CN104606675B - 一种禽用多联特异性卵黄抗体及转移因子的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种禽用多联特异性卵黄抗体及转移因子的制备方法，将多种禽类疾病的疫苗联合免疫产蛋鸡，获得有免疫抗体的鸡蛋，将卵黄组织破碎，离心获得上清液，通过微孔过滤除去脂蛋白和脂肪，收取滤液，经超滤器进行超滤，得到特异性卵黄抗体粗制品和副产物特异性卵黄转移因子生物制品，用有机溶剂沉淀法分离纯化卵黄抗体，最终得到精制多联特异性卵黄抗体。本发明方法操作简单，生产的多联特异性卵黄抗体可预防治疗多种禽病，生产过程还可以产出卵黄转移因子生物制品，具有节能、减排、增产、增效的效果。

Description

一种禽用多联特异性卵黄抗体及转移因子的制备方法

技术领域

本发明属于卵黄抗体制备技术领域，具体涉及一种禽用多联特异性卵黄抗体及转移因子的制备方法。

背景技术

在哺乳动物，转移因子和抗体主要富集在淋巴组织、循环血、胎盘及初乳中，哺乳动物的后代通过胎盘和初乳获得和继承母体的免疫防御能力，进而逐渐建立自身的免疫防御系统。在禽类，转移因子和抗体主要富集于卵黄，通过卵黄把母体的免疫防御能力传递给它们的后代。因此，禽类的卵黄是人工提取卵黄抗体和卵黄转移因子的最佳物质。转移因子和抗体可用以防病治病是早已被人们所共识，与传统的化学药物及抗生素比较，它们的优点是无毒副作用、无药物残留，也不会通过生物链损害人类，是一种节能环保、安全有效的防治手段。卵黄抗体除了具有与哺乳动物产生的抗体相同的功能外，还具有比哺乳动物抗体更优越的特性，它耐酸、耐碱、耐高温，便于贮存和运输，它能抵抗胃酸的破坏，所以注射和口服效果均很好。制备卵黄抗体比制备哺乳动物抗体也有更多优越性。制备卵黄抗体不需杀生、只需取高免鸡蛋，取材方便、成本低、产量高、质量优、无菌化处理较方便，所以用卵黄抗体和卵黄转移因子防病治病，是一条优选免疫防疫途径。

迄今，禽用特异性卵黄抗体和卵黄转移因子及制备方面的专利报道较多，但多数是单一疾病的特异性卵黄抗体及卵黄转移因子，2～3联特异性卵黄抗体及卵黄转移因子有少量报道，4联以上特异性卵黄抗体及卵黄转移因的专利未见报道。现有的专利中，特异性转移因子和特异性卵黄抗体都是单独制备，未见采用同一工艺同时生产卵黄抗体和卵黄转移因子的报道。在制备工艺方面，一般采用反复冻融和研磨法破碎卵黄组织细胞，这种方法费时、费力，难于工业化生产。在转移因子分离提取方面，一般都采用透析法进行提取，这种方法需用透析袋，在4℃无菌蒸馏水中进行，生产周期需要48h甚至更长，也难以进行工业化生产。

发明内容

本发明针对现有技术存在的缺陷，提出了一种禽用多联特异性卵黄抗体及转移因子的制备方法，采用同一工艺流程同时制备出特异性卵黄抗体和卵黄转移因子，达到节能、减排、扩能、增效的目的。

本发明具体通过以下技术方案实现：

一种禽用多联特异性卵黄抗体及转移因子的制备方法，具体包括以下步骤：

1)将禽类疾病的疫苗通过腿部或翅下肌注方法，联合免疫产蛋鸡，第一次免疫后7～10d，进行第二次加强免疫，第二次免疫后5～7d，收集含有免疫抗体的鸡蛋；

2)连续收集高免产蛋鸡的鸡蛋，每隔一个月加强免疫一次，再继续收集鸡蛋，直到产蛋鸡被淘汰；

3)将收集的鸡蛋清洗，放入70％酒精浸泡10min，晾干后分离蛋黄；

4)用高压均质机在60Pa条件下进行卵黄组织破碎，加蒸馏水后搅拌均匀；

5)调节卵黄溶液的PH，离心去除沉淀脂蛋白，收取上清液；

6)上清液经压力微孔过滤进一步除去脂蛋白和脂肪，收取滤液；

7)将以上滤液经超滤器进行超滤，收集被截留的液体为特异性卵黄抗体粗制品，滤液为多联特异性卵黄转移因子生物制品；

8)取卵黄抗体粗提液中加冷酒精，使卵黄抗体粗提液质量浓度为50～60％，充分搅拌使其混浊沉淀，在4000r/min离心20～30min，收集沉淀物；

9)加蒸馏水恢复到所取卵黄抗体粗提液体积，然后加冷酒精使其浓度达到25～30％，充分搅拌使其混浊沉淀，在4000r/min离心20～30min，收集沉淀物，重复两次；

10)收取沉淀物，加适量蒸馏水使其沉淀物溶解或在37℃温箱烤干，即为精制多联特异性卵黄抗体。

本发明所述的疫苗为防治禽流感、新城疫、传染性支气管炎、传染性法氏囊炎、鸡球虫病、鸡白痢、鸭瘟、鸭肝炎、鸡支原体病或鸡大肠杆菌病中多种的混合疫苗。

本发明步骤(1)中所述的含有免疫抗体的鸡蛋为检测得到抗体效价大于1×10^-4的鸡蛋。

本发明步骤(4)中破碎蛋黄组织与蒸馏水的体积比为1:10～30。

本发明步骤(5)具体为使用盐酸和氢氧化钠溶液调节卵黄溶液的PH为5.4～6.0，在3500～4000r/min离心机离心20～30min，去除沉淀脂蛋白，收取上清液。

本发明步骤(6)所述的压力微孔过滤孔径为0.22μm。

本发明步骤(7)中超滤膜截留分子量为10000Da。

本发明的有益效果为：1)本发明生产的多联特异性卵黄抗体，一种产品可预防治疗多种禽病；2)本发明方法生产出多联特异性卵黄抗体的同时，还有卵黄转移因子生物制品副产品的产出，达到更加节能、减排、省时、省力、增产、增效的效果；3)本发明采用高压均质机取代反复冻融研磨工艺破碎组织细胞，用超滤机取代透析法分离转移因子和卵黄抗体，大大缩短生产周期、增加产量、提高质量、更适合大规模工业化生产；4)本发明生产的多联特异性卵黄抗体含量为6～7mg/mL，效价为1×10^-5，远高于目前已获注册批文的同类产品，转移因子多肽类含量为6～7mg/mL，和疫苗配伍使用能提高疫苗的效力2.4倍，远超过国内已获得注册批文的转移因子。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。

应用实施例一

实施例1

一种禽用多联特异性卵黄抗体及转移因子的制备方法，具体包括以下步骤：

1)免疫：将禽类多种重要疾病的疫苗(含禽流感、新城疫、传染性支气管炎、传染性法氏囊炎、鸡球虫病、鸡白痢、鸭瘟、鸭肝炎、鸡支原体病、鸡大肠杆菌病)通过腿部或翅下肌注方法，联合免疫产蛋鸡，第一次免疫后7～10d，进行第二次加强免疫，第二次免疫后5～7d，收集鸡蛋。用ELISA检测卵黄是否产生以上所有疫苗的卵黄抗体以及其滴度，如果有的疫苗没有产生可检抗体，再用该疫苗单独加强免疫一次，第三次加强免疫后第五天，开始收集鸡蛋，检测卵黄抗体，能检测到几种抗体而且其效价在1×10^-4以上的，之后所提取的卵黄抗体和卵黄转移因子，就命名为几联特异性卵黄抗体和特异性卵黄转移因子。

2)取材：连续收集高免产蛋鸡的鸡蛋，每隔一个月加强免疫一次，再继续收集鸡蛋，直到产蛋鸡被淘汰。

3)卵黄分离：将鸡蛋用清水洗净，放入70％酒精浸泡10min杀菌消毒，捞出晾干后，传入洁净间，人工分离蛋黄。

4)蛋黄组织破碎：用高压均质机(60Pa)进行卵黄组织破碎。破碎后，加10～30倍蒸馏水，搅拌均匀。

5)杂蛋白去除：用盐酸溶液和氢氧化钠溶液将卵黄溶液的PH调为各种脂蛋白的等电点(PH为5.4～6.0)，使溶液产生混浊沉淀，在3500～4000r/min离心机离心20～30min，去除沉淀脂蛋白，收取上清。

6)微孔过滤进一步去除脂蛋白：将以上上清液经压力微孔过滤(孔径0.22μm)进一步除去脂蛋白和脂肪，收取滤液。

7)超滤分离转移因子和卵黄抗体：将以上滤液经超滤器进行超滤，超滤膜截留分子量为10000Da。分别收取分子量小于10000Da的滤液和被截留的液体，前者即为多联特异性卵黄转移因子，后者即为特异性卵黄抗体粗制品。

8)用有机溶剂沉淀法分离纯化卵黄抗体：在卵黄抗体粗提液中加冷酒精使其浓度达到50～60％，充分搅拌使其混浊沉淀，在4000r/min离心20～30min，取沉淀物，加蒸馏水恢复到原来体积，然后加冷酒精使其浓度达到25～30％，充分搅拌使其混浊沉淀，同上进行离心，取沉淀物，再加蒸馏水恢复到原来体积，再加酒精使其浓度达20～25％，充分搅拌，使其混浊沉淀，同上进行离心，收取沉淀物，加适量蒸馏水使其沉淀物溶解或在37℃温箱烤干，即为精制多联特异性卵黄抗体。

应用实施例二

下面结合具体的实验对本发明实施例1制备方法所得多联特异性卵黄抗体进行相关检测。

实施例2多联特异性卵黄抗体的检测

1、用定量ELISA法检测卵黄抗体的含量，具体通过以下步骤完成：

1)用包被缓冲液(0.05M pH9.6碳酸盐包被缓冲液)将卵黄抗体标准品和本发明制备的卵黄抗体分别以2ⁿ(平方倍数)稀释至2¹²。

2)将以上2倍系列稀释共12级稀释的卵黄抗体标准品和本发明卵黄抗体产品分别依序加到酶标板反应小孔内，每种12个孔，每孔加100μL，置37℃孵育1小时。

3)弃去小孔内的液体，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟，拍干。

4)加兔抗卵黄抗体的抗体，用抗体稀释液稀释为1:1000，每孔100μL，置37℃孵育0.5～1小时。

5)重复步骤(3)。

6)加HRP标记的羊抗兔IgG抗体(1:1000稀释)，每孔100μL，置37℃孵育0.5～1小时。

7)重复步骤(3)。

8)加显色剂(含0.045％过氧化氢和10～20mg领苯二胺的pH5.0的磷酸-柠檬酸缓冲液)，每孔100μL，在常温避光下显15～20分钟。

9)加终止液，每孔50μL，终止反应。

10)在ELISA检测仪上，于490nm波长处，空白对照组调零后测各孔OD值，若待测孔OD值大于或等于阴性对照孔的2.1倍即为阳性，阴性对照孔无色。检测结果具体见表1：

表1本发明卵黄抗体不同稀释度的OD值

根据表1结果通过曲线专家软件绘制标准曲线，R值达到0.98以上，本发明产品中的卵黄抗体的含量为6～7mg/mL。

2、用间接ELISA法检测本发明生产的卵黄抗体的效价，具体通过以下步骤完成：

1)用包被缓冲液(0.05M pH9.6碳酸盐包被缓冲液)将禽流感、新城疫、传染性支气管炎、传染性法氏囊炎、鸡球虫病、鸡白痢、鸭瘟、鸭肝炎、鸡支原体病和鸡大肠杆菌10种禽病疫苗各1mL进行稀释，使其浓度为免疫接种浓度的1/5，将以上疫苗液加到酶标板的小孔内，每种疫苗加10个小孔，每孔100μL，置37℃孵育0.5～1小时。

2)弃去孔内的疫苗液体，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。

3)用抗体稀释液对200μL本发明生产的卵黄抗体进行10倍系列稀释(10ⁿ)，一至稀释10级(10¹⁰)。将不同稀释度的卵黄抗体依序加到以上酶标板小孔内，每种疫苗加10小孔，每孔100μL，37℃孵育0.5～1小时。

4)重复步骤(2)。

5)加兔抗卵黄抗体(用抗体稀释液稀释1:1000)，每孔100μL，置37℃孵育0.5～1小时。

6)重复步骤(2)。

7)加HRP标记的羊抗兔IgG抗体(1:1000稀释)，每孔100μL，置37℃孵育0.5～1小时。

8)加显色剂(含0.045％过氧化氢液体和10～20mg领苯二胺的pH5.0的磷酸-柠檬酸缓冲液)，每孔100μL，在常温避光静置15～20分钟。

9)加终止液(10.6％硫酸溶液)，每孔50μL。

10)在ELISA检测仪上，于490nm波长处，空白对照调零后，测各孔OD值，若待测孔OD值大于或等于阴性对照孔的2.1倍即为阳性。卵黄抗体中各种病原菌抗体效价具体情况如表2：

表2本发明制备的卵黄抗体不同浓度的反应结果表

由表2显示可知，本发明的卵黄抗体中禽流感、新城疫、传染性支气管炎、传染性法氏囊炎、鸡球虫、鸡白痢、鸭肝炎和鸡支原体病的抗体效价均为1×10^-5，鸭瘟和鸡大肠杆菌的抗体效价为1×10^-4。

3、卵黄抗体中和效价检测

取卵黄抗体500μL，用生理盐水对其进行2倍系列稀释为1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256、1:512、1:1024。取其中三个浓度1:128、1:256、1:512做中和效价实验。用10倍半致死量的新城疫病菌500μL分别和以上三种抗体浓度等体积(500μL)混合，在37℃孵育1小时，取25枚10日龄SPF鸡胚，分成5组：实验组Ⅰ，5枚鸡胚，每枚注射200μL浓度为1:128卵黄抗体和新城疫病菌混合液；实验组Ⅱ5枚，每枚注射200μL浓度为1:256卵黄抗体和新城疫病菌混合液；实验组Ⅲ5枚，每枚注射200μL浓度为1:512卵黄抗体和新城疫病菌混合液；病菌对照组5枚，每枚注射10倍半致死量新城疫病菌和生理盐水混合液200μL；空白对照5枚，每枚注射生理盐水200μL。置37℃恒温箱孵育连续观察7天，计数各组鸡胚死亡数如下表3：

表3中和试验各组鸡胚死亡率

半数保护＝1－实验组死亡率/对照组死亡率＝50％

按以上公式计算，实验组Ⅰ的保护率为80％，实验组Ⅱ的保护率为60％，实验组Ⅲ的保护率为40％。其中实验组Ⅱ的保护率大于而且最接近半数保护，所以实验组Ⅱ卵黄抗体稀释度1:256为本发明卵黄抗体对新城疫的中和效价。

同理，取卵黄抗体1mL，进行2倍系列稀释，取其中三个不同浓度(1:128、1:256、1:512)，每种浓度取500μL，分别和各种相应病原菌10倍半致死量等体积(500μL)混合，混合后置37℃孵育1小时，然后分别注射到5枚10日龄SPF鸡胚，每枚蛋注射200μL，设病菌对照组5枚，每枚注射10倍半致死量病原菌和生理盐水等体积混合液200μL，设空白对照组5枚，每枚注射生理盐水200μL，置37℃孵育，连续观察7天，计数各组的鸡胚死亡数，空白对照组鸡胚应全部存活，病原对照鸡胚应全部死亡，能使50％鸡胚得到保护的最大稀释度即为卵黄抗体的中和效价。经检测本发明的卵黄抗体对禽流感、新城疫、传染性支气管炎、传染性法氏囊炎、鸡球虫病、鸡白痢、鸭瘟、鸭肝炎、鸡支原体病和鸡大肠杆菌十种禽病的中和效价为1:128～1:512。

实施例3卵黄转移因子含量和效力检测

1、卵黄转移因子含量检测

1)标准曲线的制备：按下表对标准牛血清白蛋白(1mg/mL)进行稀释，取8支管，依次编号，每支管添加内容物如表4：

表4

2)将各管液体充分混匀，选用光程为1cm的石英比色杯，将以上各管的液体分别倒入比色杯，在紫外分光光度仪上，在波长280nm处测定各管的吸光度值。以蛋白浓度为横坐标，吸光度值为纵座标绘出标准曲线作为定量依据。该标准曲线横、纵坐标值如表5：

表5

3)将待测卵黄转移因子稀释K(10)倍，在紫外分光光度仪上分别在280nm和260nm处测其吸光度值，结果A280为0.505，A260为0.250。

4)从标准曲线中查A280为0.505，相应蛋白浓度为0.625mg/mL；A260为0.250相应蛋白浓度为0.250mg/mL。

6)将以上数值代入以下公式即可算出待测转移因子的含量：

蛋白质浓度(mg/mL)＝(1.45A280—0.7A260)×K

＝(1.45×0.625—0.7×0.25)×K

＝0.899mg/mL×K

本次检测卵黄转移因子稀释10倍，所以本转移因子其多肽含量为8.99mg/mL。

2、卵黄转移因子效力检测

以新城疫疫苗为例，取10只雄性小白鼠，每只体重8～10g左右，分成实验组和对照组，每组5只小白鼠，实验组在注射疫苗前5天，每天每只腹腔注射卵黄转移因子100ul，对照组每天注射等量生理盐水。第6天两组同时腹腔注射接种新城疫疫苗，每只小鼠100ul，第13天用同样方法再加强免疫一次，第18天剪尾取血，离心取血清，用ELISA方法检测比较两组小鼠产生抗体的反应强度。

具体步骤为：用1/5免疫接种新城疫疫苗的浓度包被酶标板小孔，包被10个小孔，每孔100ul，在37℃孵育1小时。弃去疫苗液，洗剂3次，每次3分钟；用抗体稀释液对两组小鼠的血清进行1:100稀释，然后分别加到以上酶标板小孔内，每孔100ul，在37℃孵育0.5～1小时，弃去小鼠的血清液，用洗涤缓冲液洗涤3次，每次3分钟；加抗小鼠IgG酶标抗体，每孔100ul，在37℃孵育30分钟，弃去小孔内酶标抗体，用洗涤液洗3次，每次3分钟；加显色剂，每孔100ul，在常温避光环境下显色15～20分钟；加终止液终止反应。用酶标仪检测各组反应的OD值，结果如表6：

表6ELISA检测各组OD值结果表

表6可知，对照组小鼠产生抗体的免疫反应OD值均值为0.17±0.02，实验组小鼠产生抗体的免疫反应OD值均值为0.409±0.05，后者为前者的2.4倍。结论：新城疫特异性卵黄转移因子与疫苗配伍使用能显著提高新城疫疫苗的效力。最高可达2.4倍。

后经过申请人对实验证实，禽流感、新城疫、传染性支气管炎、传染性法氏囊炎、鸡球虫病、鸡白痢、鸭瘟、鸭肝炎、鸡支原体病或鸡大肠杆菌特异性卵黄转移因子与疫苗配伍同样可以提高疫苗的效力。

实施例4

徐州市沛县一肉鸭养殖场养鸭2万羽，今年六月发现有鸭死亡，每天死亡50～60羽，经查可能是由鸭瘟、鸭肝炎混合感染所致，试用本发明方法生产的卵黄抗体，按每毫升卵黄抗体50羽的量加到饮水中饲喂，用药后第二天鸭群停止死亡，一直健康到出栏。

实施例5

陕西商洛一产蛋鸡养殖场，养产蛋鸡8000羽，今年5月发现有鸡死亡，每天死4～8羽，经查可能因感染传染性支气管炎所致，试用我们生产的卵黄抗体，按每毫升卵黄抗体1000羽的量加入饮水中饲喂，连用5天。用药后第四天停止死亡，之后鸡群一直健康生长。相邻养殖户，其产蛋鸡仍每天持续有鸡死亡。

Claims (5)

1.一种禽用多联特异性卵黄抗体及转移因子的制备方法，其特征在于，该方法具体包括以下步骤：

1)将禽类疾病的疫苗通过腿部或翅下肌注方法，联合免疫产蛋鸡，第一次免疫后7～10d，进行第二次加强免疫，第二次免疫后5～7d，收集含有免疫抗体的鸡蛋；

2)连续收集高免产蛋鸡的鸡蛋，每隔一个月加强免疫一次，再继续收集鸡蛋，直到产蛋鸡被淘汰；

3)将收集的鸡蛋清洗，放入70％酒精浸泡10min，晾干后分离蛋黄；

4)用高压均质机在60Pa条件下进行卵黄组织破碎，加蒸馏水后搅拌均匀；

5)调节卵黄溶液的PH，离心去除沉淀脂蛋白，收取上清液；

6)上清液经压力微孔过滤进一步除去脂蛋白和脂肪，收取滤液；

7)将以上滤液经超滤器进行超滤，收集被截留的液体为特异性卵黄抗体粗制品，滤液为多联特异性卵黄转移因子生物制品；

8)取卵黄抗体粗提液中加冷酒精，使卵黄抗体粗提液质量浓度为50～60％，充分搅拌使其混浊沉淀，在4000r/min离心20～30min，收集沉淀物；

9)加蒸馏水恢复到所取卵黄抗体粗提液体积，然后加冷酒精使其浓度达到25～30％，充分搅拌使其混浊沉淀，在4000r/min离心20～30min，收集沉淀物，此过程重复两次；

10)收取沉淀物，加适量蒸馏水使其沉淀物溶解或在37℃温箱烤干，即为精制多联特异性卵黄抗体；其中：

步骤(1)中所述的含有免疫抗体的鸡蛋为检测得到抗体效价大于1×10^-4的鸡蛋；

所述的禽类疾病的疫苗为防治禽流感、新城疫、传染性支气管炎、传染性法氏囊炎、鸡球虫病、鸡白痢、鸭瘟、鸭肝炎、鸡支原体病或鸡大肠杆菌病中一种或多种混合疫苗。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(4)中破碎蛋黄组织与蒸馏水的体积比为1:10～30。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(5)具体为使用盐酸和氢氧化钠溶液调节卵黄溶液的PH为5.4～6.0，在3500～4000r/min离心机离心20～30min，去除沉淀脂蛋白，收取上清液。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(6)所述的压力微孔过滤孔径为0.22μm。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(7)中超滤膜截留分子量为10000Da。