CN109692329B - 一种鸭星状病毒疫苗及其制备方法 - Google Patents

一种鸭星状病毒疫苗及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种鸭星状病毒疫苗，其是在传代细胞系BHK‑21细胞上接种鸭星状病毒Ⅰ型和Ⅲ型毒种得到的灭活疫苗。用BHK‑21传代细胞进行鸭星状病毒Ⅰ型和Ⅲ型增殖，利用Reed‑Muench方法测定其病毒滴度可以稳定达到106.5‑107.0TCID50/0.1mL。抗原的稳定生产和高滴度是制备疫苗最关键因素，用BHK‑21细胞进行鸭星状病毒Ⅰ型和Ⅲ型增殖其病毒滴度是常规鸭胚法及原代细胞法的10倍以上，如采用生物反应器进行病毒增殖，其病毒滴度可以达到100倍水平。本专利公开的鸭星状病毒(Ⅰ型+Ⅲ型)灭活疫苗，产量高，品质稳定，免疫鸭能产生高水平血清中和抗体，免疫效果好，具有巨大的应用前景。

Description

一种鸭星状病毒疫苗及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种鸭星状病毒疫苗及其制备方法。
背景技术
星状病毒是一种感染哺乳动物及禽类的病毒，近年来，同其它病毒混合感染现象越来越普遍，临床症状要比单纯星状病毒的感染严重很多，给人类和动物的健康带来了极大的威胁。星状病毒科分为两个属，哺乳动物星状病毒属和禽星状病毒属，禽星状病毒属包括鸭星状病毒，其是鸭病毒性肝炎(Duck viral hepatitis,DHV)的主要致病原之一，鸭星状病毒可引起鸭肝炎，病雏鸭常呈角弓反张，肾脏常常肿大，肝脏广泛出血，鸭群致死率可达50％。因其可导致雏鸭出现高死亡率，是危害养鸭业的重要传染病。
目前尚没有鸭星状病毒疫苗上市，也没有相关的药物控制该病毒导致的疾病，DHV的发生常给养鸭业造成重大经济损失。
发明内容
本发明要解决的技术问题是有效预防鸭星状病毒。
为解决上述技术问题，本发明公开一种鸭星状病毒疫苗，其是在传代细胞系BHK-21细胞上接种鸭星状病毒Ⅰ型和Ⅲ型毒种得到的灭活疫苗。
所述鸭星状病毒疫苗的制备方法，其包括如下步骤：
(1)BHK-21细胞的传代与培养：BHK-21细胞经EDTA-胰酶细胞分散液消化传代，以细胞生长液继续培养，形成细胞单层时，用于继续传代或接种病毒；
(2)病毒的接种和培养：取已形成单层的上述细胞，弃去细胞生长液，接种细胞维持液，分别将鸭星状病毒Ⅰ型和Ⅲ型毒种按终体积1:100～1:1000接种到制备的细胞，吸附后吸弃病毒液，在用培养液培养至细胞出现病变时收获；
(3)病毒的收集、浓缩、纯化：将上述接种的病变细胞冻融，离心后收集上清液得到病毒原液；通过超滤浓缩上述病毒液即为制苗病毒液；
(4)病毒灭活：采用0.1％福尔马林灭活病毒，即为疫苗抗原；
(5)使用疫苗抗原配置疫苗制剂。
优选所述步骤(1)中的细胞生长液为含5～10％新生牛血清的DMEM培养液,所述细胞生长液中可含双抗。所述步骤(2)所述细胞维持液为无血清的DMEM培养液，毒种接种到细胞后在37℃吸附30～60分钟后吸弃病毒液，接毒后在培养液中培养条件为37℃、5％CO2，所述培养液为含1～2％新生牛血清的DMEM培养液。细胞维持液中可含有2mM的谷氨酰胺。所述步骤(3)中所述制苗病毒液每0.1mL病毒大于含量106.5TCID50。所述步骤(1)中BHK-21细胞在转瓶内或在微载体反应器中培养。
所述步骤(5)配置疫苗制剂包括如下步骤：
a)水相制备：取检验合格的疫苗抗原96份加入灭菌后的吐温-80 4份，开始搅拌，使吐温-80完全溶解为止，制成水相；
b)油相制备：取优质注射用白油94份，硬脂酸铝2份，司班-80 4份，先将白油缓慢加温，按4％和2％加入司班-80和硬脂酸铝，边搅边加温，直到硬脂酸铝充分溶解至透明为止，高压灭菌备用；
c)乳化：利用IKA乳化机进行乳化，16000rpm，乳化5分钟即可；
d)分装：将制备的疫苗按照每瓶250mL进行分装。
本发明所公开鸭星状病毒疫苗采用病毒高适应性的传代细胞系BHK-21细胞进行疫苗生产,该工艺具备以下优势：
1.细胞背景清楚，无外源病原，易增殖性，非常适用生物反应器进行大规模培养，这符合未来疫苗生产趋势，因此本发明具备高度的工艺前瞻性。
2.使用BHK-21传代细胞系制备疫苗，半抗原高度澄清，容易进行浓缩处理，非常适合进行高抗原滴度的优质灭活疫苗生产，此外该工艺也明显有利于多联多价疫苗的制备生产，符合疫苗发展趋势。同时使用该工艺制备的多联多价油乳剂灭活疫苗也将填补国内空白。
用BHK-21传代细胞进行鸭星状病毒Ⅰ型和Ⅲ型增殖，利用Reed-Muench方法测定其病毒滴度可以稳定达到106.5-107.0TCID50/0.1mL。抗原的稳定生产和高滴度是制备疫苗最关键因素,用BHK-21细胞进行鸭星状病毒Ⅰ型和Ⅲ型增殖其病毒滴度是常规鸭胚法及原代细胞法的10倍以上，如采用生物反应器进行病毒增殖，其病毒滴度可以达到100倍水平。本专利公开的鸭星状病毒(Ⅰ型+Ⅲ型)灭活疫苗，产量高，品质稳定，免疫鸭能产生高水平血清中和抗体，免疫效果好，具有巨大的应用前景。
具体实施方式
以下通过具体实施例再对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅局限于以下的实施例。在不脱离本发明上述技术思想的情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段做出的各种替换或变更，均应包括在本发明的范围内。
以下实施例所使用的鸭星状病毒Ⅰ型和Ⅲ型毒种为自行分离鉴定：采用RT-PCR扩增，测序进行序列比，同时进行动物回归和鸭胚适应性试验进行进一步确定为鸭星状病毒Ⅰ型和Ⅲ型病毒。
实施例1
制备方法：
(1)将BHK-21细胞，用胰酶消化分散，加入5％新生牛血清的DMEM培养液在转瓶内37℃、5％CO2培养至细胞单层后，弃去原培养液，用无血清DMEM培养液清洗细胞3次，用于鸭星状病毒Ⅰ型和Ⅲ型接种。
(2)病毒的接种和培养：分别将鸭星状病毒Ⅰ型和Ⅲ型毒种按终体积1:100接种到步骤①制备的细胞，并在37℃吸附30分钟后吸弃病毒液，在用含1％新生牛血清的DMEM培养液于37℃、5％CO2培养至细胞，出现病变时终止。
(3)病毒收集、浓缩和纯化及病毒含量测定：将收集的细胞病毒液于-20℃反复冻融两次后，于4℃、5000rpm离心10min，取离心后上清液用于超滤浓缩。将上述离心后的上清液用30K中空纤维柱将其浓缩10倍后，取浓缩后的病毒液用DMEM细胞培养液做10倍系列稀释，取10-5、10-6、10-7、10-8、10-95个稀释度接种48孔铺满单层BHK-21细胞培养板，每个稀释度重复5孔，同时设立阴性对照细胞；每孔0.2mL，
5％CO2、37℃培养120小时，观察细胞病变(CPE)，计算TCID50，每0.1mL病毒含量106.5TCID50，可用于制苗。
(4)病毒灭活：采用0.1％福尔马林灭活病毒，即为疫苗抗原。
实施例2
制备方法：
(1)将BHK-21细胞，用胰酶消化分散，加入10％新生牛血清的DMEM培养液在微载体反应器中37℃、5％CO2培养至细胞单层后，弃去原培养液，用无血清DMEM培养液清洗细胞3次，用于鸭星状病毒Ⅰ型和Ⅲ型接种。
(2)病毒的接种和培养：分别将鸭星状病毒Ⅰ型和Ⅲ型毒种按终体积1:1000接种到步骤①制备的细胞，并在37℃吸附60分钟后吸弃病毒液，在用2％新生牛血清的DMEM培养液于37℃、5％CO2培养至细胞，出现病变时终止。
(3)病毒收集、浓缩和纯化：将上述接种的病变细胞冻融，离心后收集上清液得到病毒原液；通过超滤浓缩上述病毒液即为制苗病毒液。方法同实施例1并进行病毒含量测定：每0.1mL病毒含量107.0TCID50，可用于制苗。
(4)病毒灭活：采用0.1％福尔马林灭活病毒，即为疫苗抗原。
实施例3
制备方法：
(1)将BHK-21细胞，用胰酶消化分散，加入7％新生牛血清的DMEM培养液在微载体反应器中37℃、5％CO2培养至细胞单层后，弃去原培养液，再用含有2mM的谷氨酰胺的无血清DMEM培养液清洗细胞3次，用于鸭星状病毒Ⅰ型和Ⅲ型接种。
(2)病毒的接种和培养：分别将鸭星状病毒Ⅰ型和Ⅲ型毒种按终体积1:500接种到步骤①制备的细胞，并在37℃吸附45分钟后吸弃病毒液，在用1.5％新生牛血清的DMEM培养液于37℃、5％CO2培养至细胞，出现病变时终止。
(3)病毒收集、浓缩和纯化：将上述接种的病变细胞冻融，离心后收集上清液得到病毒原液；通过超滤浓缩上述病毒液即为制苗病毒液。方法同实施例1并进行病毒含量测定：每0.1mL病毒含量107.0TCID50，可用于制苗。
(4)病毒灭活：采用0.1％福尔马林灭活病毒，即为疫苗抗原。
实施例4
制备方法：
(1)将BHK-21细胞，用胰酶消化分散，加入含双抗的6％新生牛血清的DMEM培养液在微载体反应器中37℃、5％CO2培养至细胞单层后，弃去原培养液，再用含有2mM的谷氨酰胺的无血清DMEM培养液清洗细胞3次，用于鸭星状病毒Ⅰ型和Ⅲ型接种。
(2)病毒的接种和培养：分别将鸭星状病毒Ⅰ型和Ⅲ型毒种按终体积1:500接种到步骤①制备的细胞，并在37℃吸附45分钟后吸弃病毒液，在用1.5％新生牛血清的DMEM培养液于37℃、5％CO2培养至细胞，出现病变时终止。
(3)病毒收集、浓缩和纯化：将上述接种的病变细胞冻融，离心后收集上清液得到病毒原液；通过超滤浓缩上述病毒液即为制苗病毒液。方法同实施例1并进行病毒含量测定：每0.1mL病毒含量107.0TCID50，可用于制苗。
(4)病毒灭活：采用0.1％福尔马林灭活病毒，即为疫苗抗原。
以上实施例的疫苗抗原都通过以下步骤配制为疫苗制剂：
a)水相制备：取检验合格的疫苗抗原96份加入灭菌后的吐温-80 4份，开始搅拌，使吐温-80完全溶解为止，制成水相；
b)油相制备：取优质注射用白油94份，硬脂酸铝2份，司班-80 4份，先将白油缓慢加温，按4％和2％加入司班-80和硬脂酸铝，边搅边加温，直到硬脂酸铝充分溶解至透明为止，高压灭菌备用；
c)乳化：利用IKA乳化机进行乳化，16000rpm，乳化5分钟即可；
d)分装：将制备的疫苗按照每瓶250mL进行分装。
本发明以上实施例所制备的鸭星状病毒疫苗的试验测试结果如下：
1)以上实施例所制备的鸭星状病毒疫苗的质量控制：根据现行《中国兽药典》对其进行稳定性、粘度、无菌检验、甲醛含量测定,结果均符合国家标准，检验合格。
2)以上实施例所制备的鸭星状病毒疫苗的灭活检验：取实施例1-4、分别用DMEM营养液以10-1、10-2、10-3三个比例稀释待检样品，同时设立同样稀释比例的灭活前病毒样品用于阳性对照，分别接种于48孔BHK-21细胞单层细胞，每组重复接种5孔，每孔0.4mL37℃、5％CO2培养96小时。结果显示，灭活样品各组稀释度孔中均没有出现细胞病变，阳性对照组各稀释度孔中细胞病变均明显，达80％以上。实施例1-4灭活检验合格。
3)以上实施例所制备的鸭星状病毒疫苗的安全性试验：选用7日龄健康易感鸭将其分为5组，每组10只，分别每只肌肉或颈部皮下注射实施例1-4疫苗1mL，剩余一组作为空白对照组，观察14日，结果试验鸭均健活，无任何局部和全身不良反应；在第15天进行解剖观察，内脏组织无明显的病变。表明本发明实施例1-4制备的鸭星状病毒疫苗安全。
4)以上实施例所制备的鸭星状病毒疫苗的疫苗效力试验：取7日龄健康易感鸭50只，每组10只，将实施例1-4制备的鸭星状病毒疫苗分别以0.3mL/只胸肌注射，剩余一组作为空白对照组，免疫后14、28、42和56天，分别采血，测定其血清中和抗体效价。结果显示，实施例1-4制备的鸭星状病毒疫苗均能产生高水平血清中和抗体，具体见表1。
表1
Figure BDA0001980520670000051
5)以上实施例所制备的鸭星状病毒疫苗的免疫保护试验：取7日龄健康易感鸭100只，分为5组，每组20只。各组同步进行强毒攻击，攻毒株为鸭星状病毒Ⅰ型和Ⅲ型毒种，攻毒剂量各为60cfu/只，分两次肌肉注射，间隔1天，间隔日胸肌注射给药实施例1-4 0.3mL/只，对照组1注射同体积生理盐水。连续观察50天，统计各组鸭星状病毒疫苗的保护率，结果显示实施例样品免疫保护效果好，具体见表2：
表2
Figure BDA0001980520670000061

Claims (6)

1.一种鸭星状病毒疫苗，其特征在于：其是在传代细胞系BHK-21细胞上接种鸭星状病毒Ⅰ型和Ⅲ型毒种得到的灭活疫苗；
所述包括如下步骤：
(1)BHK-21细胞的传代与培养：BHK-21细胞经EDTA-胰酶细胞分散液消化传代，以细胞生长液继续培养，形成细胞单层时，用于继续传代或接种病毒；
(2)病毒的接种和培养：取已形成单层的上述细胞，弃去细胞生长液，接种细胞维持液，分别将鸭星状病毒Ⅰ型和Ⅲ型毒种按终体积1:100～1:1000接种到制备的细胞，吸附后吸弃病毒液，在用培养液培养至细胞出现病变时收获；
(3)病毒的收集、浓缩、纯化：将上述接种的病变细胞冻融，离心后收集上清液得到病毒原液；通过超滤浓缩上述病毒液即为制苗病毒液；
(4)病毒灭活：采用0.1%福尔马林灭活病毒，即为疫苗抗原；
(5)使用疫苗抗原配置疫苗制剂；
所述步骤（2）所述细胞维持液为无血清的DMEM培养液，毒种接种到细胞后在37℃吸附30～60分钟后吸弃病毒液，接毒后在培养液中培养条件为37℃、5%CO2，所述培养液为含1～2%新生牛血清的DMEM培养液；
所述细胞维持液中含有2mM的谷氨酰胺。
2.如权利要求1所述的鸭星状病毒疫苗的制备方法，特征在于，所述步骤（1）中的细胞生长液为含5～10%新生牛血清的DMEM培养液。
3.如权利要求1所述的鸭星状病毒疫苗的制备方法，特征在于，所述步骤（3）中所述制苗病毒液每0.1mL病毒含量大于106.5TCID50。
4.如权利要求1所述的鸭星状病毒疫苗的制备方法，特征在于，所述步骤（1）中BHK-21细胞在转瓶内或在微载体反应器中培养。
5.如权利要求2所述的鸭星状病毒疫苗的制备方法，特征在于，所述细胞生长液中含双抗。
6.如权利要求1所述的鸭星状病毒疫苗的制备方法，特征在于，所述步骤（5）配置疫苗制剂包括如下步骤：
a)水相制备：取检验合格的疫苗抗原96份加入灭菌后的吐温-80 4份，开始搅拌，使吐温-80完全溶解为止，制成水相；
b)油相制备：取优质注射用白油94份，硬脂酸铝2份，司班-80 4份，先将白油缓慢加温，按4%和2%加入司班-80和硬脂酸铝，边搅边加温，直到硬脂酸铝充分溶解至透明为止，高压灭菌备用；
c)乳化：利用IKA乳化机进行乳化，16000rpm，乳化5分钟即可；
d)分装：将制备的疫苗按照每瓶250mL进行分装。
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