CN102861333B - 一种高活性抗鸡法氏囊病毒、流感病毒复合抗体口服制剂 - Google Patents
一种高活性抗鸡法氏囊病毒、流感病毒复合抗体口服制剂 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种高活性抗鸡法氏囊病毒、流感病毒复合抗体口服制剂。该口服制剂由鸡传染性法氏囊炎浓缩抗体、禽流感浓缩抗体、稳定剂和增效剂组成。本发明克服了现有的抗体制剂存在的仅为单一病原抗体和必须通过注射给药的缺点，通过特殊工艺提取高纯度的禽卵黄抗体有效成分LgY，并配以高效稳定剂和增效剂，使其通过内服给药到达肠道后迅速被吸收，进入血液后能与特定的病原菌黏附因子结合，使病原菌不能黏附易感细胞而失去致病性。本发明卵黄抗体制备工艺简单，生产原料来源广泛。因此，本发明为复合卵黄抗体口服制剂的常规化量产提供广阔的前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种高活性抗鸡法氏囊病毒、流感病毒复合抗体口服制剂，属于兽药技术领域。
背景技术
卵黄抗体是从免疫禽蛋中提取出的针对特定抗原的抗体，是一种具有较强免疫功能的蛋白质，有效成份为IgY。IgY在多种环境下均具有良好的稳定性，如耐热、耐酸、耐碱和抗酶降解。IgY对反复冻融具有耐受性，实验表明经5次反复冻融，其抗原结合活性几乎不受影响。在通常情况下，IgY基本能够耐受巴氏消毒，37℃下其活性基本无明显变化。当温度达到65℃时，IgY的活性可保持24h以上。在IgY溶液中添加适宜佐剂可以提高其热稳定性，使IgY在70-80℃依然能够保持较高的活性。lgY在pH4.0-11.0的范围内具有较好的稳定性。此外，IgY能够抵抗幼龄动物的胃酸屏障及肠道中胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的消化。IgY在37℃、强酸性低浓度胃蛋白酶存在下，处理2小时后用检测，其活性仅损失25%。经相关试验证明，IgY对多种胃肠道蛋白酶的稳定性极好。
禽类在特定免疫后在其卵黄中产生的大量高纯度特定IgY，其对禽类特定疫病具有明显治疗和紧急预防作用。目前，禽类病毒性疾病发病率呈上升趋势，而畜牧行业可用于抗病毒的药物屈指可数，给疾病防控带来巨大压力。卵黄抗体属于高效、无污染、无残留的生物制剂，经大量临床试验验证其对特异病毒病有显著治疗和防控作用。但是目前临床使用的抗体制剂大多数为单一病原抗体，而临床病毒病多为混合感染，因此，不能很好控制疾病。同时此类产品必须通过注射给药，无形中增加了大量人力成本，并且对禽产生极大应激反应，降低产蛋量和肉品质。因此，此类产品使用有很大局限性。
发明内容
本发明克服了现有的抗体制剂存在的仅为单一病原抗体和必须通过注射给药的缺点，通过特殊工艺提取高纯度的禽卵黄抗体有效成分LgY，并配以高效稳定剂和增效剂，使其通过内服给药到达肠道后迅速被吸收，进入血液后能与特定的病原菌黏附因子结合，使病原菌不能黏附易感细胞而失去致病性。本发明卵黄抗体制备工艺简单，生产原料来源广泛。因此，本发明为复合卵黄抗体口服制剂的常规化量产提供广阔的前景。
本发明的技术方案是：一种高活性抗鸡法氏囊病毒、流感病毒复合抗体口服制剂，其特征是，由鸡传染性法氏囊炎浓缩抗体、禽流感浓缩抗体、稳定剂和增效剂组成，按体积比鸡传染性法氏囊炎浓缩抗体：禽流感浓缩抗体：稳定剂：增效剂=1:0.8～1.2:4～6:0.8～1.2，优选比例范围为1:1:5:1。
所述鸡传染性法氏囊炎浓缩抗体：对健康产蛋鸡强化免疫鸡传染性法氏囊炎灭活油佐剂组织苗，当鸡翅静脉采集血清检测抗鸡传染性法氏囊病琼扩效价为16以上时，收集鸡蛋，获得卵黄原液；然后加入其质量5.5～6.5倍的纯化水，搅拌使卵黄充分分散于水中，形成均质溶液，用0.5±0.1mol/L的稀盐酸调节PH值到5.2±0.3，然后使用高速离心机（6000r/min，30min）离心获取上清液（除去大量的脂类），加入20%（w/v）的硫酸钠(即100ml上清液加入20g的硫酸钠）搅拌溶解均匀，静置，再用上述离心方法获取沉淀，即为卵黄抗体；然后加入其质量0.8～1.2倍的滤膜过滤的生理盐水充分混合均匀，加压超滤浓缩（采用截流值为80-100KDa的超滤浓缩设备），得到总蛋白浓度为900±50mg/ml的浓缩抗体。
所述禽流感浓缩抗体为：对健康产蛋鸡进行强化免疫禽流感灭活油佐剂组织苗，当鸡翅静脉采集血清检测抗鸡禽流感病琼扩效价为16以上时，收集鸡蛋，获得卵黄原液；然后加入其质量5.5～6.5倍的纯化水，搅拌使卵黄充分分散于水中，形成均质溶液，用0.5±0.1mol/L的稀盐酸调节PH值到5.2±0.3，然后使用高速离心机（6000r/min，30min）离心获取上清液，加入20%（w/v）的硫酸钠(即100ml上清液加入20g的硫酸钠），搅拌溶解均匀，静置，再用上述离心方法获取沉淀，即为卵黄抗体；然后加入其质量0.8～1.2倍的滤膜过滤的生理盐水充分混合均匀，加压超滤浓缩（采用截流值为80-100KDa的超滤浓缩设备），得到总蛋白浓度为900±50mg/ml的浓缩抗体。
所述稳定剂：按1升纯化水中加入甘露醇60±1g、蔗糖粉75±1.5g的比例制成澄清溶液。
所述增效剂：用纯化水将N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺溶解，制成6±0.5wt%的水溶液。
制备方法：将鸡传染性法氏囊炎浓缩抗体、禽流感浓缩抗体、稳定剂和增效剂混合均匀；然后将滤液用滤膜加压过滤除菌；最后无菌环境分装，常温密封保存，即得复合抗体口服制剂。由于IgY在多种环境下均具有良好的稳定性，因此该制剂在4℃贮存5年或在室温下贮存6-12个月，其抗体活性仍无明显变化。
服用方法：雏鸡每只每次内服0.5ml，成年鸡每次内服1.0ml；预防用量减半。每日早晚各一次，连用3-6天。
本发明的有益效果是：本发明制剂纯度≥95%，效价≥107、生物利用度高、临床效果更显著，制备工艺方便实用、绿色无污染。同时本发明制剂通过饲养蛋鸡获得抗体，在获取抗体期间，由于持续免疫作用，不仅不影响蛋鸡产蛋量，而且大幅降低发病率，从而充分保证能持续获得高质量的抗体。此外，本发明所使用仪器设备相对简单、工艺设计合理，所以本发明制剂生产极低，更适合于大规模生产。
具体实施方式
实施例1
（一）鸡传染性法氏囊炎抗体的制备：
1．将有病变的法氏囊组织称重，用研磨器研磨成匀浆，按质量比1：5加灭菌生理盐水，继续研磨均匀，然后用3层140目尼龙过滤网过滤，加入0.50％的甲醛，混合均匀，置于37℃作用24小后添加2%吐温80充分混合均匀后，用普通培养基检查杂菌，合格后，保存于阴凉处。
2．传染性法氏囊炎灭活油佐剂组织苗的制备：选用10号白油添加3%氢氧化铝混合均匀后加热充分溶解。与步骤1中液体按3：1配比制成。
3．选取无特定传染病的健康高产蛋鸡，将传染性法氏囊炎灭活油佐剂组织苗，给每只鸡皮下注射1.6ml。
4.10-14天后，从鸡翅静脉采集血清做传染性法氏囊琼脂扩散试验。琼扩效价达到16以上，即可收获鸡蛋。
5.将鸡蛋用水清洗干净，浸入新洁尔灭溶液中消毒5分钟，捞出擦干后，用75%酒精擦拭，凉干，无菌操作去蛋皮，获取卵黄，然后按1：6加入纯化水，搅拌使卵黄充分分散于水中，形成均质溶液，用0.5mol/L的稀盐酸调节PH值到5.2±0.3，然后使用高速离心机（6000r/min，30min）离心获取上清液，加入20%硫酸钠(100ml上清液加入20g的硫酸钠）搅拌溶解均匀，静置3小时，再用上述离心方法获取沉淀，即为卵黄抗体；然后按1:1比例加入用0.22μm滤膜过滤的生理盐水充分混合均匀。
6．4℃～8℃保存待用。
（二）禽流感组织灭活苗的制备：
1.将符合流感病变要求的肺脏、脾脏和肝脏称重，用研磨器研磨成匀浆，按质量比1：5加灭菌生理盐水，继续研磨均匀，然后用3层140目尼龙过滤网过滤，加入0.50％的甲醛，混合均匀，置于37℃作用24小后添加2%吐温80充分混合均匀后，用普通培养基检查杂菌，合格后，保存于阴凉处。
2．禽流感灭活油佐剂组织苗的制备：选用选用10号白油添加3%氢氧化铝混合均匀后加热充分溶解。与步骤1中液体按3:1配比制成。
3．选取无特定传染病的健康高产蛋鸡，将禽流感灭活油佐剂组织苗，给每只鸡皮下注射1.5ml。
4.14-15天后，从鸡翅静脉采集血清检测HI抗体水平扩效价达到16以上，即可收获鸡蛋。
5.将鸡蛋用水清洗干净，浸入新洁而灭溶液中消毒5分钟，捞出擦干后，用75%酒精擦拭，凉干，无菌操作去蛋皮，获取卵黄，然后按1：6加入纯化水，搅拌使卵黄充分分散于水中，形成均质溶液，用0.5mol/L的稀盐酸调节PH值到5.2±0.3，然后使用高速离心机（6000r/min，30min）离心获取上清液，加入20%硫酸钠(100ml上清液加入20g的硫酸钠）搅拌溶解均匀，静置3小时，再用上述离心方法获取沉淀，即为卵黄抗体；然后按1:1比例加入用0.22μm滤膜过滤的生理盐水充分混合均匀。
6．4℃～8℃保存待用。
（三）复合抗体口服制剂制备：
1.超滤、浓缩：将上述（一）和（二）中待用抗体用截流值为80-100KDa的超滤浓缩设备分别加压超滤浓缩至总蛋白浓度为900mg/ml，滤液即为浓缩抗体，然后按1:1的体积比混匀。
2.加入稳定剂：按1升纯化水中加入甘露醇60g、蔗糖粉75g的比例制成澄清溶液。
3.增效剂：用纯化水将N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺溶解，做成6%水溶液。
4.混合：将步骤1、2、3中各成分按2：5：1的体积比混合均匀。
5.除菌：将超滤得到的滤液用孔径为0.22μm的滤膜加压过滤除菌。
6.分装：无菌环境分装，常温密封保存，即得所述复合抗体口服制剂。该制剂的纯度96%，效价2×107。
以下结合具体实验例对本发明的效果作进一步说明。
1.实验动物：选取7日龄体重在100g±5g雏鸡，通过实验室诊断（ELISA检测法）选取患有法氏囊病毒和流感病毒混合感染并有临床症状的病鸡120只。随机分成4组，每组30只，一组为空白对照组，其余三组按不同剂量使用抗体，具体用量如表1所示。
2.实验药物
本发明实施1制备的复合抗体制剂。
3.试验方法
表1实验方法及结果
注：1、抗体使用为每日早晚各一次，连用5天。
2、死亡率、治愈率、保护率以试验第10天为截止日期计算。
结果表明，使用后第2天鸡体内开始有抗体，并在5-10天内维持较高滴度。使用复合抗体各个分组鸡的死亡率和空白对照组死亡率差异显著。即使低剂量抗体使用组鸡的症状也趋于温和。因此，本发明制剂能有效保护禽免受传染性法氏囊病毒和流感病毒侵害，对此类病毒病有极好防治作用。
实施例2
步骤（1）、（2）同实施例1。
（三）复合抗体口服制剂制备：
1.超滤、浓缩：将上述（一）和（二）中待用抗体用截流值为80-100KDa的超滤浓缩设备分别加压超滤浓缩至总蛋白浓度为920mg/ml，滤液即为浓缩抗体，然后按1:1.1的体积比混匀。
2.加入稳定剂：按1升纯化水中加入甘露醇61g、蔗糖粉76g的比例制成澄清溶液。
3.增效剂：用纯化水将N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺溶解，做成6.5%水溶液。
4.混合：将步骤1、2、3中各成分按2.1：4.8：0.9的体积比混合均匀。
5.除菌：将超滤得到的滤液用孔径为0.22μm的滤膜加压过滤除菌。
6.分装：无菌环境分装，常温密封保存，即得所述复合抗体口服制剂。该制剂的纯度95.8%，效价1.8×107。
实施例3
步骤（1）、（2）同实施例1。
（三）复合抗体口服制剂制备：
1.超滤、浓缩：将上述（一）和（二）中待用抗体用截流值为80-100KDa的超滤浓缩设备分别加压超滤浓缩至总蛋白浓度为880mg/ml，滤液即为浓缩抗体，然后按1:0.9的体积比混匀。
2.加入稳定剂：按1升纯化水中加入甘露醇59g、蔗糖粉74g的比例制成澄清溶液。
3.增效剂：用纯化水将N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺溶解，做成5.5%水溶液。
4.混合：将步骤1、2、3中各成分按1.9：5.2：1.1的体积比混合均匀。
5.除菌：将超滤得到的滤液用孔径为0.22μm的滤膜加压过滤除菌。
6.分装：无菌环境分装，常温密封保存，即得所述复合抗体口服制剂。该制剂的纯度95.6%，效价1.6×107。
Claims (4)
1.一种高活性抗鸡法氏囊病毒、流感病毒复合抗体口服制剂，其特征是，由鸡传染性法氏囊炎浓缩抗体、禽流感浓缩抗体、稳定剂和增效剂组成，按体积比鸡传染性法氏囊炎浓缩抗体：禽流感浓缩抗体：稳定剂：增效剂=1:0.8～1.2:4～6:0.8～1.2；所述鸡传染性法氏囊炎浓缩抗体和禽流感浓缩抗体的总蛋白浓度均为900±50mg/ml；所述稳定剂为按1升纯化水中加入甘露醇60±1g、蔗糖粉75±1.5g的比例制成澄清溶液；所述增效剂为用纯化水将N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺溶解制成6±0.5wt%的水溶液；
所述鸡传染性法氏囊炎浓缩抗体的制备方法为：对健康产蛋鸡强化免疫鸡传染性法氏囊炎灭活油佐剂组织苗，当鸡翅静脉采集血清检测抗鸡传染性法氏囊病琼扩效价为16以上时，收集鸡蛋，获得卵黄原液；然后加入其质量5.5～6.5倍的纯化水，搅拌使卵黄充分分散于水中，形成均质溶液，用0.5±0.1mol/L的稀盐酸调节PH值到5.2±0.3，然后使用高速离心机离心获取上清液，上清液加入20%（w/v）的硫酸钠搅拌溶解均匀，静置，再使用高速离心机离心获取沉淀，即为卵黄抗体；然后卵黄抗体加入其质量0.8～1.2倍的滤膜过滤的生理盐水充分混合均匀，加压超滤浓缩，得到总蛋白浓度为900±50mg/ml的鸡传染性法氏囊炎浓缩抗体；
所述禽流感浓缩抗体为：对健康产蛋鸡进行强化免疫禽流感灭活油佐剂组织苗，当鸡翅静脉采集血清检测抗鸡禽流感病琼扩效价为16以上时，收集鸡蛋，获得卵黄原液；然后加入其质量5.5～6.5倍的纯化水，搅拌使卵黄充分分散于水中，形成均质溶液，用0.5±0.1mol/L的稀盐酸调节PH值到5.2±0.3，然后使用高速离心机离心获取上清液，上清液加入20%（w/v）的硫酸钠搅拌溶解均匀，静置，再使用高速离心机离心获取沉淀，即为卵黄抗体；然后卵黄抗体加入其质量0.8～1.2倍的滤膜过滤的生理盐水充分混合均匀，加压超滤浓缩，得到总蛋白浓度为900±50mg/ml的禽流感浓缩抗体。
2.如权利要求1所述的一种高活性抗鸡法氏囊病毒、流感病毒复合抗体口服制剂，其特征是，所述超滤浓缩采用截流值为80-100KDa的超滤浓缩设备。
3.如权利要求1或2所述的一种高活性抗鸡法氏囊病毒、流感病毒复合抗体口服制剂，其特征是，按体积比鸡传染性法氏囊炎浓缩抗体：禽流感浓缩抗体：稳定剂：增效剂=1:1:5:1。
4.权利要求1或2所述的口服制剂的制备方法，其特征是，将鸡传染性法氏囊炎浓缩抗体、禽流感浓缩抗体、稳定剂和增效剂混合均匀；然后将滤液用滤膜加压过滤除菌；最后无菌环境分装，常温密封保存，即得复合抗体口服制剂。
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