CN111087467A - 鸭病毒性肝炎、鸭大舌病二联多价卵黄抗体的制备方法 - Google Patents
鸭病毒性肝炎、鸭大舌病二联多价卵黄抗体的制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111087467A CN111087467A CN202010000064.7A CN202010000064A CN111087467A CN 111087467 A CN111087467 A CN 111087467A CN 202010000064 A CN202010000064 A CN 202010000064A CN 111087467 A CN111087467 A CN 111087467A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- duck
- virus
- yolk
- hepatitis
- hours
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
- 241000272525 Anas platyrhynchos Species 0.000 title claims abstract description 138
- 210000002969 egg yolk Anatomy 0.000 title claims abstract description 64
- 206010019799 Hepatitis viral Diseases 0.000 title claims abstract description 37
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 title claims abstract description 29
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 29
- 208000010798 Tongue disease Diseases 0.000 title claims abstract description 25
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 25
- 235000013345 egg yolk Nutrition 0.000 title claims abstract description 23
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 92
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims abstract description 28
- 238000002649 immunization Methods 0.000 claims abstract description 25
- 201000001862 viral hepatitis Diseases 0.000 claims abstract description 20
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 claims abstract description 15
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 claims abstract description 15
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 claims abstract description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 5
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 claims description 45
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 claims description 35
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 32
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 claims description 26
- 230000036039 immunity Effects 0.000 claims description 25
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 25
- 230000000521 hyperimmunizing effect Effects 0.000 claims description 20
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 19
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 18
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims description 17
- 239000012071 phase Substances 0.000 claims description 15
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 14
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 claims description 14
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 13
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 claims description 12
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 claims description 12
- WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-N octanoic acid Chemical compound CCCCCCCC(O)=O WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 claims description 12
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 claims description 10
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 claims description 10
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 9
- 239000008098 formaldehyde solution Substances 0.000 claims description 9
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims description 9
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims description 9
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims description 9
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 claims description 9
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 claims description 9
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 9
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims description 9
- 238000007865 diluting Methods 0.000 claims description 8
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 7
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 7
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 7
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 claims description 7
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 claims description 7
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 241001651352 Avihepatovirus A Species 0.000 claims description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 6
- NWGKJDSIEKMTRX-AAZCQSIUSA-N Sorbitan monooleate Chemical group CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OC[C@@H](O)[C@H]1OC[C@H](O)[C@H]1O NWGKJDSIEKMTRX-AAZCQSIUSA-N 0.000 claims description 6
- CEGOLXSVJUTHNZ-UHFFFAOYSA-K aluminium tristearate Chemical compound [Al+3].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O CEGOLXSVJUTHNZ-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 6
- 229940063655 aluminum stearate Drugs 0.000 claims description 6
- 238000010009 beating Methods 0.000 claims description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 6
- 230000000249 desinfective effect Effects 0.000 claims description 6
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 6
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 claims description 6
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 claims description 6
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 claims description 6
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 claims description 6
- 210000002976 pectoralis muscle Anatomy 0.000 claims description 6
- 238000007789 sealing Methods 0.000 claims description 6
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 6
- 238000010257 thawing Methods 0.000 claims description 6
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 claims description 6
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 claims description 5
- 238000005070 sampling Methods 0.000 claims description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 4
- 230000017448 oviposition Effects 0.000 claims description 4
- QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 5,5-dimethyl-2,4-dioxo-1,3-oxazolidine-3-carboxamide Chemical compound CC1(C)OC(=O)N(C(N)=O)C1=O QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 206010049244 Ankyloglossia congenital Diseases 0.000 claims description 3
- 239000005635 Caprylic acid (CAS 124-07-2) Substances 0.000 claims description 3
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N Ethylene oxide Chemical compound C1CO1 IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 claims description 3
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 claims description 3
- 229940040526 anhydrous sodium acetate Drugs 0.000 claims description 3
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 claims description 3
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims description 3
- 229960002233 benzalkonium bromide Drugs 0.000 claims description 3
- KHSLHYAUZSPBIU-UHFFFAOYSA-M benzododecinium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)CC1=CC=CC=C1 KHSLHYAUZSPBIU-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- 210000001172 blastoderm Anatomy 0.000 claims description 3
- 229960001701 chloroform Drugs 0.000 claims description 3
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 claims description 3
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims description 3
- 210000003278 egg shell Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000000969 egg white Anatomy 0.000 claims description 3
- 235000014103 egg white Nutrition 0.000 claims description 3
- 238000004945 emulsification Methods 0.000 claims description 3
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 claims description 3
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 claims description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 3
- PNDPGZBMCMUPRI-UHFFFAOYSA-N iodine Chemical compound II PNDPGZBMCMUPRI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 claims description 3
- 229960002446 octanoic acid Drugs 0.000 claims description 3
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 claims description 3
- 238000002791 soaking Methods 0.000 claims description 3
- 210000000115 thoracic cavity Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 3
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 claims description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 claims description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 2
- 238000005728 strengthening Methods 0.000 claims description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 abstract description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 abstract 1
- 241000272517 Anseriformes Species 0.000 description 11
- 210000002105 tongue Anatomy 0.000 description 8
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 4
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 4
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 241001053775 Duck hepatitis virus 3 Species 0.000 description 2
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 2
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 2
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 208000012661 Dyskinesia Diseases 0.000 description 1
- 206010015856 Extrasystoles Diseases 0.000 description 1
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 1
- 206010024642 Listless Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 206010060860 Neurological symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000012356 Product development Methods 0.000 description 1
- 208000005392 Spasm Diseases 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 210000003323 beak Anatomy 0.000 description 1
- 239000003139 biocide Substances 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003640 drug residue Substances 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 208000005252 hepatitis A Diseases 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 208000017971 listlessness Diseases 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000012797 qualification Methods 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 238000003307 slaughter Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
- C07K16/1009—Picornaviridae, e.g. hepatitis A virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/02—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies from eggs
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/081—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from DNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
- A61K2039/507—Comprising a combination of two or more separate antibodies
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Oncology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
本发明提供了一种鸭病毒性肝炎及鸭大舌病的二联多价卵黄抗体的制备方法,该技术方案以鸭肝炎1型病毒SD株、鸭肝3型病毒GQ株、鸭大舌病病毒作为免疫原接种蛋鸡,设计了科学合理的免疫接种方法和接种剂量,使得各抗体均达到了较高的效价水平。在此基础上,本发明以不同抗体的特定效价指标为条件确定了卵黄抗体的提取时机,有效保证了所得卵黄抗体的治疗效果。与此同时,本发明进一步设计了针对性的卵黄抗体提取工艺,所得的二联多价卵黄抗体不仅具有较高的效价,同时对鸭肝炎、鸭大舌病具有确切的预防和治疗效果,该方法的建立填补了卵黄抗体领域对鸭大舌病治疗的技术空白,同时实现了上述两种疾病的同时防治,极具推广前景。
Description
技术领域
本发明属于兽用生物制品技术领域,具体涉及鸭病毒性肝炎、鸭大舌病二联多价卵黄抗体及其制备方法。
背景技术
鸭病毒性肝炎是由鸭肝炎病毒引起的一种高度致死性传染病,以发病急、病程短、发病率和死亡率高为特点。鸭病毒性肝炎分为3个独立的没有血清学关系的血清型:Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型,已成为我国养鸭业防治的重点,对养鸭业的健康发展有巨大影响。
鸭大舌病主要发生在两个日龄段。一是发生肉鸭3~13日龄和21~28日龄,患鸭多表现为上下喙变短,鸭舌弯曲突出外翻,舌头外耷,僵硬而不灵活,严重者影响采食,而且患鸭嘴发生器质性病变后很难恢复,故虽然本病死亡率不高,但感染鸭群料肉比显著升高,出栏合格率下降,给养殖户造成了巨大的经济损失。
两种水禽病目前主要采用化药和疫苗预防,但化药药残、抗药性和疫苗免疫的空窗期影响了养殖户在鸭病毒性肝炎和鸭大舌病的防治意识的提高。卵黄抗体具有性质稳定、特异性强、制备成本低、口服安全等优点,产品的开发具有良好的经济效益和社会效益,在诊断、预防和治疗人类和动物各种疾病中具有良好的应用价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种(1型SD株+3型GQ株)鸭病毒肝炎与鸭大舌病二联多价卵黄抗体的制备方法,该方法安全稳定,成本经济,使用方便,无生物毒性,有利于环境卫生及食品安全。
为达到上述目的,本发明是通过以下技术方案实现的:
一、免疫原抗原的制备
1、病毒的增殖:将(1型SD株+3型GQ株)鸭病毒性肝炎病毒毒株和鸭大舌病病毒毒株分别用灭菌生理盐水稀释至200ELD50/0.1ml,经尿囊腔分别接种10-11日龄易感鸭胚,每胚0.1-0.2ml,置37℃孵育24小时,照胚弃去24小时内的死胚;对接种24小时后的鸭胚,每4小时照胚一次,将死亡胚放2-8℃冰箱;收集24-120小时死亡鸭胚的尿囊液及胚体,匀浆后,反复冻融2次,再以4200r/min离心20-30分钟,收集上清液,分别定量分装于无菌安培瓶中,注明收获日期、毒种代次,冷冻保存备用;
2、接种:用灭菌生理盐水将增殖所得三种病毒毒种分别稀释103-105倍,经尿囊腔接种10-11日龄易感鸭胚,每胚0.1-0.2ml,封孔后,置36-37℃继续孵育120小时,不必翻蛋;
3、孵育:接种后24小时开始照胚,弃去24小时内的死胚,之后每4小时照胚一次,24-120小时死亡的鸭胚随时取出,置于2-8℃冷却12-24小时;
4、收获:将冷却的鸭胚取出,用碘酊消毒气室部位,无菌收集典型病变鸭胚的尿囊液和胎儿,收集时逐个检查胚胎病变,凡胎儿腐败、胚液浑浊或胎儿无鸭甲型肝炎病毒或鸭大舌病所引起的特征性病变者,弃去不用;每个毒种的5-8枚鸭胚的尿囊液和胎儿混为1组,匀浆后反复冻融2次,再以4200r/min离心30分钟,分别取三种病毒上清液置于灭菌容器内,记为A即鸭肝炎1型病毒液、B即鸭肝炎3型病毒液、C即鸭大舌病毒液,均置于-20℃保存备用。
5、病毒液灭活:将ABC三种病毒液分别加入10%的甲醛溶液,随加随摇使其充分混合,使甲醛溶液的终浓度为0.1%,37℃条件下灭活24小时,期间每4小时摇晃一次,灭活完毕,灭活后的病毒液置2~8℃保存,有效期为30日;
二、油乳佐剂免疫原的制备
1、油相制备:10号白油94份、司本-806份、硬脂酸铝2%,硬脂酸铝与少量白油混合加热溶化后,再加入司本-80充分搅拌,补足白油,混匀后分装,116℃30分钟灭菌后备用;
2、水相制备:将鸭肝炎病毒SD株、鸭肝炎病毒GQ株及鸭大舌病抗原按(v/v/v)1:1:1比例配置的灭活病毒液96份、吐温-804份,吐温-80事先加入带玻璃珠的瓶中灭菌,然后加入少量步骤二-1中所得灭活病毒液,震荡使吐温-80完全溶解;最后加入余下的灭活病毒液,充分震荡混匀;
3、配比:按油相与水相3:2(v/v)的比例进行配制,先取3份油相置组织捣碎机内,慢速搅拌的同时缓缓加入2份水相,加完后再以10000r/min搅拌5-8分钟,使混合物充分乳化;乳化后,取样10ml,以3000r/min离心15分钟,如不分层,终止搅拌,无菌操作分装至250ml无菌玻璃瓶中得(1型+3型)鸭病毒性肝炎、鸭大舌病二联病毒油乳佐剂免疫原D,并在玻璃瓶外壁注明名称、制备时间、装量等;
三、高免蛋生产与收集
1、高免蛋的生产:选择健康的未经免疫的产蛋鸡,用步骤(2)中配比后所得(1型+3型)鸭病毒性肝炎、鸭大舌病二联病毒油乳佐剂免疫原D对鸡群进行产蛋前免疫,包括基础免疫、加强免疫、强化免疫、维持免疫;
2、高免蛋收集:强化免疫接种后,从第14日开始,每隔3日抽样高免蛋,按蛋黄与灭菌生理盐水1:3(v/v)稀释,加入与原蛋黄等体积的三氯甲烷,充分振摇,离心分离上清液,即为待测样品E,当三种病毒毒株抗体效价达到一定数值,即为高免蛋最佳收集时间,且收集的高免蛋于10~15℃环境中,放置时间应不超过10日;
而且,所述的高免蛋生产的免疫程序如下:接种健康产蛋鸡,依次进行:
基础免疫:对每只健康产蛋鸡颈背部皮下或胸部肌肉接种1.5ml;
加强免疫:在基础免疫后15日进行第2次接种免疫,每只健康产蛋鸡颈背部皮下或胸部肌肉接种1.5ml;
强化免疫:在加强免疫后15日进行第3次接种免疫,每只健康产蛋鸡颈背部皮下或胸部肌肉接种2.0ml;
维持免疫:以后每隔4周接种一次,皮下注射油乳佐剂免疫原,每只2.0ml。
而且,所述的高免蛋收集的最佳时间为:接种后高免蛋中三种病毒抗体效价分别为1型鸭病毒肝炎SD株和3型GQ株中和抗体效价均≥1:1024时,鸭大舌病AGP效价≥1:128。
四、卵黄抗体的制备
1、蛋壳消毒:清洗干净步骤三-2收集的高免蛋,然后将其浸入0.1%新洁尔灭水溶液中消毒15分钟,取出晾干后,再用环氧乙烷气雾消毒30分钟;
2、蛋黄分离:采取手工打蛋或机械打蛋,打蛋时应充分取出蛋清(白)、胚盘和系带,收集蛋黄;将收集的蛋黄充分搅拌,使蛋黄呈均匀膏状,加入与蛋黄等体积的灭菌注射水,搅拌混匀后,60-65℃保温(灭活)30分钟;
3、酸化萃取:向无菌酸化罐中先加入蛋黄体积6倍的酸化用水(预先用无水乙酸钠及冰乙酸制备,pH值5.0,冷却至4℃);然后,倒入蛋黄分离并灭活后的蛋黄液、边加边搅拌,待蛋黄液的温度降至4℃时,保温静置2-4小时;酸化完成后,离心取上清液,然后向上清液中加入终浓度为0.1%的正辛酸做灭活剂和萃提剂,搅拌,室温放置2-6小时;
4、浓缩:将加辛酸处理好的卵黄液用孔径5μm和1μm的筒式滤芯过滤,再用截留分子量为10kD的中空纤维超滤柱进行浓缩3-4倍,用NaOH调整浓缩液PH值至6.8-7.2,用0.45μm和0.22μm筒式滤芯进行过滤除菌后,按终浓度为0.1%加入甲醛溶液,充分搅拌均匀,密闭灭活2小时后定量分装,加盖密封,2-8℃保存,即得鸭病毒性肝炎、鸭大舌病二联多价卵黄抗体。
本发明的优点及有益效果在于:
1.本发明提供了一种免疫覆盖率高,安全稳定,抗体质量稳定,成本经济,使用方便,无生物毒性,有利于环境卫生及食品安全的精制卵黄抗体。
2.本发明制备的鸭病毒性肝炎、鸭大舌病二联多价卵黄抗体采用了三种免疫原制得而成,可以用于预防和治疗血清1型和3型鸭甲型病毒肝炎及鸭大舌病引起的单种或混合感染的疾病,具有特异性高,针对性强的特点。
具体实施方式
本发明通过以下实施例进一步详述。需要说明的是:下述实施例是说明性的,不是限定性的,不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
本发明所涉及的1型和3型鸭肝炎病毒和鸭大舌病毒三种毒株均为从市场病例野毒中分离得到。
实施例1
1.鸭肝炎病毒1型和3型(SD株和GQ株)和鸭大舌病毒二联油乳佐剂免疫原抗原的制备
1.1 病毒株
生产和检验毒种为血清1型鸭甲型肝炎病毒SD株和3型鸭甲型肝炎GQ株、鸭大舌病病毒均为山东发病鸭群病例中分离鉴定出的野毒株。
1.2 实验用胚
10-11日龄易感鸭胚。
1.3 病毒的增殖
将(1型SD株+3型GQ株)鸭病毒性肝炎病毒毒株和鸭大舌病病毒毒株分别用灭菌生理盐水稀释至200ELD50/0.1ml,经尿囊腔分别接种10-11日龄易感鸭胚,每胚0.1ml,置37℃孵育24小时,照胚弃去24小时内的死胚;对接种24小时后的鸭胚,每4小时照胚一次,将死亡胚放2-8℃冰箱;收集24-120小时死亡鸭胚的尿囊液及胚体,匀浆后,反复冻融2次,再以4200r/min离心20分钟,收集上清液,分别定量分装于无菌安培瓶中,注明收获日期、毒种代次,冷冻保存备用。
1.4 接种
用灭菌生理盐水将增殖所得三种病毒毒种分别稀释103倍,经尿囊腔接种10-11日龄易感鸭胚,每胚0.1ml,封孔后,置37℃继续孵育120小时,不必翻蛋。
1.5 孵育观察
接种后24小时开始照胚,弃去24小时内的死胚,之后每4小时照胚一次,24-120小时死亡的鸭胚随时取出,置于2-8℃冷却12小时。
1.6 收获
将冷却的鸭胚取出,用碘酊消毒气室部位,无菌收集典型病变鸭胚的尿囊液和胎儿,收集时逐个检查胚胎病变,凡胎儿腐败、胚液浑浊或胎儿无鸭甲型肝炎病毒或鸭大舌病所引起的特征性病变者,弃去不用;每个毒种的8枚鸭胚的尿囊液和胎儿混为1组,匀浆后反复冻融2次,再以4200r/min离心30分钟,分别取三种病毒上清液置于灭菌容器内,记为A即鸭肝炎1型病毒液、B即鸭肝炎3型病毒液、C即鸭大舌病毒液,均置于-20℃保存备用。
1.7 病毒液灭活
将ABC三种病毒液分别加入10%的甲醛溶液,随加随摇使其充分混合,使甲醛溶液的终浓度为0.1%,37℃条件下灭活24小时,期间每4小时摇晃一次,灭活完毕,灭活后的病毒液置2~8℃保存,有效期为30日。
1.8 油乳佐剂免疫原的制备
1.8.1 油相制备:10号白油94份、司本-806份、硬脂酸铝2%,硬脂酸铝与少量白油混合加热溶化后,再加入司本-80充分搅拌,补足白油,混匀后分装,116℃30分钟灭菌后备用;
1.8.2 水相制备:按鸭肝炎病毒SD株、鸭肝炎病毒GQ株及鸭大舌病抗原按(v/v/v)1:1:1比例配置的灭活病毒液96份、吐温-804份,吐温-80事先加入带玻璃珠的瓶中灭菌,然后加入少量步骤1.7中所得灭活病毒液,震荡使吐温-80完全溶解;最后加入余下的灭活病毒液,充分震荡混匀;
1.8.3 配比:按油相与水相3:2(v/v)的比例进行配制,先取3份油相置组织捣碎机内,慢速搅拌的同时缓缓加入2份水相,加完后再以10000r/min搅拌5分钟,使混合物充分乳化;乳化后,取样10ml,以3000r/min离心15分钟,如不分层,终止搅拌,无菌操作分装至250ml无菌玻璃瓶中得(1型+3型)鸭病毒性肝炎、鸭大舌病二联病毒油乳佐剂免疫原D,并在玻璃瓶外壁注明名称、制备时间、装量等。
实施例2
1.(1型SD株+3型GQ株)鸭病毒肝炎与鸭大舌病二联多价卵黄抗体的制备
1.1 高免蛋的生产
选择健康的未经免疫的产蛋鸡,用配比后所得(1型+3型)鸭病毒性肝炎、鸭大舌病二联病毒油乳佐剂免疫原D对鸡群进行产蛋前免疫,免疫程序按如下步骤进行:
基础免疫:对每只健康产蛋鸡颈背部皮下或胸部肌肉接种1.5ml;
加强免疫:在基础免疫后15日进行第2次接种免疫,每只健康产蛋鸡颈背部皮下或胸部肌肉接种1.5ml;
强化免疫:在加强免疫后15日进行第3次接种免疫,每只健康产蛋鸡颈背部皮下或胸部肌肉接种2.0ml;
维持免疫:以后每隔4周接种一次,皮下注射油乳佐剂免疫原,每只2ml。
1.2 高免蛋收集
强化免疫接种后,从第14日开始,每隔3日抽样,按蛋黄与灭菌生理盐水1:3(v/v)稀释,加入与原蛋黄等体积的三氯甲烷,充分振摇,离心分离上清液,即为待测样品E,当接种后高免蛋中三种病毒抗体效价分别达到1型鸭病毒肝炎SD株和3型GQ株中和抗体效价均≥1:1024时,鸭大舌病AGP效价≥1:128时,即为高免蛋最佳收集时间,且收集的高免蛋于10~15℃环境中,放置时间应不超过10日。
1.3 卵黄抗体的制备
1.3.1 蛋壳消毒:清洗干净步骤1.2收集的高免蛋,然后将其浸入0.1%新洁尔灭水溶液中消毒15分钟,取出晾干后,再用环氧乙烷气雾消毒30分钟;
1.3.2 蛋黄分离:采取手工打蛋或机械打蛋,打蛋时应充分取出蛋清(白)、胚盘和系带,收集蛋黄;将收集的蛋黄充分搅拌,使蛋黄呈均匀膏状,加入与蛋黄等体积的灭菌注射水,搅拌混匀后,60℃保温(灭活)30分钟;
1.3.3 酸化萃取:向无菌的酸化罐中先加入蛋黄体积6倍的酸化用水(预先用无水乙酸钠及冰乙酸制备,pH值5.0,冷却至4℃);然后,倒入蛋黄分离并灭活后的蛋黄液、边加边搅拌,待蛋黄液的温度降至4℃时,保温静置2-4小时;酸化完成后,离心取上清液,然后向上清液中加入终浓度为0.1%的正辛酸做灭活剂和萃提剂,搅拌,室温放置2小时;
1.3.4 浓缩:将加辛酸处理好的卵黄液用孔径5μm和1μm的筒式滤芯过滤,再用截留分子量为10kD的中空纤维超滤柱进行浓缩4倍,用NaOH调整浓缩液PH值至7.2,用0.45μm和0.22μm筒式滤芯进行过滤除菌后,按终浓度为0.1%加入甲醛溶液,充分搅拌均匀,密闭灭活2小时后定量分装,加盖密封,2-8℃保存,即得鸭病毒性肝炎、鸭大舌病二联多价卵黄抗体。
实施例3
(1型SD株+3型GQ株)鸭病毒肝炎与鸭大舌病二联多价卵黄抗体的效力检验试验
用4-7日龄易感雏鸭100只,随机分为A/B/C/D/E/F/G/H/I/J 10组,每组10只。A/B/C组为接种本发明预防组(攻毒前免疫接种本发明),分别每只皮下注射1.5ml,D/E/F组为攻毒对照组,分别每只皮下注射生理盐水1.5ml,G为健康对照组,不注射任何药品,H/I/J组为接种本发明治疗组,攻毒前也分别每只皮下注射生理盐水1.5ml,10组均进行隔离饲养。A/B/C预防组注射本发明后第5日日同时对10组攻毒,A/D/H组雏鸭各肌肉或皮下注射SD株病毒液0.5ml,(含100LD50),B/E/I组雏鸭各肌肉或皮下注射GQ株病毒液0.5ml(含100LD50),C/F/J组雏鸭各肌肉或皮下注射鸭大舌病毒液0.5ml(含100LD50),攻毒后第3日,H/I组鸭群均出现典型鸭病毒性肝炎症状、J组鸭群鸭大舌病症状明显,立即对三个治疗组鸭群注射本发明,每只接种本发明2ml,连续观察8日,各组统计结果如下表所示:
表 本发明预防和治疗试验情况对照表
从上表可以看出A/B/C本发明预防组鸭群生长正常,未出现鸭病毒性肝炎和鸭大舌病等症状,无死亡病例;H/I/J本发明治疗组在免疫本发明后,患鸭病毒性肝炎和大舌病症状均消失,无死亡病例;D/E/F攻毒对照组鸭群大部分表现精神萎靡,出现神经症状,运动失调,双脚痉挛,病死鸭均成角弓反张姿态,死亡率达50%-60%。
结论
通过本发明所制的鸭病毒性肝炎、鸭大舌病二联多价卵黄抗体进行治疗试验,结果显示能有效预防和治疗鸭病毒性肝炎和鸭大舌病。
Claims (4)
1.一种鸭病毒性肝炎、鸭大舌病二联多价卵黄抗体的制备方法,其特征在于:选取三种基础毒种利用易感鸭胚分别制得免疫原抗原,然后按比例配制呈油乳佐剂免疫原,对未经免疫的健康产蛋鸡进行免疫接种,收集高免蛋,并从其蛋黄中提取鸭病毒性肝炎、鸭大舌病二联多价卵黄抗体。
2.根据权利要求1所述的一种鸭病毒性肝炎、鸭大舌病二联多价卵黄抗体的制备方法,其特征在于包括以下步骤:
(1)免疫原抗原的制备
病毒的增殖:将(1型SD株+3型GQ株)鸭病毒性肝炎病毒毒株和鸭大舌病病毒毒株分别用灭菌生理盐水稀释至200ELD50/0.1ml,经尿囊腔分别接种10-11日龄易感鸭胚,每胚0.1-0.2ml,置37℃孵育24小时,照胚弃去24小时内的死胚;对接种24小时后的鸭胚,每4小时照胚一次,将死亡胚放2-8℃冰箱;收集24-120小时死亡鸭胚的尿囊液及胚体,匀浆后,反复冻融2次,再以4200r/min离心20-30分钟,收集上清液,分别定量分装于无菌安培瓶中,注明收获日期、毒种代次,冷冻保存备用;
接种:用灭菌生理盐水将增殖所得三种病毒毒种分别稀释103-105倍,经尿囊腔接种10-11日龄易感鸭胚,每胚0.1-0.2ml,封孔后,置36-37℃继续孵育120小时,不必翻蛋;
孵育:接种后24小时开始照胚,弃去24小时内的死胚,之后每4小时照胚一次,24-120小时死亡的鸭胚随时取出,置于2-8℃冷却12-24小时;
收获:将冷却的鸭胚取出,用碘酊消毒气室部位,无菌收集典型病变鸭胚的尿囊液和胎儿,收集时逐个检查胚胎病变,凡胎儿腐败、胚液浑浊或胎儿无鸭甲型肝炎病毒或鸭大舌病所引起的特征性病变者,弃去不用;每个毒种的5-8枚鸭胚的尿囊液和胎儿混为1组,匀浆后反复冻融2次,再以4200r/min离心30分钟,分别取三种病毒上清液置于灭菌容器内,记为A即鸭肝炎1型病毒液、B即鸭肝炎3型病毒液、C即鸭大舌病毒液,均置于-20℃保存备用。
病毒液灭活:将ABC三种病毒液分别加入10%的甲醛溶液,随加随摇使其充分混合,使甲醛溶液的终浓度为0.1%,37℃条件下灭活24小时,期间每4小时摇晃一次,灭活完毕,灭活后的病毒液置2~8℃保存,有效期为30日;
(2)油乳佐剂免疫原的配制:
油相制备:10号白油94份、司本-806份、硬脂酸铝2%,硬脂酸铝与少量白油混合加热溶化后,再加入司本-80充分搅拌,补足白油,混匀后分装,116℃30分钟灭菌后备用;
水相制备:将鸭肝炎病毒SD株、鸭肝炎病毒GQ株及鸭大舌病抗原按(v/v/v)1:1:1比例配置的灭活病毒液96份、吐温-804份,吐温-80事先加入带玻璃珠的瓶中灭菌,然后加入少量步骤(1)中所得灭活病毒液,震荡使吐温-80完全溶解;最后加入余下的灭活病毒液,充分震荡混匀;
配比:按油相与水相3:2(v/v)的比例进行配制,先取3份油相置组织捣碎机内,慢速搅拌的同时缓缓加入2份水相,加完后再以10000r/min搅拌5-8分钟,使混合物充分乳化;乳化后,取样10ml,以3000r/min离心15分钟,如不分层,终止搅拌,无菌操作分装至250ml无菌玻璃瓶中得(1型+3型)鸭病毒性肝炎、鸭大舌病二联病毒油乳佐剂免疫原D,并在玻璃瓶外壁注明名称、制备时间、装量等;
(3)高免蛋生产与收集
高免蛋的生产:选择健康的未经免疫的产蛋鸡,用步骤(2)中配比后所得(1型+3型)鸭病毒性肝炎、鸭大舌病二联病毒油乳佐剂免疫原D对鸡群进行产蛋前免疫,包括基础免疫、加强免疫、强化免疫、维持免疫;
高免蛋收集:强化免疫接种后,从第14日开始,每隔3日抽样高免蛋,按蛋黄与灭菌生理盐水1:3(v/v)稀释,加入与原蛋黄等体积的三氯甲烷,充分振摇,离心分离上清液,即为待测样品E,当三种病毒毒株抗体效价达到一定数值,即为高免蛋最佳收集时间,且收集的高免蛋于10~15℃环境中,放置时间应不超过10日;
(4)卵黄抗体的制备
蛋壳消毒:清洗干净步骤(3)中收集的高免蛋,然后将其浸入0.1%新洁尔灭水溶液中消毒15分钟,取出晾干后,再用环氧乙烷气雾消毒30分钟;
蛋黄分离:采取手工打蛋或机械打蛋,打蛋时应充分取出蛋清(白)、胚盘和系带,收集蛋黄;将收集的蛋黄充分搅拌,使蛋黄呈均匀膏状,加入与蛋黄等体积的灭菌注射水,搅拌混匀后,60-65℃保温(灭活)30分钟;
酸化萃取:向无菌的酸化罐中先加入蛋黄体积6倍的酸化用水(预先用无水乙酸钠及冰乙酸制备,pH值5.0,冷却至4℃);然后,倒入蛋黄分离并灭活后的蛋黄液、边加边搅拌,待蛋黄液的温度降至4℃时,保温静置2-4小时;酸化完成后,离心取上清液,然后向上清液中加入终浓度为0.1%的正辛酸做灭活剂和萃提剂,搅拌,室温放置2-6小时;
浓缩:将加辛酸处理好的卵黄液用孔径5μm和1μm的筒式滤芯过滤,再用截留分子量为10kD的中空纤维超滤柱进行浓缩3-4倍,用NaOH调整浓缩液PH值至6.8-7.2,用0.45μm和0.22μm筒式滤芯进行过滤除菌后,按终浓度为0.1%加入甲醛溶液,充分搅拌均匀,密闭灭活2小时后定量分装,加盖密封,2-8℃保存,即得鸭病毒性肝炎、鸭大舌病二联多价卵黄抗体。
3.根据权利要求2所述的鸭病毒性肝炎、鸭大舌病二联多价卵黄抗体的制备方法,其特征在于所述高免蛋生产的免疫程序如下:接种健康产蛋鸡,依次进行:
基础免疫:对每只健康产蛋鸡颈背部皮下或胸部肌肉接种1.5ml;
加强免疫:在基础免疫后15日进行第2次接种免疫,每只健康产蛋鸡颈背部皮下或胸部肌肉接种1.5ml;
强化免疫:在加强免疫后15日进行第3次接种免疫,每只健康产蛋鸡颈背部皮下或胸部肌肉接种2.0ml;
维持免疫:以后每隔4周接种一次,皮下注射油乳佐剂免疫原,每只2.0ml。
4.根据权利要求2所述的鸭病毒性肝炎、鸭大舌病二联多价卵黄抗体的制备方法,其特征在于所述高免蛋收集的最佳时间为:接种后高免蛋中三种病毒抗体效价分别为1型鸭病毒肝炎SD株和3型GQ株中和抗体效价均≥1:1024时,鸭大舌病AGP效价≥1:128。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202010000064.7A CN111087467A (zh) | 2020-01-01 | 2020-01-01 | 鸭病毒性肝炎、鸭大舌病二联多价卵黄抗体的制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202010000064.7A CN111087467A (zh) | 2020-01-01 | 2020-01-01 | 鸭病毒性肝炎、鸭大舌病二联多价卵黄抗体的制备方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN111087467A true CN111087467A (zh) | 2020-05-01 |
Family
ID=70399603
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202010000064.7A Withdrawn CN111087467A (zh) | 2020-01-01 | 2020-01-01 | 鸭病毒性肝炎、鸭大舌病二联多价卵黄抗体的制备方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN111087467A (zh) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN112608382A (zh) * | 2020-12-28 | 2021-04-06 | 哈药集团生物疫苗有限公司 | 鸭呼肠孤病毒病、鸭病毒性肝炎二联卵黄抗体及其制备方法 |
-
2020
- 2020-01-01 CN CN202010000064.7A patent/CN111087467A/zh not_active Withdrawn
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN112608382A (zh) * | 2020-12-28 | 2021-04-06 | 哈药集团生物疫苗有限公司 | 鸭呼肠孤病毒病、鸭病毒性肝炎二联卵黄抗体及其制备方法 |
CN112608382B (zh) * | 2020-12-28 | 2023-08-18 | 哈药集团生物疫苗有限公司 | 鸭呼肠孤病毒病、鸭病毒性肝炎二联卵黄抗体及其制备方法 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN110251671B (zh) | 鹅星状病毒卵黄抗原抗体复合物制备方法 | |
CN102086447B (zh) | 鸭病毒性肝炎毒株及灭活疫苗 | |
CN105950564B (zh) | 番鸭肝炎病毒及应用该病毒制备番鸭肝炎病毒精制卵黄抗体的方法 | |
CN108794627A (zh) | 一种鸭呼肠孤病毒精制卵黄抗体的制备方法 | |
CN111000993B (zh) | 一种鸭病毒性肝炎、鸭呼肠孤病毒病二联灭活疫苗及其制备方法 | |
CN108912227B (zh) | 一种抗鸭呼肠孤病毒的卵黄抗体及其制备方法和应用 | |
CN102492661A (zh) | 防治新型鸭呼肠孤病毒病免疫制剂的制备方法及应用 | |
CN105949307B (zh) | 一种用于防治番鸭源小鹅瘟的卵黄抗体 | |
CN103833848B (zh) | 一种用于预防治疗番鸭细小病毒病的卵黄抗体 | |
CN106729690A (zh) | 鸡新城疫、禽流感病毒和禽腺病毒三联灭活疫苗的制备方法 | |
CN104258389B (zh) | 一种疫苗组合物及其制备方法和应用 | |
CN103495167B (zh) | 一种鸡传染性法氏囊病复合活疫苗的制备方法 | |
CN113493507B (zh) | 新型鸭呼肠孤病毒卵黄抗体及其制备方法和应用 | |
CN106563125B (zh) | 鸭甲肝病毒ⅲ型复合物活疫苗及其制备方法 | |
CN111087467A (zh) | 鸭病毒性肝炎、鸭大舌病二联多价卵黄抗体的制备方法 | |
CN105920596B (zh) | 一种番鸭细小病毒病、小鹅瘟二联疫苗 | |
CN105585632A (zh) | 肉鸭细小病毒精制卵黄抗体 | |
CN104984337B (zh) | 一种鸡新城疫、禽流感抗原抗体复合物灭活疫苗及其制备方法 | |
CN109055320B (zh) | 一株传染性支气管炎病毒分离株及在疫苗制备中的应用 | |
CN112608382B (zh) | 鸭呼肠孤病毒病、鸭病毒性肝炎二联卵黄抗体及其制备方法 | |
CN105693854A (zh) | 一种鸭坦布苏病毒精制卵黄抗体的制备方法 | |
CN112552398B (zh) | 一种鸭病毒性肝炎卵黄抗体及其制备方法 | |
CN111087466A (zh) | 新城疫、鸭大舌病二联卵黄抗体的制备方法 | |
CN108295053A (zh) | 五味子醇甲在增强pedv疫苗免疫应答中的应用 | |
CN107982532B (zh) | 一种鸭甲肝病毒抗原抗体复合物疫苗及其制备方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
WW01 | Invention patent application withdrawn after publication |
Application publication date: 20200501 |
|
WW01 | Invention patent application withdrawn after publication |