CN105693854A - 一种鸭坦布苏病毒精制卵黄抗体的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鸭坦布苏病毒精制卵黄抗体的制备方法，包括如下步骤：抗原制备；鸭坦布苏病毒转移因子-白细胞介素2佐剂灭活疫苗的制备；高免鸡蛋的生产；消毒；分离卵黄；抗体萃取；过滤得到成品。利用本发明制备方法制备出的卵黄抗体，当鸭坦布苏病毒卵黄中和抗体效价≥1:512时，用药1次，2天后可控制死亡，3天后病鸭即可恢复正常采食量，临床发病症状消失，配合抗生素来控制细菌继发感染效果更佳；商品雏鸭愈后发育良好，不影响经济价值；商品蛋鸭和种鸭及时治疗时，采食量恢复正常7天后的产蛋率平均回升5～13％，鸭坦布苏病毒精制卵黄抗体为临床治疗鸭坦布苏病毒提供了有效手段。

Description

一种鸭坦布苏病毒精制卵黄抗体的制备方法

技术领域

本发明涉及生物制药领域，具体涉及一种鸭坦布苏病毒精制卵黄抗体的制备方法。

背景技术

2010年以来，国内部分地区鸭流行一种以临床症状为脚麻痹、采食量下降、拉黄绿色稀便、产蛋骤降和神经症状，剖检症状为心肌坏死、肝脏萎缩、脾脏肿大出血、肠道轻微出血和出血性卵巢炎等为特征的疾病，病原鉴定为鸭坦布苏病毒(临床通称为黄病毒)，属于黄病毒科黄病毒属蚊媒病毒类恩塔亚病毒群，是单股正链RNA病毒。该病毒对各种品系的鸭均致病，雏鸭最早发病日龄为7日龄、20～40日龄及产蛋期高发，该病用常规抗病毒及抗菌治疗疗效不佳，死淘率5～15％，继发细菌感染时死淘率更高，恢复采食量需15天以上，商品鸭、产蛋鸭愈后发育不良及产蛋率恢复差，该病目前无疫苗用于预防，对鸭养殖业造成巨大经济损失。

发明内容

针对以上现有技术的不足，提供一种安全性好，治疗鸭坦布苏病毒病效果显著的鸭坦布苏病毒精制卵黄抗体的制备方法。

本发明还提供了所述鸭坦布苏病毒精制卵黄抗体在治疗鸭坦布苏病毒病方面的应用。

实现本发明的技术方案为：一种鸭坦布苏病毒精制卵黄抗体的制备方法，包括如下步骤：

(1)抗原制备：鸭坦布苏病毒用生理盐水10000倍稀释，经尿囊腔接种11日龄易感鸭胚，收集接种48～120小时死亡鸭胚尿囊液，无菌检验合格，即为抗原；

(2)鸭坦布苏病毒转移因子-白细胞介素2佐剂灭活疫苗的制备：抗原加终浓度为0.1％甲醛，37℃灭活24小时，期间振摇；于4℃离心30分钟；收集上清液，将所述上清液浓缩15倍，然后将浓缩液转入灭菌容器，于4℃保存；往浓缩抗原中加入转移因子和鸭白细胞介素2，使转移因子(按多肽计算)终浓度为2mg/ml，鸭白细胞介素2终浓度为4μg/ml，即为鸭坦布苏病毒转移因子-白细胞介素2佐剂灭活疫苗；

(3)高免鸡蛋的生产：选择健康的产蛋鸡，用步骤(2)中所述鸭坦布苏病毒转移因子-白细胞介素2佐剂灭活疫苗对鸡群进行产蛋前免疫，当鸭坦布苏病毒卵黄中和抗体效价应≥1:640为合格，然后收集高免鸡蛋；

(4)消毒：将所述高免鸡蛋浸入40℃、0.1％新洁尔灭水溶液中消毒15～20分钟，然后再将所述高免鸡蛋用福尔马林密闭熏蒸消毒30分钟；

(5)分离卵黄：除去蛋清、胚盘和系带、收集卵黄；

(6)抗体萃取：搅拌使卵黄呈均匀膏状，装入搅拌罐中，按体积比1:1加入25℃的灭菌注射用水，调节pH至4.3；于转速为200转/分钟，搅拌30分钟；

将卵黄液转入不锈钢桶中，加入终浓度为4％正辛酸，搅拌30分钟，室温放置12～24小时；用40目滤网撇去漂浮在上层的蛋黄，用80目滤布过滤，收集滤液，滤出液和下层液体合并，用板框过滤器加滤板和0.4微米滤膜过滤，即为抗体半成品；

将抗体半成品转入用0.2％甲醛溶液消毒的冰柜中，4℃冷藏5小时，使残留的辛酸结晶凝结析出，用80目滤网撇去浮在上层的辛酸结晶，液调pH至7.0，再后用磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液调节pH至6.9，即为抗体半成品；

(7)过滤：抗体半成品用过滤精度0.2μm的筒式滤芯过滤除菌，无菌操作分装，即得到鸭坦布苏病毒精制卵黄抗体。

优选地，所述步骤(7)中鸭坦布苏病毒卵黄中和抗体效价≥1:512。

优选地，所述步骤(1)中，鸭胚接种为0.1ml/胚。

优选地，所述步骤(2)中振摇次数为4次，每次3分钟。

作为优选，所述步骤(2)中离心转速为4000转/分钟。

优选地，所述步骤(2)中浓缩是用截留分子量为6000道尔顿的中空纤维超滤器。

优选地，所述步骤(3)的免疫程序如下：接种100～110日龄商品蛋鸡，依次进行：

基础免疫：每只鸡腿部肌肉注射0.5ml；

加强免疫：在基础免疫后21日进行第2次接种，每只鸡胸部肌肉注射1.5ml；

强化免疫：在加强免疫后15日进行第3次接种，每只鸡颈背部皮下注射2.0ml；

维持免疫：当卵黄中鸭坦布苏病毒卵黄中和抗体效价临界1:640时，维持接种1次，每只鸡颈背部皮下注射疫苗2.0ml。

本发明还提供了所述鸭坦布苏病毒精制卵黄抗体在治疗鸭坦布苏病毒病方面的应用。

优选地，所述鸭坦布苏病毒精制卵黄抗体在治疗鸭坦布苏病毒病方面的应用，包括：皮下或肌肉注射，8日龄以内雏鸭按0.5～0.8ml/只；9～15日龄雏鸭按1.0ml/只；16日龄以上按1.0ml/kg体重。

优选地，所述鸭坦布苏病毒精制卵黄抗体在治疗鸭坦布苏病毒病方面的应用，还包括配合抗生素来控制细菌继发感染。

与现有技术相比本发明的有益效果在于：目前鸭坦布苏病毒病无疫苗用于预防，临床发病后，按常规抗病毒结合抗菌的治疗方案，效果不佳，治愈率低于40％，鸭群呈持续发病状态，每天死亡率1-2％，采食量低于正常量的1/2，商品肉鸭发育受阻，与正常鸭比较，料肉比高20％以上，出栏时间延长15天以上，发育不整齐，品相不佳；商品蛋鸭和种鸭产蛋期发病时，常规治疗不佳时导致病程较长，卵泡和输卵管受损严重，种公鸭生殖器萎缩，产蛋率和种蛋受精率锐减，当因为长期维持低采食量时，蛋鸭会换羽，导致整群鸭大部分停产，严重影响经济效益。

本发明制备的鸭坦布苏病毒精制卵黄抗体，用于治疗，按照使用说明剂量，用药1次，2天后可控制死亡、采食量恢复正常量的90％，3天后病鸭即可恢复正常采食量，临床发病症状消失，配合抗生素来控制细菌继发感染效果更佳。商品雏鸭愈后发育良好，不影响经济价值；商品蛋鸭和种鸭及时治疗时，采食量恢复正常7天后的产蛋率平均回升5～13％。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明抗原用种病毒属于黄病毒科黄病毒属蚊媒病毒的恩塔亚病毒群,和坦布苏病毒亲缘关系最近,暂定为该病毒的一个分离株,故该病又称为鸭坦布苏病毒病。来源：《中国家禽》2012年第02期一例蛋鸭黄病毒病的诊治，作者：唐维国；施少华；傅光华；韦启鹏；刘林秀；季华员；林建生；黄瑜。

本实施例鸭坦布苏病毒精制卵黄抗体的制备方法包括如下步骤：

1.鸭坦布苏病毒转移因子-白细胞介素2佐剂灭活疫苗制备

1.1抗原制备

鸭坦布苏病毒用生理盐水10000倍稀释，经尿囊腔接种11日龄易感鸭胚，0.1ml/胚，收集接种48～120小时死亡鸭胚尿囊液，无菌检验合格，即为抗原，于-40℃保存，同时取样用于鉴定。

1.2抗原鉴定

1.2.1病毒含量

抗原用生理盐水10倍系列稀释，取10^-4、10^-5、10^-6和10^-74个稀释度接种9日龄易感鸭胚，每个稀释度各接种5枚，0.1ml/胚，用蜡封孔，于37.5℃静置孵化，24小时以前死亡的鸭胚弃去不计，收集24～168小时死亡鸭胚，按Reed-Muench法计算病毒含量为10^-6.50ELD₅₀/0.1ml。

1.2.2纯净性

抗原按照现行《中华人民共和国兽药典》进行细菌、支原体和外源病毒检验合格。

1.2.3特异性

抗原用生理盐水稀释至200ELD₅₀/0.1ml，与等量抗鸭坦布苏病毒特异性血清混合，37℃水浴中和1小时，尿囊腔接种9日龄易感鸭胚10枚，0.1ml/胚；同时设病毒对照10枚，接种同条件处理的病毒与生理盐水混合液0.1ml/枚，上述鸭胚用蜡封孔，于37℃静置孵育，观察至168小时，中和组鸭胚全部健活，对照组鸭胚全部死亡，说明抗原能被抗鸭坦布苏病毒特异性血清中和。

1.2.4免疫原性

1.2.4.1抗原灭活

抗原加终浓度为0.1％甲醛，37℃灭活24小时，期间振摇4次，每次3分钟。

1.2.4.2灭活检验

1.2.4.2.1无菌按照现行《中华人民共和国兽药典》检验，无细菌生长。

1.2.4.2.2安全检验灭活抗原皮下或肌肉注射4～5周龄商品蛋鸡10只，2.0ml/每只，饲养观察14日，不出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应。

1.2.4.2.3免疫接种

灭活抗原按如下免疫程序接种100～110日龄商品蛋鸡5只，同时设5只对照，不做任何处理，免疫程序如下：

基础免疫每只鸡腿部肌肉注射0.5ml；

加强免疫在基础免疫后21日进行第2次接种，每只鸡胸部肌肉注射1.5ml；

强化免疫在加强免疫后15日进行第3次接种，每只鸡颈背部皮下注射2.0ml；

1.2.4.2.4抗体效价检测

强化免疫后14日宰杀试验组和对照组的鸡，分别分离血清，按组混合，按现行《中华人民共和国兽药典》的中和试验法检测血清中鸭坦布苏病毒特异性抗体效价。结果为：试验组中和抗体效价为1:320，对照组中和抗体效价＜1:4，结果说明抗原的免疫原性良好。

1.3鸭坦布苏病毒转移因子-白细胞介素2佐剂灭活疫苗制备

抗原加终浓度为0.1％甲醛，37℃灭活24小时(期间振摇4次，每次3分钟)。于4℃经4000转/分钟离心30分钟，收集上清液，上清液用截留分子量为6000道尔顿的中空纤维超滤器浓缩15倍，浓缩液转入灭菌容器，于4℃保存。

浓缩抗原加入转移因子和鸭白细胞介素2，使转移因子(按多肽计算)终浓度为2mg/ml，鸭白细胞介素2终浓度为4μg/ml，即为鸭坦布苏病毒转移因子-白细胞介素2佐剂灭活疫苗，无菌操作分装，于2～8℃保存。取样按1.2.4.2进行无菌和安全性检验合格。

2.鸭坦布苏病毒精制卵黄抗体制造及检验

2.1高免鸡蛋的生产

2.1.1产蛋鸡应具有商品蛋鸡的生产性能。

2.1.1.1按鸡群0.5％抽样采血，分别按ELISA和AGP法检测抗体，全部为阴性.

2.1.1.2鸡白痢和鸡支原体按NY/T536-2002《鸡伤寒和鸡白痢诊断技术》和NY/T553-2002《禽支原体病诊断技术》进行检测，鸡白痢和鸡支原体感染阳性率应≤0.1％。

2.1.1.3产蛋鸡的饲养管理鸡场建设必须符合兽医卫生防疫规范要求。鸡场应离交通要道500米以上，进、出口道路应分开；场内料、粪道路分开，鸡场进出口应设有消毒池，育雏舍与成鸡舍应设隔离带。此外，鸡场应具备粪污处理设施，实施全进全出制，鸡场饮水应达到卫生标准，饲养人员应卫生健康。

2.1.1.4鸡的疫病防治根据当地疫病发生的实际情况，按科学免疫程序适时接种相关疫苗，根据情况需要，适时、适量投喂抗生素和抗球虫药品等。

2.1.1.5鸡的日龄100～120日龄。

2.1.2鸭坦布苏病毒转移因子-白细胞介素2佐剂灭活疫苗免疫

鸭坦布苏病毒转移因子-白细胞介素2佐剂灭活疫苗按如下免疫程序接种100～110日龄商品蛋鸡5只，免疫程序如下：

基础免疫每只鸡腿部肌肉注射0.5ml；

加强免疫在基础免疫后21日进行第2次接种，每只鸡胸部肌肉注射1.5ml；

强化免疫在加强免疫后15日进行第3次接种，每只鸡颈背部皮下注射2.0ml；

维持免疫：当卵黄中鸭坦布苏病毒卵黄中和抗体效价临界1:640时，维持接种1次，每只鸡颈背部皮下注射疫苗2.0ml。

2.1.3收蛋强化免疫后7日，抽样取蛋，分离卵黄，按卵黄生理盐水体积比1:3稀释，搅拌均匀，加入终浓度20％氯仿，剧烈振摇20分钟，于4℃离心30分钟，取上清，过滤除菌，按现行《中国兽药典》检测鸭坦布苏病毒卵黄中和抗体效价应≥1:640为合格，收集高免鸡蛋，8～12℃贮存，不超过10日。

2.2抗体制备

2.2.1消毒

高免鸡蛋摆入塑料蛋盘，浸入40℃、0.1％新洁尔灭水溶液中消毒15～20分钟。而后将高免鸡蛋用福尔马林密闭熏蒸消毒30分钟。

2.2.2分离卵黄

手工或机械打蛋，除去蛋清(白)、胚盘和系带，收集卵黄。

2.2.3抗体萃取

充分搅拌使卵黄呈均匀膏状，装入500L搅拌罐中，按体积比1:1加入25℃左右的灭菌注射用水(用0.2M盐酸调节pH至4.3)，200转/分钟，搅拌30分钟，将卵黄液转入不锈钢桶中，加入终浓度为4％正辛酸，用转头装有桨叶的电转搅拌30分钟，室温放置12～24小时，用40目滤网撇去漂浮在上层的蛋黄，用80目滤布过滤，收集滤液，滤出液和下层液体合并，用板框过滤器加滤板和0.4微米滤膜过滤，即为抗体半成品，将抗体半成品转入用0.2％甲醛溶液消毒的500L冰柜中，4℃冷藏5小时，使残留的辛酸结晶凝结析出，用80目滤网撇去浮在上层的辛酸结晶，用0.2M氢氧化钠溶液调pH至7.0，再后用磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液调节pH至6.9，即为抗体半成品。

2.2.4过滤

抗体半成品用过滤精度0.2μm的筒式滤芯过滤除菌，无菌操作分装，装量为250ml/瓶，即为鸭坦布苏病毒精制卵黄抗体。

2.3抗体检验

2.3.1纯净性

按照现行《中华人民共和国兽药典》进行检测，无细菌、支原体和外源病毒污染。

2.3.2效价检测

按照现行《中华人民共和国兽药典》进行检测，鸭坦布苏病毒卵黄中和抗体效价≥1:512。

2.3.3安全性检验

5日龄健康鸭雏10只，每只皮下注射1.0ml，观察14日，全部健活。

2.3.4辛酸和甲醛残留按照现行《中华人民共和国兽药典》进行检测，符合规定。

3.鸭坦布苏病毒精制卵黄抗体质量标准

无菌检验：按现行《中华人民共和国兽药典》检测，无细菌生长。

支原体检验：按现行《中华人民共和国兽药典》检测，无支原体生长。

外源病毒检验：按现行《中华人民共和国兽药典》检测，无外源病毒污染。

安全检验：5日龄健康雏鸭10只，每只皮下注射本品1.0ml，连续观察14日，雏鸭全部健活。

甲醛残留：按现行《中华人民共和国兽药典》检测，符合规定。

辛酸残留：按现行《中华人民共和国兽药典》检测，符合规定。

4.鸭坦布苏病毒精制卵黄抗体在鸭坦布苏病毒病使用情况

用法与用量如下：皮下或肌肉注射，其中8日龄以内雏鸭按0.5～0.8ml/只，9～15日龄雏鸭按1.0ml/只，16日龄以上按1.0ml/kg体重；有细菌继发感染时，配合兽用头孢类抗生素使用，抗生素用量参照其使用说明。

本发明制备的鸭坦布苏病毒精制卵黄抗体，用于治疗鸭坦布苏病毒病，按照使用说明剂量，用药1次，2天后可控制死亡、采食量恢复正常量的90％，3天后病鸭即可恢复正常采食量，临床发病症状消失，配合抗生素来控制细菌继发感染效果更佳。商品雏鸭愈后发育良好，不影响经济价值；商品蛋鸭和种鸭及时治疗时，采食量恢复正常7天后的产蛋率平均回升5～13％。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种鸭坦布苏病毒精制卵黄抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)抗原制备：鸭坦布苏病毒用生理盐水10000倍稀释，经尿囊腔接种11日龄易感鸭胚，收集接种48～120小时死亡鸭胚尿囊液，无菌检验合格，即为抗原；

(2)鸭坦布苏病毒转移因子-白细胞介素2佐剂灭活疫苗的制备：抗原加终浓度为0.1％甲醛，37℃灭活24小时，期间振摇；于4℃离心30分钟；收集上清液，将所述上清液浓缩15倍，然后将浓缩液转入灭菌容器，于4℃保存；往浓缩抗原中加入转移因子和鸭白细胞介素2，使转移因子(按多肽计算)终浓度为2mg/ml，鸭白细胞介素2终浓度为4μg/ml，即为鸭坦布苏病毒转移因子-白细胞介素2佐剂灭活疫苗；

(3)高免鸡蛋的生产：选择健康的产蛋鸡，用步骤(2)中所述鸭坦布苏病毒转移因子-白细胞介素2佐剂灭活疫苗对鸡群进行产蛋前免疫，当鸭坦布苏病毒卵黄中和抗体效价应≥1:640为合格，然后收集高免鸡蛋；

(4)消毒：将所述高免鸡蛋浸入40℃、0.1％新洁尔灭水溶液中消毒15～20分钟，然后再将所述高免鸡蛋用福尔马林密闭熏蒸消毒30分钟；

(5)分离卵黄：除去蛋清、胚盘和系带、收集卵黄；

(6)抗体萃取：搅拌使卵黄呈均匀膏状，装入搅拌罐中，按体积比1:1加入25℃的灭菌注射用水，调节pH至4.3；于转速为200转/分钟，搅拌30分钟；

将卵黄液转入不锈钢桶中，加入终浓度为4％正辛酸，搅拌30分钟，室温放置12～24小时；用40目滤网撇去漂浮在上层的蛋黄，用80目滤布过滤，收集滤液，滤出液和下层液体合并，用板框过滤器加滤板和0.4微米滤膜过滤，即为抗体半成品；

将抗体半成品转入用0.2％甲醛溶液消毒的冰柜中，4℃冷藏5小时，使残留的辛酸结晶凝结析出，用80目滤网撇去浮在上层的辛酸结晶，液调pH至7.0，再后用磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液调节pH至6.9，即为抗体半成品；

(7)过滤：抗体半成品用过滤精度0.2μm的筒式滤芯过滤除菌，无菌操作分装，即得到鸭坦布苏病毒精制卵黄抗体。

2.根据权利要求1所述鸭坦布苏病毒精制卵黄抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤(7)中鸭坦布苏病毒卵黄中和抗体效价≥1:512。

3.根据权利要求1所述鸭坦布苏病毒精制卵黄抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，鸭胚接种为0.1ml/胚。

4.根据权利要求1所述鸭坦布苏病毒精制卵黄抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中振摇次数为4次，每次3分钟。

5.根据权利要求1所述鸭坦布苏病毒精制卵黄抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中离心转速为4000转/分钟。

6.根据权利要求1所述鸭坦布苏病毒精制卵黄抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中浓缩是用截留分子量为6000道尔顿的中空纤维超滤器。

7.根据权利要求1所述鸭坦布苏病毒精制卵黄抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)的免疫程序如下：接种100～110日龄商品蛋鸡，依次进行：

基础免疫：每只鸡腿部肌肉注射0.5ml；

加强免疫：在基础免疫后21日进行第2次接种，每只鸡胸部肌肉注射1.5ml；

强化免疫：在加强免疫后15日进行第3次接种，每只鸡颈背部皮下注射2.0ml；

维持免疫：当卵黄中鸭坦布苏病毒卵黄中和抗体效价临界1:640时，维持接种1次，每只鸡颈背部皮下注射疫苗2.0ml。

8.权利要求1至7中任一项所述鸭坦布苏病毒精制卵黄抗体在治疗鸭坦布苏病毒病方面的应用。

9.根据权利要求8所述鸭坦布苏病毒精制卵黄抗体在治疗鸭坦布苏病毒病方面的应用，其特征在于，包括：皮下或肌肉注射，8日龄以内雏鸭按0.5～0.8ml/只；9～15日龄雏鸭按1.0ml/只；16日龄以上按1.0ml/kg体重。

10.根据权利要求8或9所述鸭坦布苏病毒精制卵黄抗体在治疗鸭坦布苏病毒病方面的应用，其特征在于，还包括配合抗生素来控制细菌继发感染。