CN107050448B - 一种禽流感病毒、禽腺病毒二联灭活疫苗的制备方法 - Google Patents

一种禽流感病毒、禽腺病毒二联灭活疫苗的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种禽流感病毒H9亚型、禽腺病毒4型二联灭活疫苗的制备方法。本发明采用LMH传代细胞系作为载体细胞进行病毒增殖，采用谷氨酰胺、重组人胰岛素、人血清白蛋白、转铁蛋白、生物素和生长因子组成的培养基A进行培养，收集病毒液，灭活，制备成疫苗。本发明采用LMH传代细胞系进行禽流感H9亚型病毒和禽腺病毒4型病毒增殖不需要额外添加胰酶，而且LMH细胞背景清楚，无外源病原，易增殖，可以有效的简化工艺，降低成本。而且本发明制备得到的禽流感病毒、禽腺病毒二联灭活疫苗的病毒含量高、稳定性好，安全性高，是一种较为理想的禽流感病毒、禽腺病毒二联灭活疫苗。

Description

一种禽流感病毒、禽腺病毒二联灭活疫苗的制备方法
技术领域
本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种禽流感病毒H9亚型、禽腺病毒4型二联灭活疫苗的制备方法。
背景技术
H9N2亚型禽流感属于低致病性禽流感，但发病率高，其主要临床表现为轻度呼吸道症状，采食量减少，产蛋率可从90％降至20％以下，甚至绝产，对商品肉鸡可导致30％左右死亡，极易与大肠杆菌混合感染，严重影响家禽的生产性能，给养禽业带来严重的经济损失。而且，该H9N2亚型AIV可以穿越宿主障碍感染哺乳动物，包括人，即有机会在人类中大规模流行，给人类健康带来严重的威胁。
禽I群腺病毒是家禽常见的感染病原体，呈世界性分布，目前发现所有年龄的家禽均易感，只是鉴于家禽的品种、年龄所形成的致病力不同。目前发现禽I群腺病毒对鸡具有强致病性，临床上常常出现包涵体肝炎及心包积液-肝炎综合征，该病可直接引发养鸡场20-40天龄鸡只出现30％以上的死亡率。此外，其临床上也常常与传染性支气管炎病毒，呼肠孤病毒，H9亚型禽流感病毒等并发感染，导致种蛋鸡出现明显呼吸道病，关节炎，及严重的产蛋下降及畸形蛋等问题。而且该病于1987年首发于巴基斯坦，在不到一年的时间内殃及整个巴基斯坦肉鸡养殖企业，之后在科威特、伊朗、前苏联，日本，中南美洲及墨西哥等地具有发生，甚至该病在鸽子也曾大面积爆发。因此，目前该病已经成为严重影响养鸡场生产性能的重大疫病之一。
虽然H9亚型禽流感和禽I群腺病毒灭活疫苗已广泛应用，该病也得到了有效控制，但是近几年来H9亚型禽流感和禽腺病毒4型感染在免疫鸡群中时有发生。为此，通过高适应载体表达高质量的有效抗原同时减少原有的生产成本达到针对同源/非同源H9亚型AIV、禽腺病毒4型流行株提供免疫保护的疫苗尤为必要。
目前，我国的禽流感H9亚型和禽I群腺病毒主要是通过鸡胚尿囊腔接种流感病毒而获得，专利文献CN105582533A公开了一种禽流感病毒、禽腺病毒二联灭活疫苗，该疫苗的制备的将将禽流感病毒、禽腺病毒经卵黄囊途径接种于SPF鸡胚进行病毒增殖，制备得到的疫苗的安全性良好，未出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应。但是采用SPF鸡胚载体进行病毒增殖，病毒滴度不高且用SPF鸡胚载体大规模生产其生产成本非常昂贵，不利于大规模生产。
同时，通过鸡胚尿囊腔接种流感病毒会出现如大流行时疫苗的供给量往往受到SPF鸡胚数量的限制；有些毒株无法在鸡胚中复制，因此难以获得足够量的病毒，只有鸡胚适应株才能获得高产量病毒；受体结合特异位点的变异导致抗原性降低；疫苗生产下游技术一成不变且十分繁重、易于污染等等，大大的限制了禽流感H9亚型和禽I群腺病毒疫苗的推广和应用。
发明内容
为了解决现有技术中的缺陷，本发明提供一种禽流感病毒、禽腺病毒二联灭活疫苗的制备方法。本发明是采用动物传代细胞LMH细胞进行病毒增殖，在培养流感病毒时能够在短期内大量增殖病毒，且无外源因子污染，能维持病毒抗原稳定，同时在培养过程中不需要添加胰蛋白酶，培养得到的流感病毒具有病毒含量高，血凝价高，免疫原性好的优点。
本发明提供了一种禽流感病毒、禽腺病毒二联灭活疫苗的制备方法，包括如下步骤：
S1细胞载体的制备：将LMH细胞用胰酶消化分散，用含5～10％新生牛血清和1000-2000单位/mL青链霉素双抗的DMEM培养液在37℃、5％CO2的条件下2～3天，接着用无血清DMEM培养液清洗细胞2～3次，得细胞载体；
S2病毒的接种：将禽流感病毒H9亚型和禽腺病毒4型的病毒液分别按终体积1:50～1:500接种到步骤S1得到的细胞载体中，放置37℃条件下吸附30-60min后吸弃病毒液，接着加入培养基A，于37℃、5％CO2的条件下培48～72h，出现80％细胞病变，得病变细胞；
S3病毒液收集：将步骤S2得到的病变细胞冻融2～3次，于4℃、5000rpm条件下离心8～12min后，分别收集禽流感病毒H9亚型上清液和禽腺病毒4型上清液，接着进行TCID50和EID50检测，合格后，将上述上清液分别超滤浓缩，得禽流感病毒H9亚型病毒液和禽腺病毒4型毒病毒液；
S4病毒灭活：采用0.1％福尔马林灭活步骤S3得到的禽流感病毒H9亚型病毒液和禽腺病毒4型毒病毒液，得禽流感病毒H9亚型疫苗抗原和禽腺病毒4型毒疫苗抗原；
S5疫苗配制：
a油相制备：取92～96份白油，1～3份硬脂酸铝，3～5份司班-80，将白油加热到75～85℃，接着加入司班-80和硬脂酸铝，搅拌溶解至透明，灭菌，得油相；
b水相制备：取40～50份步骤S4得到的禽流感病毒H9亚型疫苗抗原，40～50份步骤S4得到的禽腺病毒4型毒疫苗抗原，加入3～5份吐温-80，搅拌至完全溶解，得水相；
c乳化：将步骤a得到的油相与步骤b得到的水相混合，在14000-16000rpm的条件下乳化4-6min，按照每瓶250mL进行分装，即得。
进一步地，所述的禽流感病毒、禽腺病毒二联灭活疫苗的制备方法，包括如下步骤：
S1细胞载体的制备：将LMH细胞用胰酶消化分散，用含5～10％新生牛血清和1500单位/mL青链霉素双抗的DMEM培养液在37℃、5％CO2的条件下2天，接着用无血清DMEM培养液清洗细胞3次，得细胞载体；
S2病毒的接种：将禽流感病毒H9亚型和禽腺病毒4型病毒液分别按终体积1:50～1:500接种到步骤S1得到的细胞载体中，放置37℃条件下吸附30～60min后吸弃病毒液，接着加入培养基A，于37℃、5％CO2的条件下培56h，出现80％细胞病变，得病变细胞；
S3病毒液收集：将步骤S2得到的病变细胞冻融3次，于4℃、5000rpm的条件下离心10min后，分别收集禽流感病毒H9亚型上清液和禽腺病毒4型上清液，接着进行TCID50和EID50检测，合格后，将上述上清液分别超滤浓缩，得禽流感病毒H9亚型病毒液和禽腺病毒4型毒病毒液；
S4病毒灭活：采用0.1％福尔马林灭活步骤S3得到的禽流感病毒H9亚型病毒液和禽腺病毒4型毒病毒液，得禽流感病毒H9亚型疫苗抗原和禽腺病毒4型毒疫苗抗原；
S5疫苗配制：
a油相制备：取94份白油，2份硬脂酸铝，4份司班-80，将白油加热到78℃，接着加入司班-80和硬脂酸铝，搅拌溶解至透明，灭菌，得油相；
b水相制备：取48份步骤S4得到的禽流感病毒H9亚型疫苗抗原，48份步骤S4得到的禽腺病毒4型毒疫苗抗原，加入4份吐温-80，搅拌至完全溶解，得水相；
c乳化：将步骤a得到的油相与步骤b得到的水相混合，在15000rpm的条件下乳化4-6min，按照每瓶250mL进行分装，即得。
进一步地，所述步骤S2中的培养基A包括DMEM基础培养基，还包括如下组分及其浓度：
谷氨酰胺1～4mmol/L、重组人胰岛素4～10μg/mL、人血清白蛋白1～3mg/mL、转铁蛋白2～6μg/mL、生物素2～4μg/mL和生长因子8～22mmol/L。
进一步地，所述步骤S2中的培养基A包括DMEM基础培养基，还包括如下组分及其浓度：
谷氨酰胺2mmol/L、重组人胰岛素6μg/mL、人血清白蛋白2mg/mL、转铁蛋白4μg/mL、生物素3μg/mL和生长因子14mmol/L。
进一步地，所述生长因子由焦磷酸硫胺素和天麻素按质量比(4～6):(1～3)组成。
进一步地，所述生长因子由焦磷酸硫胺素和天麻素按质量比5:2组成。
进一步地，所述步骤S1中的LMH细胞放置转瓶内培养。
进一步地，所述步骤S1中的LMH细胞放置微载体反应器内培养，微载体使用量2～10克/升。
本发明采用的LMH细胞为ATCC LMH-CRL-2117细胞，焦磷酸硫胺素的CAS号为67-03-8，天麻素的CAS号为62499-27-8。
本发明采用的LMH细胞作为载体细胞和采用由焦磷酸硫胺素和天麻素按特定质量比组成生长因子可以有效提高病毒的增殖，增加疫苗的病毒含量，提高疫苗的疫苗效果。经试验发现，本发明制备得到的禽流感病毒、禽腺病毒二联灭活疫苗病毒含量高，禽流感病毒H9亚型≥108.5TCID50，禽流感病毒H9亚型≥108.3EID50，禽流感病毒H9亚型HA≥29，禽腺病毒4型≥108.6TCID50，可以有效的提高禽流感病毒、禽腺病毒二联灭活疫苗的疫苗效果。
经试验发现，本发明制备的禽流感病毒、禽腺病毒二联灭活疫苗外观为乳白色乳剂，将10ml疫苗加入离心管中，以3000rpm离心15min，管底析出的水相应≤0.4mL，具有较高的稳定性高；吸取1.0mL疫苗，令其垂直自然流出0.4mL，时间低于3.8s，具有较好的粘度，灭活、甲醛含量和安全性符合国家标准，有利于该禽流感病毒、禽腺病毒二联灭活疫苗的推广和应用。
进一步地，经试验发现，采用本发明提供的LMH细胞载体不仅能培养出血凝价高的禽流感H9亚型病毒和病毒滴度高的禽腺病毒4型，并且能完全取代采用传统的用鸡胚生产禽流感H9亚型病毒和禽腺病毒4型病毒；从SPF鸡的免疫效力试验可知，本发明制备得到的禽流感H9亚型和禽腺病毒4型二联灭活疫苗免疫SPF鸡不仅能产生高水平的抗禽流感病毒H9亚型的HI抗体而且还能产生高水平的禽腺病毒4型中和抗体。
与现有技术相比，本发明提供的禽流感病毒、禽腺病毒二联灭活疫苗的制备方法具有以下优势：
(1)本发明采用LMH传代细胞系进行禽流感H9亚型病毒和禽腺病毒4型病毒增殖不需要向细胞培养液中添加额外的胰酶，而且LMH细胞背景清楚，无外源病原，易增殖性，可以有效的简化工艺，降低成本。
(2)本发明制备得到的禽流感病毒、禽腺病毒二联灭活疫苗的病毒含量高、稳定性好，安全性高，是一种较为理想的禽流感病毒、禽腺病毒二联灭活疫苗。
具体实施方式：
以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。本发明提供的谷氨酰胺、重组人胰岛素、人血清白蛋白、转铁蛋白和生物素为常规市售产品，例如，重组人胰岛素购于沈阳拜英生物技术有限公司。
实施例1、一种禽流感病毒、禽腺病毒二联灭活疫苗的制备方法
S1细胞载体的制备：将LMH细胞用胰酶消化分散，用含5％新生牛血清和1000单位/mL青链霉素双抗的DMEM培养液在37℃、5％CO2的条件下培养2天，接着用无血清DMEM培养液清洗细胞2次，得细胞载体；所述LMH细胞放置转瓶内培养或放置微载体反应器内培养。
S2病毒的接种：将禽流感病毒H9亚型和禽腺病毒4型的病毒液分别按终体积1:50接种到步骤S1得到的细胞载体中，放置37℃条件下吸附30min后吸弃病毒液，接着加入培养基A，于37℃、5％CO2的条件下培养48h，出现80％细胞病变，得病变细胞；
所述培养基A包括DMEM基础培养基，还包括如下组分及其浓度：
谷氨酰胺2mmol/L、重组人胰岛素4μg/mL、人血清白蛋白1mg/mL、转铁蛋白2μg/mL、生物素2μg/mL和生长因子10mmol/L；所述生长因子由焦磷酸硫胺素和天麻素按质量比4:3组成。
S3病毒液收集：将步骤S2得到的病变细胞冻融2次，于4℃、5000rpm条件下离心8min后，分别收集禽流感病毒H9亚型上清液和禽腺病毒4型上清液，接着进行TCID50和EID50检测，合格后，将上述上清液分别超滤浓缩，得禽流感病毒H9亚型病毒液和禽腺病毒4型毒病毒液；
S4病毒灭活：采用0.1％福尔马林灭活步骤S3得到的禽流感病毒H9亚型病毒液和禽腺病毒4型毒病毒液，得禽流感病毒H9亚型疫苗抗原和禽腺病毒4型毒疫苗抗原；
S5疫苗配制：
a油相制备：取92份白油，1份硬脂酸铝，3份司班-80，将白油加热到75℃，接着加入司班-80和硬脂酸铝，搅拌溶解至透明，灭菌，得油相；
b水相制备：取42份步骤S4得到的禽流感病毒H9亚型疫苗抗原，42份步骤S4得到的禽腺病毒4型毒疫苗抗原，加入3份吐温-80，搅拌至完全溶解，得水相；
c乳化：将步骤a得到的油相与步骤b得到的水相混合，在14000的条件下乳化4min，按照每瓶250mL进行分装，即得。
实施例2、一种禽流感病毒、禽腺病毒二联灭活疫苗的制备方法
S1细胞载体的制备：将LMH细胞用胰酶消化分散，用含8％新生牛血清和1500单位/mL青链霉素双抗的DMEM培养液在37℃、5％CO2的条件下培养2天，接着用无血清DMEM培养液清洗细胞3次，得细胞载体；所述LMH细胞放置微载体反应器内培养，微载体使用量6克/升。
S2病毒的接种：将禽流感病毒H9亚型和禽腺病毒4型的病毒液分别按终体积1:100接种到步骤S1得到的细胞载体中，放置37℃条件下吸附40min后吸弃病毒液，接着加入培养基A，于37℃、5％CO2的条件下56h，出现80％细胞病变，得病变细胞；
所述培养基A包括DMEM基础培养基，还包括如下组分及其浓度：
谷氨酰胺2mmol/L、重组人胰岛素6μg/mL、人血清白蛋白2mg/mL、转铁蛋白4μg/mL、生物素3μg/mL和生长因子14mmol/L；所述生长因子由焦磷酸硫胺素和天麻素按质量比5:2组成。
S3病毒液收集：将步骤S2得到的病变细胞冻融3次，于4℃、5000rpm条件下离心10min后，分别收集禽流感病毒H9亚型上清液和禽腺病毒4型上清液，接着进行TCID50和EID50检测，合格后，将上述上清液分别超滤浓缩，得禽流感病毒H9亚型病毒液和禽腺病毒4型毒病毒液；
S4病毒灭活：采用0.1％福尔马林灭活步骤S3得到的禽流感病毒H9亚型病毒液和禽腺病毒4型毒病毒液，得禽流感病毒H9亚型疫苗抗原和禽腺病毒4型毒疫苗抗原；
S5疫苗配制：
a油相制备：取94份白油，2份硬脂酸铝，4份司班-80，将白油加热到78℃，接着加入司班-80和硬脂酸铝，搅拌溶解至透明，灭菌，得油相；
b水相制备：取48份步骤S4得到的禽流感病毒H9亚型疫苗抗原，48份步骤S4得到的禽腺病毒4型毒疫苗抗原，加入4份吐温-80，搅拌至完全溶解，得水相；
c乳化：将步骤a得到的油相与步骤b得到的水相混合，在15000rpm的条件下乳化5min，按照每瓶250mL进行分装，即得。
实施例3、一种禽流感病毒、禽腺病毒二联灭活疫苗的制备方法
S1细胞载体的制备：将LMH细胞用胰酶消化分散，用含10％新生牛血清和2000单位/mL青链霉素双抗的DMEM培养液在37℃、5％CO2的条件下培养3天，接着用无血清DMEM培养液清洗细胞3次，得细胞载体；所述LMH细胞放置微载体反应器内培养，微载体使用量8克/升。
S2病毒的接种：将禽流感病毒H9亚型和禽腺病毒4型的病毒液分别按终体积1:200接种到步骤S1得到的细胞载体中，放置37℃条件下吸附60min后吸弃病毒液，接着加入培养基A，于37℃、5％CO2的条件下培养72h，出现80％细胞病变，得病变细胞；
所述培养基A包括DMEM基础培养基，还包括如下组分及其浓度：
谷氨酰胺4mmol/L、重组人胰岛素10μg/mL、人血清白蛋白3mg/mL、转铁蛋白6μg/mL、生物素4μg/mL和生长因子20mmol/L；所述生长因子由焦磷酸硫胺素和天麻素按质量比6:1组成；
S3病毒液收集：将步骤S2得到的病变细胞冻融3次，于4℃、5000rpm条件下离心12min后，分别收集禽流感病毒H9亚型上清液和禽腺病毒4型上清液，接着进行TCID50和EID50检测，合格后，将上述上清液分别超滤浓缩，得禽流感病毒H9亚型病毒液和禽腺病毒4型毒病毒液；
S4病毒灭活：采用0.1％福尔马林灭活步骤S3得到的禽流感病毒H9亚型病毒液和禽腺病毒4型毒病毒液，得禽流感病毒H9亚型疫苗抗原和禽腺病毒4型毒疫苗抗原；
S5疫苗配制：
a油相制备：取96份白油，3份硬脂酸铝，5份司班-80，将白油加热到85℃，接着加入司班-80和硬脂酸铝，搅拌溶解至透明，灭菌，得油相；
b水相制备：取50份步骤S4得到的禽流感病毒H9亚型疫苗抗原，50份步骤S4得到的禽腺病毒4型毒疫苗抗原，加入5份吐温-80，搅拌至完全溶解，得水相；
c乳化：将步骤a得到的油相与步骤b得到的水相混合，在16000rpm的条件下乳化6min，按照每瓶250mL进行分装，即得。
对比例1、一种禽流感病毒、禽腺病毒二联灭活疫苗的制备方法
与实施例2的区别在于，所述步骤S1中将LMH细胞替换为MDCK细胞作为细胞载体，其余步骤与实施例2类似。
对比例2、一种禽流感病毒、禽腺病毒二联灭活疫苗的制备方法
与实施例2的区别在于，所述步骤S2中培养基A包括DMEM基础培养基，还包括如下组分及其浓度：谷氨酰胺2mmol/L、重组人胰岛素6μg/mL、人血清白蛋白2mg/mL、转铁蛋白4μg/mL、生物素3μg/mL和新生牛血清14mmol/L；其余步骤与实施例2类似。
对比例3、一种禽流感病毒、禽腺病毒二联灭活疫苗的制备方法
与实施例2的区别在于，所述步骤S2中培养基A包括DMEM基础培养基，还包括如下组分及其浓度：谷氨酰胺2mmol/L、重组人胰岛素6μg/mL、人血清白蛋白2mg/mL、转铁蛋白4μg/mL、生物素3μg/mL和焦磷酸硫胺素14mmol/L；其余步骤与实施例2类似。
对比例4、一种禽流感病毒、禽腺病毒二联灭活疫苗的制备方法
与实施例2的区别在于，所述步骤S2中培养基A包括DMEM基础培养基，还包括如下组分及其浓度：谷氨酰胺2mmol/L、重组人胰岛素6μg/mL、人血清白蛋白2mg/mL、转铁蛋白4μg/mL、生物素3μg/mL和生长因子14mmol/L；所述生长因子由焦磷酸硫胺素和天麻素按质量比1:1组成；其余步骤与实施例2类似。
试验例一、禽流感病毒、禽腺病毒二联灭活疫苗的病毒含量检测
1、试验材料：实施例1、实施例2、实施例3、对比例1、对比例2和对比例3的步骤S3制备的禽流感病毒H9亚型上清液和禽腺病毒4型上清液。
2、试验方法：
分别检测实施例1、实施例2、实施例3、对比例1、对比例2和对比例3的步骤S3制备的禽流感病毒H9亚型上清液的TCID50、EID50和HA(血凝价)，禽腺病毒4型上清液的TCID50。
2.1、TCID50的检测方法：
分别将收集的禽流感病毒H9亚型和禽腺病毒4型细胞病毒液于-20℃反复冻融两次后，于4℃、5000rpm离心10min，分别取离心后上清液用于超滤浓缩；将上述离心后的上清液用50K中空纤维柱将其浓缩后，取浓缩后的病毒液用DMEM细胞培养液做10倍系列稀释，取10-5、10-6、10-7、10-8、10-95个稀释度接种48孔铺满单层LMH细胞培养板，每个稀释度重复5孔，同时设立阴性对照细胞，每孔0.1mL，37℃吸附30min后，补加含1～2％新生牛血清、适量双抗和2mM谷氨酰胺的DMEM培养液0.3mL于37℃、5％CO2培养120小时，观察细胞病变(CPE)，利用Reed-Muench方法计算TCID50；
2.2、EID50的检测方法：
将禽流感病毒H9亚型收集的细胞病毒液于-20℃反复冻融两次后，于4℃、5000rpm离心10min，取离心后上清液，将上述离心浓缩后上清液用PBS按照10倍系列稀释，取10-6、10-7、10-8、10-9、10-10共5个稀释度经尿囊腔接种SPF鸡胚，0.1mL/胚，每个稀释度接种5枚鸡胚，于37℃培养箱中培养观察7天，每天记录鸡胚死亡情况，如果有死亡鸡胚放入4℃冰箱保存，观察时间结束后利用Reed-Muench方法计算离心收获的上清液的EID50；
2.3、HA的检测方法：
按微量法在V型血凝试验微量板上进行，鸡红细胞浓度为1％(V/V)，反应总量均为0.075mL。
3、试验结果：
试验结果如表1所示。
表1禽流感病毒、禽腺病毒二联灭活疫苗的病毒含量检测表
Figure BDA0001280287270000091
由表1可知，本发明制备得到的禽流感病毒、禽腺病毒二联灭活疫苗病毒含量高，禽流感病毒H9亚型≥108.5TCID50，禽流感病毒H9亚型≥108.3EID50，禽流感病毒H9亚型HA≥29，禽腺病毒4型≥108.6TCID50，可以有效的提高禽流感病毒、禽腺病毒二联灭活疫苗的疫苗效果。说明本发明采用的LMH细胞作为载体细胞和采用由焦磷酸硫胺素和天麻素按特定质量比组成生长因子可以有效提高病毒的增殖，增加疫苗的病毒含量，提高疫苗的疫苗效果。试验例二、禽流感病毒、禽腺病毒二联灭活疫苗的产品质量检测
1、试验材料：实施例1、实施例2和实施例3制备的禽流感病毒、禽腺病毒二联灭活疫苗。
2、试验方法：
对实施例1、实施例2和实施例3制备的禽流感病毒、禽腺病毒二联灭活疫苗进行外观，稳定性，粘度，无菌检验，灭活检验，安全检验和甲醛含量测定。
2.1、外观观察：直接观察实施例1、实施例2和实施例3制备的禽流感病毒、禽腺病毒二联灭活疫苗的外观情况。
2.2、稳定性测定：各吸取实施例1、实施例2和实施例3制备的禽流感病毒、禽腺病毒二联灭活疫苗10毫升加入离心管中，以3000rpm离心15分钟，管底析出的水相应≤0.5mL。
2.3、粘度测定：用出口内径为1.2mm的1.0mL吸管，在25℃左右吸取实施例1、实施例2和实施例3制备的禽流感病毒、禽腺病毒二联灭活疫苗1.0mL，令其垂直自然流出，记录流出0.4mL所需的时间，应不超过8秒。
2.4、无菌检验：取实施例1、实施例2和实施例3制备的禽流感病毒、禽腺病毒二联灭活疫苗接种硫乙醇酸盐培养基小管和酪胨琼脂各两支，每支0.2mL，一支置37℃培养，一支置25℃培养，观察3～5日，应纯粹，无菌生长。
2.5、灭活检验：取实施例1、实施例2和实施例3制备的禽流感病毒、禽腺病毒二联灭活疫苗，用DMEM营养液以10-1、10-2、10-3三个比例稀释待检样品，同时设立同样稀释比例的灭活前病毒样品用于阳性对照，分别接种于48孔LMH细胞单层细胞，每组重复接种5孔，每孔0.4mL 37℃、5％CO2培养96小时。灭活样品各组稀释度孔中均没有出现细胞病变，阳性对照组各稀释度孔中细胞病变均明显，达80％以上，判定为灭活检验合格。
2.6、安全检验：用7日龄SPF鸡10只，每只肌肉或颈部皮下注射实施例1、实施例2和实施例3制备的禽流感病毒、禽腺病毒二联灭活疫苗1mL，观察14日，结果试验鸡均健活，无任何局部和全身不良反应。
2.7、甲醛含量测定：
ⅰ、对照品溶液的制备：取已标定的甲醛溶液适量，配成每1.0mL含甲醛1.0mg的溶液，精密量取5.0mL置50mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得；
ⅱ、被测样本的制备：用5.0mL刻度吸管量取实施例1、实施例2和实施例3制备的禽流感病毒、禽腺病毒二联灭活疫苗5.0mL，置50mL量瓶中，用20％吐温-80乙醇溶液10mL，分次洗涤吸管，洗液并入50mL量瓶中，摇匀，加水稀释至刻度，强烈振摇，静止分层，下层液如果不澄清，滤过，弃去初滤液，取澄清续滤液，即得；
ⅲ、测定法：精密吸取对照品溶液和被检品溶液各0.5mL，分别加醋酸-醋酸铵缓冲液10mL，乙酰丙酮试液10mL，置60℃恒温水浴15分钟，冷水冷却5分钟，放置20分钟后，按紫外-可见分光光度计法，在410nm的波长处测定吸收度，计算即得。甲醛含量符合国家标准，即检验合格。
3、试验结果：
试验结果如表2所示。
表2禽流感病毒、禽腺病毒二联灭活疫苗的产品质量检测
实施例1 实施例2 实施例3
外观 乳白色乳剂 乳白色乳剂 乳白色乳剂
稳定性(析出的水，ml) 0.3 0.2 0.4
粘度(液体流出时间，s) 3.5 4.2 3.8
无菌检验 合格 合格 合格
灭活检验 合格 合格 合格
安全检验定 合格 合格 合格
甲醛含量测定 合格 合格 合格
由表2可知，本发明实施例1、实施例2和实施例3制备的禽流感病毒、禽腺病毒二联灭活疫苗外观为乳白色乳剂，将10ml疫苗加入离心管中，以3000rpm离心15min，管底析出的水相应≤0.4mL，具有较高的稳定性高；吸取1.0mL疫苗，令其垂直自然流出0.4mL，时间低于3.8s，具有较好的粘度，灭活、甲醛含量和安全性符合国家标准，有利于该禽流感病毒、禽腺病毒二联灭活疫苗的推广和应用。
实施例三、禽流感病毒、禽腺病毒二联灭活疫苗的效力试验：
1、试验材料：实施例2制备的禽流感病毒、禽腺病毒二联灭活疫苗。
2、试验方法：
取21日龄SPF鸡45只，将实施例2制备的禽流感病毒、禽腺病毒二联灭活疫苗的四批禽流感H9亚型和禽腺病毒4型二联灭活疫苗分别以0.3mL/只胸肌注射，每批灭活疫苗10只SPF鸡。免疫后7、14、21、28、35、42、49天，连同对照组5只SPF鸡分别采血，测定其禽流感病毒H9亚型HI抗体效价和21天、35天和49天禽腺病毒4型血清中和抗体效价。
3、试验结果：
试验结果如表3和表4所示。
表3禽流感病毒H9亚型HI抗体效价表
Figure BDA0001280287270000121
表4禽腺病毒4型血清中和抗体效价
Figure BDA0001280287270000122
由表3和表4可知，采用本发明提供的LMH细胞载体不仅能培养出血凝价高的禽流感H9亚型病毒和病毒滴度高的禽腺病毒4型，并且能完全取代采用传统的用鸡胚生产禽流感H9亚型病毒和禽腺病毒4型病毒；从SPF鸡的免疫效力试验可知，本发明制备得到的禽流感H9亚型和禽腺病毒4型二联灭活疫苗免疫SPF鸡不仅能产生高水平的抗禽流感病毒H9亚型的HI抗体而且还能产生高水平的禽腺病毒4型中和抗体。

Claims (4)

1.一种禽流感病毒、禽腺病毒二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1细胞载体的制备：将LMH细胞用胰酶消化分散，用含5～10％新生牛血清和1000～2000单位/mL青链霉素双抗的DMEM培养液在37℃、5％CO2的条件下培养2～3天，接着用无血清DMEM培养液清洗细胞2～3次，得细胞载体；
S2病毒的接种：将禽流感病毒H9亚型和禽腺病毒4型的病毒液分别按终体积1:50～1:500接种到步骤S1得到的细胞载体中，放置37℃条件下吸附30～60min后吸弃病毒液，接着加入培养基A，于37℃、5％CO2的条件下培养48～72h，出现80％细胞病变，得病变细胞；
S3病毒液收集：将步骤S2得到的病变细胞冻融2～3次，于4℃、5000rpm的条件下离心8～12min，分别收集禽流感病毒H9亚型上清液和禽腺病毒4型上清液，接着进行TCID50和EID50检测，合格后，将上述上清液分别超滤浓缩，得禽流感病毒H9亚型病毒液和禽腺病毒4型病毒液；
S4病毒灭活：采用0.1％福尔马林灭活步骤S3得到的禽流感病毒H9亚型病毒液和禽腺病毒4型病毒液，得禽流感病毒H9亚型疫苗抗原和禽腺病毒4型毒疫苗抗原；
S5疫苗配制：
a油相制备：取92～96份白油，1～3份硬脂酸铝，3～5份司盘-80，将白油加热到75～85℃，接着加入司盘-80和硬脂酸铝，搅拌溶解至透明，灭菌，得油相；
b水相制备：取40～50份步骤S4得到的禽流感病毒H9亚型疫苗抗原，40～50份步骤S4得到的禽腺病毒4型毒疫苗抗原，加入3～5份吐温-80，搅拌至完全溶解，得水相；
c乳化：将步骤a得到的油相与步骤b得到的水相混合，在14000～16000rpm的条件下乳化4-6min，按照每瓶250mL进行分装，即得；
所述步骤S2中的培养基A包括DMEM基础培养基，还包括如下组分及其浓度：
谷氨酰胺2mmol/L、重组人胰岛素6μg/mL、人血清白蛋白2mg/mL、转铁蛋白4μg/mL、生物素3μg/mL和生长因子14mmol/L；
所述生长因子由焦磷酸硫胺素和天麻素按质量比5:2组成。
2.如权利要求1所述的禽流感病毒、禽腺病毒二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1细胞载体的制备：将LMH细胞用胰酶消化分散，用含8％新生牛血清和15000单位/mL青链霉素双抗的DMEM培养液在37℃、5％CO2的条件下培养2天，接着用无血清DMEM培养液清洗细胞3次，得细胞载体；
S2病毒的接种：将禽流感病毒H9亚型和禽腺病毒4型的病毒液分别按终体积1:100接种到步骤S1得到的细胞载体中，放置37℃条件下吸附30～60min后吸弃病毒液，接着加入培养基A，于37℃、5％CO2的条件下培养56h，出现80％细胞病变，得病变细胞；
S3病毒液收集：将步骤S2得到的病变细胞冻融3次，于4℃、5000rpm离心条件下10min后，分别收集禽流感病毒H9亚型上清液和禽腺病毒4型上清液，接着进行TCID50和EID50检测，合格后，将上述上清液分别超滤浓缩，得禽流感病毒H9亚型病毒液和禽腺病毒4型毒病毒液；
S4病毒灭活：采用0.1％福尔马林灭活步骤S3得到的禽流感病毒H9亚型病毒液和禽腺病毒4型毒病毒液，得禽流感病毒H9亚型疫苗抗原和禽腺病毒4型毒疫苗抗原；
a油相制备：取94份白油，2份硬脂酸铝，4份司盘-80，将白油加热到78℃，接着加入司盘-80和硬脂酸铝，搅拌溶解至透明，灭菌，得油相；
b水相制备：取48份步骤S4得到的禽流感病毒H9亚型疫苗抗原，48份步骤S4得到的禽腺病毒4型毒疫苗抗原，加入4份吐温-80，搅拌至完全溶解，得水相；
c乳化：将步骤a得到的油相与步骤b得到的水相混合，在15000rpm的条件下乳化5min，按照每瓶250mL进行分装，即得。
3.如权利要求1或2所述的禽流感病毒、禽腺病毒二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中的LMH细胞放置转瓶内培养。
4.如权利要求1或2所述的禽流感病毒、禽腺病毒二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中的LMH细胞放置微载体反应器内培养，微载体使用量为2～10g/L。
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