复，达到防病与治病的目的，同时还降低了成本。是一种安全、无激素的绿色产品，对家禽呼吸道疾病有特效，治愈率达到98％以上，提高家禽生长速度8％以上。本发明特别适用于家禽呼吸道疾病的预防和治疗，同时也适用于各种家畜与宠物等动物呼吸道疾病的防治。

Description

能防治家禽呼吸道疾病的免疫球蛋白复合剂的生产技术

(一)技术领域

本发明涉及兽药与饲料添加剂领域，具体是指特效防治家禽呼吸道疾病的免疫球蛋白与野马追等复合制剂的生产方法。

本发明特别适用于家禽呼吸道疾病的预防和治疗，同时也适用于各种家畜与宠物等动物呼吸道疾病的防治。

(二)背景技术

家禽上呼吸道感染是指家禽上呼吸道受病原微生物侵袭所致的疾病。家禽(以鸡为例)常见呼吸道病主要由病毒、细菌和败血霉形体等引起，其临床的主要特征为流泪、流鼻涕、咳嗽、气喘、罗音和呼吸困难、眼肿。常见有传染性喉气管炎和传染性支气管炎等，该病多发生于春季的3～6月份，病传播快，感染率高，死亡率与环境、管理及鸡的个体健康状况有关，一般其死亡率一般在10％～40％，继发性感染死亡率则更高，产蛋率下降20％左右，甚者下降50％，此类疾病对鸡的生产性能，甚至对养鸡业的发展危害极大。

家禽传染性呼吸道疾病对家禽的生产性能，对家禽业的发展危害极大，目前较理想的治疗药物尚不多，常用的西药不但价格贵，而且主要以抗菌素和糖皮质激素为主，有一定的副作用。据国外学者的一项专题调查统计，南美北部的养鸡户中，呼吸道疾病的治疗支出费用占鸡所有疾病总支出的59％，其中死亡支出为46.56％，药物支出占治疗费用的65％。

家禽呼吸道病主要是指家禽呼吸道感染性病症，如家禽慢性呼吸道病、传染性支气管炎、传染性喉气管炎、曲霉菌病等。这些常见、多发的传染性疾病，严重的影响了家禽生长发育，以至造成大批死亡，给家禽生产带来巨大损失。防治此类疾病，由于多采用抗生素和化学药物，且由于应用的不规范、不合理，经长期应用后，除了药物毒性较大容易造成药物中毒以外，还导致抗药性和药物在禽蛋产品中的残留，被人摄食后，屡有中毒事件发生，以至造成人群慢性中毒、致畸、致癌等不良后果。对此，国内外均越来越引起高度重视。2001年，国家农业部颁发的《无公害食品标准》中明确规定减少化学药品和抗生素的使用，禁止使用激素或其他有激素作用的物质及催眠镇静类药物等等，因此，以高效、低毒、低残留为主攻方向，研制微生物制剂、开发现代中药兽药及发展和充分利用生物技术搞好畜禽疾病防治已成为当前兽药界的努力方向和热门话题。

鸡传染性呼吸道疾病主要有鸡传染性喉气管炎、传染性支气管炎、慢性呼吸道病、传染性鼻炎以及禽大肠杆菌病等。目前治疗病毒引起的呼吸道疾病尚没有特效的西药，对细菌引起的呼吸道疾病，主要使用抗菌素如高力米先、绿消炎宝、红霉素、卡那霉素等，可根据不同的病因，采用不同的治疗方法对症治疗。但细菌对抗菌素易产生抗药性，且抗菌素毒副作用较大。近年来，我国兽医工作者根据传统兽医学的理论，运用野马追等中兽药防治鸡呼吸道疾病，尤其是病毒性呼吸道疾病取得了显著成绩。

野马追为菊科植物轮叶泽兰(Eupatorium)多年生草本，分布于华东、华南、华北、东北及台湾等地。盛产于江苏、安徽等地区，其它各省也有分布，药源丰富，并可引种野生为家种。中医药理论认为野马追有化痰止咳、清热解毒、利尿消肿、降压的功能，用于感冒、咳嗽多痰、头疼、扁桃体炎、菌痢、高血压。常用于治疗慢性气管炎，支气管炎，高血压等疾病。野马追中含有丰富的微量元素，主要以Fe、Al、Si为主，其次为Sr、Ti、Mn、Ba，再次为Zn、B、Pb、V、Cu。据报道，中药中的微量元素常与有机酸、氨基酸、肽等成分络合，产生协同作用而增强其疗效。另外，尽管微量元素在人的机体内只占总质量的万分之一以下，但它们在整个生命活动中却发挥了巨大作用。微量元素参与机体各种酶及活性物质的代谢，维持机体内环境的平衡。经过对野马追活性筛选提示乙酸乙酯提取部位为主要活性部位，并从中分离得到6种黄酮类化合物，结构鉴定为：棕矢车菊素、山柰酚、槲皮素、黄芪苷、三叶豆苷、金丝桃苷。

卵黄免疫球蛋白(Egg Yolk Immunoglobulin，IgY)具有增强机体抗菌、免疫功能，采用生物技术从产蛋鸡卵黄中制备特异性多克隆免疫球蛋白，具有成本低，产量高的特点。IgY能够凝聚、吞噬和中和细菌及毒素成分；增强免疫系统功能，预防呼吸道等疾病，促进营养吸收。用于家禽的保健和疾病治疗等。在我国富含免疫球蛋白的原料很丰富，就全国范围内，每年可得猪血1125～1150亿千克，如果这些原料能被很好地利用起来，将产生巨大的经济效益和社会效益。

经过大量试验，申请者进行了一系列研究，其研究成果通过省级专家鉴定，达到国内领先水平，其结果如下：

1、按完全随机设计将200只5周龄未免疫AA肉公鸡按体重随机分为4个试验组和1个对照组，每组40只鸡。试验组每只鸡每天灌服1.5mL野马追等中草药与免疫球蛋白复合添加剂，对照组灌服1.5mL生理盐水作安慰剂。按照野马追等中草药与免疫球蛋白的不同配比分为试验组I、II、III和IV，配比分别为1:1，1:0.8，1:0.5，1:0.2。试验表明，每天灌服1.5mL野马追等中草药与免疫球蛋白复合添加剂，对传染性支气管炎的保护率可达到98.5％。而没有灌服复合添加剂的肉鸡的保护率仅为12.5％。中草药与免疫球蛋白配合使用后，肉鸡对传染性支气管炎的抵抗力有明显增强。抗体消长规律同时表明这类复合添加剂在肉鸡体内的有效期为18～21d。

2、按照野马追等中草药与免疫球蛋白的不同配比分为试验组I、II、III和IV，配比分别为1:1，1:0.8，1:0.5，1:0.2。试验利用中草药与免疫球蛋白不同配比对禽大肠杆菌分离株(0422)、大肠杆菌(C84010)、大肠杆菌O₂型(C84002)、大肠杆菌O₇₈型(C84008)菌株等进行药敏试验。结果表明，4种配比的复合制剂对各型禽大肠杆菌都有一定的抗菌活性，MIC在15.6g/L至125g/L之间，中草药与免疫球蛋白为1:1时禽大肠杆菌敏感性最高，其余各组对不同血清型的禽大肠杆菌也有较高的敏感性。试验证明：抗大肠杆菌细胞壁膜的抗体可减弱或制止大肠杆菌培养平板上该菌的生长。卵黄免疫球蛋白防止大肠杆菌附着于肠细胞的这类特性，在抗沙门氏菌方面也得到了证实。卵黄免疫球蛋白与中草药之间表现出协同作用，各组都有较好的抑菌作用。

3、将不同配比的野马追等中草药与免疫球蛋白复合制剂体外抑制病毒的能力进行比较。抑病毒实验采用两种方法：病毒致细胞病变抑制实验和血凝抑制实验，以产生50％细胞病变的最高药物稀释度或不产生凝血的最小药物浓度为其最小抑病毒的浓度。样品I对腺病毒7型(AdV₇)的最小抑制浓度为1/640，作用弱于样品II，而对其它病毒的作用都最强。样品IV除对腺病毒3型(AdV₃)的最小抑制浓度为1/640，对其余病毒的抑制作用在4种样品中最弱。体外抑制病毒实验表明选用1:1配比的复合制剂最能有效防治呼吸道疾病。急性上呼吸道感染有70％～80％由病毒引起，实验所选7种病毒为呼吸道感染最常见的病毒，尤其是合胞病毒，对呼吸道病毒感染具有一定代表性。实验结果表明，中草药与免疫球蛋白配比为1:1，对各病毒的抑制效果最强。这也合理解释了其防治呼吸道疾病效果最佳。结果也与先前提高肉鸡日增重和饲料转化效率，促进蛋鸡法氏囊发育，有效保护传染性支气管炎等实验一致。

4、选用体重相近的20周龄伊莎蛋鸡200只，采用单因素随机试验，随机分为5个组，每个组设5个重复，每个重复8只鸡。研究观察中草药野马追等中草药与免疫球蛋白复合制剂对蛋鸡传染性支气管炎的治疗效果。选用20周龄伊莎蛋鸡200只，随机分为5组。试验组I、II、III和IV与对照组，试验组分别吸入中草药与免疫球蛋白配比为1:1，1:0.8，1:0.5，1:0.2的复合制剂，连用7天后观察对免疫器官指数的影响，攻毒后观察各组免疫保护效果，并在临床上加以观察利用。试验结果表明，中草药与免疫球蛋白复合制剂(配比1:1)能促进蛋鸡法氏囊发育，对传染性支气管炎有很好的免疫保护效果。吸入复合制剂对传染性支气管炎有较好的保护作用，保护率在85％～100％范围内。其中，以试验组I(配比1:1)效果最优，保护率达100％。利用复合制剂(配比为1:1)进行紧急治疗，结果对三个鸡场发病鸡的治愈率分别为98.16％、99.02％、98.22％，表现出较好的治疗效果。

在畜禽呼吸道疾病防治方面，野马追等中兽药的研究开发和生物技术的应用取得了明显的进展。但大多药物作用重在治标，呼吸道疾病又多有反复发作，往往呈现防不胜防之势。有些生物制品能增强动物免疫功能，然而目前应用还不广。使用野马追等中兽药与免疫球蛋白切合治疗家禽呼吸道疾病，能达到低毒、低残留或无毒无残留的目的，其禽蛋产品可为绿色和无公害食品，从而保证了食品的安全性，有利于冲破一些国家对我国禽蛋产品出口的制约，赢得国际市场，扩大对外贸易。免疫球蛋白与野马追等中兽药复合制剂为绿色保健品，具有无公害、无残留、无毒副作用、不产生抗药性等特点。在防治家禽呼吸道疾病疾病方面，做到治标与治本结合。推广应用后可减少化学药品在动物产品中的残留，实现禽产品的绿色无害化，提高我国禽产品的综合竞争力，带动和促进农业增效、农民增收，保障人民群众的食肉安全，市场前景广阔。有利于冲破一些国家对我国禽产品出口的制约，赢得国际市场，扩大对外贸易，具有重要的经济意义和社会效益。

(三)发明内容

本发明的目的在于，提出防治家禽呼吸道疾病免疫球蛋白与野马追或野马追等中草药复合制剂的制备方法，在野马追或野马追等中草药基料基础上添加特异性卵黄免疫球蛋白而形成的，本发明综合了中草药与免疫球蛋白的优点，是一种新型的抗生素替代品，可以替代抗生素，解决了传统用抗生素治疗家禽呼吸道疾病产生耐药性问题，实现家禽产品的绿色无害化。

本发明的工艺如下：

1.卵黄免疫球蛋白的制备方法

1.1 鸡蛋免疫制备：选择健康产蛋母鸡，用市购或自制的呼吸道病原微生物多价疫苗(如鸡新城疫—传染性法氏囊—传染性支气管炎三联油乳剂灭活苗)对蛋鸡胸部肌肉分别多点注射，0.5mL/只，每周免疫一次，三次免疫后，免疫球蛋白水平达到高效价后，收集鸡蛋。

1.2 卵黄免疫球蛋白提取方法——乙酸—乙酸钠缓冲液方法(一)

高免蛋先用清水洗去蛋壳表面的污物，浸入0.5％新洁尔灭溶液中，浸泡10分钟，再用75％的酒精冲洗，无菌打破蛋壳，倒入消毒好的容器中，用灭菌勺分离出卵黄放入无菌容器。1体积蛋黄加9体积的乙酸—乙酸钠缓冲液(0.05mol/L，pH为5.0)，二者搅拌时间为15min，混匀，4℃，静置10h。离心(1900r/min，10℃，10min)，弃沉淀。收集沉淀，将沉淀溶于25mmol/L，NaCI溶液中使其成为均一的悬浮液，4℃下滤纸过滤除去其中的脂蛋白沉淀，收集滤液(含有卵黄免疫球蛋白的水溶性蛋白组分)，得到卵黄免疫球蛋白粗提物冷冻真空干燥→测定卵黄免疫球蛋白的含量和活性→制成卵黄免疫球蛋白制剂→粉剂或注射剂

1.3 卵黄免疫球蛋白提取方法——水稀释法(二)

高免蛋先用清水洗去蛋壳表面的污物，浸入0.5％新洁尔灭溶液中，浸泡10分钟，再用75％的酒精冲洗。用蛋清/蛋黄分离器得到蛋黄液，用无菌水1:9倍稀释，经搅拌(15min，4℃)，静置(10h)，冷冻离心(4℃，10000rpm，25min)，取上清液(WSF)得到卵黄免疫球蛋白粗提液(或经过盐析(NaCl)，然后预过滤，分出残渣，透过液超滤，所得超滤液最后经DEAE离子交换层析(pH7.2磷酸盐缓冲液平衡后，并用其作洗脱液，收集蛋白液)分离后得到含高纯度IgY液体)用真空冷冻干燥机冻干，得到卵黄免疫球蛋白粉剂，或制成肠溶卵黄免疫球蛋白胶囊和其他剂型。

1.4卵 黄免疫球蛋白提取方法——超滤法(三)

利用水稀释法得到的粗提卵黄免疫球蛋白液，采用超滤法，分子截留量采用100kDa，操作压力差为0.12MPa、进料温度为30℃，pH5.2，截留液免疫球蛋白回收率达到91.89％，纯度为86％；最后，经DEAE离子交换层析得到高纯度的卵黄免疫球蛋白。

1.5 卵黄免疫球蛋白提取工艺(以鸡蛋为例)

鲜鸡蛋→打蛋取蛋黄→制备蛋黄溶液→盐析→超滤浓缩→冷冻真空干燥→测定卵黄免疫球蛋白的含量和活性→制成卵黄免疫球蛋白制剂→粉剂或注射剂

2.血清免疫球蛋白的制备方法

2.1 选择健康动物(如猪、马、牛、羊等)，用市购或自制的呼吸道病原微生物多价疫苗(如鸡新城疫—传染性法氏囊—传染性支气管炎三联油乳剂灭活苗)，采用口服免疫、注射或滴鼻方法，对其进行免疫，剂量：每头0.1～3.0mL。在免疫三天后进行采血，自然凝固后，采用转速2000～10000r/min，离心20～30min，取血清，得到血清免疫球蛋白粗提液。

2.2 从血液中提取免疫球蛋白。常用的有盐析法(如多聚磷酸钠絮凝法、硫酸铵盐析法)、有机溶剂沉淀法(如冷乙醇分离法)、有机聚合物沉淀法、变性沉淀法等。用于大规模生产的方法主要有：冷乙醇分离法、盐析法、利凡诺法和柱层析法等，应用较多的为硫酸铵盐析法和冷乙醇分离法。

2.3 提取工艺(以硫酸铵盐析法为例)：

猪血清→加入硫酸铵饱和溶液进行沉淀→免疫球蛋白(Ig)粗品→加蒸馏水转移→超滤→透析→免疫球蛋白纯品。工艺条件采用pH7.0～7.2、40～50℃、50％饱和度的(NH₄)₂SO₄溶液，此工艺可以大规模生产免疫球蛋白、安全无毒、操作方便。既能保证免疫球蛋白的生物活性不受破坏，又能满足大量生产的需要。

2.4 喷雾干燥方法

将提取的血清免疫球蛋白粗提液，配制成蛋白浓度为10％～20％的溶液，分别在入风口温度120～180℃，出风口温度60～80℃条件下进行喷雾干燥，真空包装，置于冰箱保存。

3.中草药提取物制备方法

将野马追单项中草药或按照野马追、板蓝根、麻黄、桔梗、穿心莲、鱼腥草、黄芪、葶苈子、茯苓等中草药1～10:1:1:1:1:1:1:1:1比例混合，利用微粉碎机粉碎后混合，分别得到野马追与野马追等中草药粉剂；利用超声波提取中草药粉剂有效成分，提取前的浸泡时间是60～90min。超声波频率采用20～40kHz，超声波处理30min。过滤后，经过低温冷冻干燥机或喷雾干燥制成粉剂。

3.1 野马追等中草药提取物的制备取已经粉碎好的一定量的野马追等中草药，置于具塞三角瓶中，加入倍体积量的提取溶剂，置于超声波装置中，处理30min后，过滤，滤液减压浓缩后，在加入5倍体积量的提取溶剂超声波处理15min，过滤，滤液减压浓缩，如此重复2次，合并3次提取物的浓缩物，即得到该溶剂的超声波提取的粗提物，置于4℃冰箱保存备用。

3.2 野马追等中草药提取物微胶囊生产技术

按照大豆白与麦芽糊精的比例1:2，中草药提取物添加量为2.2％，均质压力为30MPa，喷雾干燥塔进风口风温100℃，出风风温70～80℃。经喷雾干燥制得中草药提取物微胶囊。

4.中草药粉碎

采用微粉碎机或超微粉碎机对野马追与野马追等中草药进行粉碎。

5.中草药与免疫球蛋白复合饲料添加剂制备方法

5.1 中草药提取粉剂(或粉体)与免疫球蛋白粉剂(或未提取物)

按照野马追等中草药提取粉剂(或粉体)与免疫球蛋白粉剂(或未提取物)与载体1:0.3:2的比例，先将中草药提取粉剂(或粉体)与免疫球蛋白粉剂(或未提取物)加入到混合机混合1min，再加入载体(加入的比例为0.1～99％)混合4min，即得复合饲料添加剂。

5.2 利用提取的中草药滤液，浓缩至原液浓度为1g/mL，采用间歇法灭菌。经过低温冷冻干燥机进行制成粉剂；卵黄免疫球蛋白粉剂由疫苗经过蛋鸡免疫制备。中草药提取粉剂与卵黄免疫球蛋白粉剂复合制备了中草药免疫球蛋白复合饲料添加剂。

6.中草药免疫球蛋白复合制剂制备方法

按照野马追等中草药提取液与免疫球蛋白提取液1:0.5的比例均匀混合，灭菌→中草药免疫球蛋白混合液→真空包装→注射剂、口服剂或气雾剂成品

本发明的优点是：

1.通过应用鸡呼吸道疾病疫苗(如新城疫—传染性法氏囊—传染性支气管炎三联油乳剂灭活苗或其他有关疫苗)免疫蛋鸡，制备鸡抗鸡新城疫—传染性法氏囊—传染性支气管炎的特异性高免卵黄免疫球蛋白，或免疫猪等哺乳动物获得特异性血清免疫球蛋白。应用平板式膜超滤技术对卵黄中的免疫球蛋白进行分离，采用真空冷冻干燥工艺，制备卵黄免疫球蛋白粉剂。

2.利用超声波技术对野马追等中草药进行了提取，采用真空冷冻干燥工艺，制备中草药卵黄免疫球蛋白饲料添加剂和气雾剂产品。

3.原料来源广泛，可再生；工艺流程简单，条件温和；整个制备工艺无任何废水、废气废液产生，无环境污染。

4.本发明综合了中草药与免疫球蛋白的优点，是一种新型的抗生素替代品，具有增强机体抗菌、免疫功能，可抑制致病性鸡新城疫—传染性法氏囊—传染性支气管炎等致病微生物的生长，是维持家禽健康所必需。具有创新性，可以替代抗生素使用，有广阔的市场前景。

(四)具体实施方式

具体实施方式一：

原料：野马追等中草药提取物、卵黄免疫球蛋白、载体

1.野马追等中草药提取物制备：

按照野马追、板蓝根、麻黄、桔梗、穿心莲、鱼腥草、黄芪、葶苈子、茯苓等中草药10～1:1:1:1:1:1:1:1:1的比例混合，利用微粉碎机粉碎后混合，再利用超声波提取其有效成分，提取前的浸泡时间是60～90min。超声波频率采用20～40kHz，超声波处理30min。过滤后，经过低温冷冻干燥机或喷雾干燥制成粉剂。

2.卵黄免疫球蛋白制备：

2.1 鸡蛋免疫制备：选择健康产蛋母鸡，用市购或自制的呼吸道病原微生物多价疫苗(如鸡新城疫—传染性法氏囊—传染性支气管炎三联油乳剂灭活苗)对蛋鸡胸部肌肉分别多点注射，0.5mL/只，每周免疫一次，三次免疫后，免疫球蛋白水平达到高效价后，收集鸡蛋。

2.2 卵黄免疫球蛋白提取方法(以乙酸—乙酸钠缓冲液方法为例)

高免蛋先用清水洗去蛋壳表面的污物，浸入0.5％新洁尔灭溶液中，浸泡10分钟，再用75％的酒精冲洗，无菌打破蛋壳，倒入消毒好的容器中，用灭菌勺分离出卵黄放入无菌容器。1体积蛋黄加9体积的乙酸—乙酸钠缓冲液(0.05mol/L，pH为5.0)，二者搅拌时间为15min，混匀，4℃，静置10h。离心(1900r/min，10℃，10min)，弃沉淀。收集沉淀，将沉淀溶于25mmol/L，NaCI溶液中使其成为均一的悬浮液，4℃下滤纸过滤除去其中的脂蛋白沉淀，收集滤液(含有卵黄免疫球蛋白的水溶性蛋白组分—WSF)，得到卵黄免疫球蛋白粗提物冷冻真空干燥→测定卵黄免疫球蛋白的含量和活性→制成卵黄免疫球蛋白制剂

3.免疫球蛋白复合制剂制备：

3.1 按照野马追等中草药提取粉剂(或粉体)与卵黄免疫球蛋白粉剂(或卵黄、血清免疫球蛋白)1:1比例混合，混合时，先将中草药提取粉剂(或粉体)与卵黄免疫球蛋白粉剂干粉(或未提取物)加入到混合机混合1min，再添加30～80％玉米芯混合4min，即得复合制剂产品。

3.2 在卵黄免疫球蛋白粉剂(或卵黄、血清免疫球蛋白)基础上，添加经过粉碎、微粉碎、超微粉碎，或粉碎后的中草药提取物或其原料混合后的粉体1～99％，制备免疫球蛋白复合制剂；

3.3 在经过粉碎、微粉碎、超微粉碎，或粉碎后的中草药提取物或其原料粉体的基础上，添加卵黄免疫球蛋白粉剂(或卵黄、血清免疫球蛋白)1～99％，制备免疫球蛋白复合制剂；

3.4 按照野马追等中草药提取液与卵黄免疫球蛋白提取液1:1的比例混合，采用间歇杀菌，装瓶，制备制成复合气雾剂。

3.5 利用超声波提取中草药有效成分，合并滤液，浓缩至原液浓度为1g/mL。将制得的中草药液体提取物与液体卵黄免疫球蛋白按照1:1混合→中草药免疫球蛋白液体→间歇灭菌→测定卵黄免疫球蛋白的含量和活性→进行调配→装瓶处理后→成品(或制成肠溶卵黄免疫球蛋白胶囊或其他剂型)

具体实施方式二：

原料：野马追等中草药提取物、卵黄、载体

1.野马追等中草药提取物制备：按照野马追、板蓝根、麻黄、桔梗、穿心莲、鱼腥草、黄芪、葶苈子、茯苓等中草药10～1:1:1:1:1:1:1:1:1的比例混合，利用微粉碎机粉碎后混合，再利用超声波提取其有效成分，提取前的浸泡时间是60～90min。超声波频率采用20～40kHz，超声波处理30min。过滤后，经过低温冷冻干燥机或喷雾干燥制成粉剂。

2.卵黄制备：

取新鲜高免蛋消毒后，人工打蛋取卵黄或通过蛋清/蛋黄分离器得到蛋黄液。

3.中草药与卵黄复合制剂制备：

按照野马追等中草药提取物与卵黄重量比1:1的比例进行混合后→添加20～80％脱脂米糠与0.5％抗氧化剂→通过混合机混匀→灭菌→真空包装→野马追中草药免疫球蛋白粉剂产品。

具体实施方式三：

原料：中草药提取物、卵黄卵清、载体

1.1.野马追等中草药提取物制备：按照野马追、板蓝根、麻黄、桔梗、穿心莲、鱼腥草、黄芪、葶苈子、茯苓等中草药10～1:1:1:1:1:1:1:1:1的比例混合，利用微粉碎机粉碎后混合，利用微粉碎粉碎后混合，再利用超声波提取其有效成分，提取前的浸泡时间是60～90min。超声波频率采用20～40kHz，超声波处理30min。过滤后，经过低温冷冻干燥机或喷雾干燥制成粉剂。

2.卵黄卵清制备：

取新鲜高免蛋消毒后，打蛋取卵黄蛋清，除去蛋壳或通过蛋清/蛋黄分离器得到蛋黄液。

3.中草药卵黄卵清制剂制备：

将制得的中草药提取物与卵黄蛋清按照1：1的比例进行配比→添加20～60％白碳黑，通过混合机混匀→灭菌→中草药免疫球蛋白粉剂→测定卵黄免疫球蛋白的含量和活性→真空包装→成品

具体实施方式四：

原料：中草药微(超微)粉碎、卵黄免疫球蛋白、载体

1.中草药微(超微)粉碎：

按照野马追、板蓝根、麻黄、桔梗、穿心莲、鱼腥草、黄芪、葶苈子、茯苓等中草药10～1:1:1:1:1:1:1:1:1的比例混合，利用微粉碎机粉碎后混合，，利用微粉碎粉碎后混合，制备中草药粉剂。

2.卵黄免疫球蛋白制备(采用水稀释法)：

高免蛋先用清水洗去蛋壳表面的污物，浸入0.5％新洁尔灭溶液中，浸泡10分钟，再用75％的酒精冲洗，无菌打破蛋壳。分离蛋清与卵黄，卵黄加9倍无菌水稀释，用HCI调节pH5.2稀释液混合后，于4℃冷藏5h，在4℃ 1000g条件下离心1h，上清液加入饱和硫酸铵及硫酸钠盐析沉淀，离心后，经过低温冷冻干燥机或喷雾干燥，即得粗提卵黄免疫球蛋白。

3.野马追等中草药免疫球蛋白制剂制备：

将制得的中草药提取物与卵黄免疫球蛋白(或血清免疫球蛋白)按照1:1的比例进行配比→添加20～60％白碳黑，通过混合机混匀→灭菌→中草药免疫球蛋白粉剂→真空包装→成品

具体实施方式五：

原料：野马追等中草药微(超微)粉碎、卵黄、载体

1.野马追等中草药提取物制备：按照野马追、板蓝根、麻黄、桔梗、穿心莲、鱼腥草、黄芪、葶苈子、茯苓等中草药10～1:1:1:1:1:1:1:1:1的比例混合，利用微粉碎机粉碎后，高速混合5min，制成野马追等中草药粉剂。

2.卵黄制备：

取新鲜高免蛋消毒后，人工打蛋取卵黄或通过蛋清/蛋黄分离器得到蛋黄液。

3.野马追等中草药与卵黄复合制剂制备：

按照中草药提取物与卵黄重量比1：1的比例进行混合后→添加20～80％脱脂米糠与0.5％抗氧化剂→通过混合机混匀→灭菌→真空包装→野马追等中草药免疫球蛋白粉剂产品。

具体实施方式六：

原料：野马追等中草药微(超微)粉碎、卵黄卵清、载体

按照野马追、板蓝根、麻黄、桔梗、穿心莲、鱼腥草、黄芪、葶苈子、茯苓等中草药10～1:1:1:1:1:1:1:1:1的比例混合，利用超微粉碎或微粉碎机粉碎后混合，制得中草药粉剂。

2.卵黄卵清制备：

取新鲜高免蛋消毒后，打蛋取卵黄蛋清，除去蛋壳或通过蛋清/蛋黄分离器得到蛋黄液。

3.野马追等中草药卵黄卵清制剂制备：

将制得的野马追等中草药粉剂与卵黄蛋清按照1:1的比例进行配比→添加20～60％粉碎的大豆皮，通过混合机混匀→灭菌4～5分钟→中草药免疫球蛋白粉剂→真空包装→成品

具体实施方式七：

原料：野马追提取物、卵黄免疫球蛋白(或血清免疫球蛋白)、载体

1.野马追提取物制备：

将野马追烘干后，用微粉碎机粉碎后混合，再利用超声波提取其有效成分，提取前的浸泡时间是60～90min。超声波频率采用20～40kHz，超声波处理30min。过滤后，经过低温冷冻干燥机或喷雾干燥制成粉剂。

2.卵黄免疫球蛋白制备：

2.1 鸡蛋免疫制备：选择健康产蛋母鸡，用市购或自制的呼吸道病原微生物多价疫苗(如鸡新城疫—传染性法氏囊—传染性支气管炎三联油乳剂灭活苗)对蛋鸡胸部肌肉分别多点注射，0.5mL/只，每周免疫一次，三次免疫后，免疫球蛋白水平达到高效价后，收集鸡蛋。

2.2 卵黄免疫球蛋白提取方法(以乙酸—乙酸钠缓冲液方法为例)

高免蛋先用清水洗去蛋壳表面的污物，浸入0.5％新洁尔灭溶液中，浸泡10分钟，再用75％的酒精冲洗，无菌打破蛋壳，倒入消毒好的容器中，用灭菌勺分离出卵黄放入无菌容器。1体积蛋黄加9体积的乙酸—乙酸钠缓冲液(0.05mol/L，pH为5.0)，二者搅拌时间为15min，混匀，4℃，静置10h。离心(1900r/min，10℃，10min)，弃沉淀。收集沉淀，将沉淀溶于25mmol/L，NaCI溶液中使其成为均一的悬浮液，4℃下滤纸过滤除去其中的脂蛋白沉淀，收集滤液(含有卵黄免疫球蛋白的水溶性蛋白组分—WSF)，得到卵黄免疫球蛋白粗提物冷冻真空干燥→测定卵黄免疫球蛋白的含量和活性→制成卵黄免疫球蛋白制剂。

3.野马追免疫球蛋白制剂制备：

3.1 按照野马追提取粉剂(或粉体)与卵黄免疫球蛋白(或血清免疫球蛋白)粉剂干粉1:1比例混合，混合时，先将野马追提取粉剂(或粉体)与卵黄免疫球蛋白粉剂干粉(或未提取物)加入到混合机混合1min，再添加30～80％玉米芯混合4min，即得复合制剂产品。

3.2 按照野马追提取液与卵黄免疫球蛋白(或血清免疫球蛋白)提取液1:1的比例混合，采用间歇杀菌，装瓶，制备制成复合气雾剂。

3.3 利用超声波提取野马追有效成分，合并滤液，浓缩至原液浓度为1g/mL。将制得的野马追提取物与液体卵黄免疫球蛋白(或血清免疫球蛋白)按照1:1混合→中草药免疫球蛋白液体→间歇灭菌→测定卵黄免疫球蛋白(或血清免疫球蛋白)的含量和活性→进行调配→装瓶处理后→成品(或制成肠溶卵黄免疫球蛋白胶囊或其他剂型)

具体实施方式八：

原料：野马追、卵黄、载体

1.野马追提取物制备：用微粉碎机将烘干的野马追粉碎后，再利用超声波提取其有效成分，提取前的浸泡时间是60～90min。超声波频率采用20～40kHz，超声波处理30min。过滤后，经过低温冷冻干燥机或喷雾干燥制成粉剂。

2.卵黄制备：

取新鲜高免蛋消毒后，人工打蛋取卵黄或通过蛋清/蛋黄分离器得到蛋黄液。

3.野马追与卵黄复合制剂制备：

按照野马追提取物与卵黄重量比1:1的比例进行混合后→添加20～80％脱脂米糠与0.5％抗氧化剂→通过混合机混匀→灭菌→真空包装→野马追中草药免疫球蛋白粉剂产品。

具体实施方式九：

原料：野马追提取物、卵黄卵清、载体

1.1.野马追提取物制备：将野马追烘干后，用微粉碎机粉碎后混合，再利用超声波提取其有效成分，提取前的浸泡时间是60～90min。超声波频率采用20～40kHz，超声波处理30min。过滤后，经过低温冷冻干燥机或喷雾干燥制成粉剂。

2.卵黄卵清制备：

取新鲜高免蛋消毒后，打蛋取卵黄蛋清，除去蛋壳或通过蛋清/蛋黄分离器得到蛋黄液。

3.野马追卵黄卵清制剂制备：

将制得的野马追提取物与卵黄蛋清按照1:1的比例进行配比→添加20～60％白碳黑，通过混合机混匀→灭菌→野马追免疫球蛋白粉剂→测定卵黄免疫球蛋白的含量和活性→真空包装→成品

具体实施方式十：

原料：野马追微(超微)粉碎、卵黄免疫球蛋白(或血清免疫球蛋白)、载体

1.野马追微(超微)粉碎：

将野马追烘干后，用微粉碎机粉碎后混合，制备野马追粉剂。

2.卵黄免疫球蛋白制备(采用水稀释法)：

高免蛋先用清水洗去蛋壳表面的污物，浸入0.5％新洁尔灭溶液中，浸泡10分钟，再用75％的酒精冲洗，无菌打破蛋壳。分离蛋清与卵黄，卵黄加9倍无菌水稀释，用HCI调节pH5.2稀释液混合后，于4℃冷藏5h，在4℃1000g条件下离心1h，上清液加入饱和硫酸铵及硫酸钠盐析沉淀，离心后，经过低温冷冻干燥机或喷雾干燥，即得粗提卵黄免疫球蛋白。

3.野马追等中草药免疫球蛋白制剂制备：

将制得的野马追提取物与卵黄免疫球蛋白(或血清免疫球蛋白)按照1:1的比例进行配比→添加20～60％白碳黑，通过混合机混匀→灭菌→中草药免疫球蛋白粉剂→真空包装→成品

具体实施方式十一：

原料：野马追微(超微)粉碎、卵黄、载体

1.野马追微(超微)粉碎：

将野马追烘干后，用微粉碎机粉碎后混合，制备野马追粉剂。

2.卵黄制备：

取新鲜高免蛋消毒后，人工打蛋取卵黄或通过蛋清/蛋黄分离器得到蛋黄液。

3.野马追与卵黄复合制剂制备：

按照中草药与卵黄重量比1:1的比例进行混合后→添加20～80％脱脂米糠与0.5％抗氧化剂→通过混合机混匀→灭菌→真空包装→野马追免疫球蛋白粉剂产品。

具体实施方式十二：

原料：野马追微(超微)粉碎、卵黄卵清、载体

1.野马追微(超微)粉碎：

将野马追烘干后，用微粉碎机粉碎后混合，制备野马追粉剂。

2.卵黄卵清制备：

取新鲜高免蛋消毒后，打蛋取卵黄蛋清，除去蛋壳或通过蛋清/蛋黄分离器得到蛋黄液。

3.野马追卵黄卵清制剂制备：

将制得的野马追粉剂与卵黄蛋清按照1:1的比例进行配比→添加20～60％粉碎的大豆皮，通过混合机混匀→灭菌4～5分钟→野马追免疫球蛋白粉剂→真空包装→成品。

附图说明：图1是免疫球蛋白提取纯化制备工艺流程。

其工艺流程图说明如下：取新鲜高免蛋消毒后，通过蛋清/蛋黄分离器得到蛋黄液，乙酸/乙酸钠缓冲液(0.05mol/L，pH5.20)1:9倍稀释，经搅拌(15min，4℃)，静置(10h)，冷冻离心(4℃，10,000g，25min)，取上清液(WSF)，盐析(NaCl)，然后预过滤，分出残渣，透过液超滤，所得超滤液最后经DEAE离子交换层析(pH7.2磷酸盐缓冲液平衡后，并用其作洗脱液，收集蛋白液)分离后得到高纯度IgY。

Claims (6)

1、防治家禽呼吸道疾病免疫球蛋白复合制剂是在特异性免疫球蛋白基础上添加基料而形成的，其特征在于，所谓的基料是以野马追或按照野马追、板蓝根、麻黄、桔梗、穿心莲、鱼腥草、黄芪、葶苈子、茯苓等中的2～9种原料的提取物或其粉体调配混匀而成的；所谓的特异性免疫球蛋白是利用市购或自制的呼吸道病原微生物多价疫苗(如鸡新城疫—传染性法氏囊—传染性支气管炎三联油乳剂灭活苗)等制备的单价或多加灭活疫苗免疫蛋鸡，其免疫鸡蛋再经过消毒、分离纯化工艺制备而成的，或由上述疫苗免疫哺乳动物如家禽、兔等制备的血清免疫球蛋白；经过粉碎(或提取)的中草药与特异性免疫球蛋白(或卵黄、卵黄卵清)按照一定配比与载体复合混匀而成的固体或液体制剂。采用口服、注射、喷雾或伴饲料等方法给药，对家禽呼吸道疾病有特效，治愈率达到91％以上，提高家禽生长速度8％以上。

2、根据权利要求1所述的防治家禽呼吸道疾病免疫球蛋白复合制剂的制备方法，其特征在于，复合制剂为粉剂、水剂、气雾剂、颗粒剂或其他剂型，可以做饲料添加剂和各种药剂。

3、根据权利要求1所述的防治家禽呼吸道疾病中草药免疫球蛋白复合制剂的制备方法，其特征在于，中草药基料采用粉碎、微粉碎、超微粉碎，或粉碎后的提取物或其原料混合后的粉体，在复合制剂中加入的比例为1～99％。

4、根据权利要求1所述的防治家禽呼吸道疾病免疫球蛋白复合制剂的制备方法，其特征在于，特异性卵黄免疫球蛋白为提取，或特异免疫鸡蛋经过消毒后直接打蛋，利用蛋清蛋黄或只用蛋黄，再与权利3中的中草药混合，在复合制剂中加入的比例为0.1～99％。

5、根据权利要求1所述的防治家禽呼吸道疾病免疫球蛋白复合制剂的制备方法，其特征在于，利用家禽呼吸道疾病致病性微生物等制备的单价或多加灭活疫苗免疫蛋鸡，其免疫鸡蛋采用分离纯化工艺制备而成的，再与权利3中的中草药混合，在复合制剂中加入的比例为0.1～99％。

6、根据权利要求1所述的防治家禽呼吸道疾病免疫球蛋白复合制剂的制备方法，其特征在于，采用口服、注射、喷雾、伴料等方法给药，对家禽呼吸道疾病有特效，也用于各种家畜与宠物等动物呼吸道疾病的防治。

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