CN113376387B - 一种鸽新城疫Ⅵb亚型阳性血清标准品及其制备方法 - Google Patents

一种鸽新城疫Ⅵb亚型阳性血清标准品及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种Ⅵb亚型鸽新城疫阳性血清标准品的制备方法。该方法中制备的阳性血清标准品HI效价不低于1:128，中和效价不低于1:1600，血清能够完全中和Ⅵb亚型鸽新城疫病毒，用于血凝抑制试验阳性对照标准品和疫苗种毒特异性及外源病毒检验，在血凝抑制试验中能够保证抗体检测结果的准确性，充分反映鸽子免疫后的抗体水平，为鸽群中Ⅵb亚型新城疫流行毒株的准确监测、鸽新城疫种毒的免疫原性、特异性检验、外源病毒检验和疫苗免疫效力评价提供保障。本发明填补了研制Ⅵb亚型鸽新城疫疫苗及流行病学调查无标准阳性血清的空白。该阳性血清的制备包括鸽新城疫LY/2020/Pi株灭活疫苗的制备、动物的筛选、动物免疫程序、阳性血清的制备纯化及检验。

Description

一种鸽新城疫Ⅵb亚型阳性血清标准品及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种鸽新城疫Ⅵb亚型阳性血清标准品及其制备方法，属于兽用生物制品技术领域。
背景技术
鸽新城疫是由鸽副黏病毒Ⅰ型(pigeon paramyxovirus-1，PPMV-1)引起的流行于鸽群中的一种高度接触性传染病，临床症状同鸡新城疫相似。该病流行特点为新疫区传播迅速，发病率100％，死亡率80％以上，老疫区耐过鸽群存在带毒情况，发病率、死亡率较低，呈散发性。近几年，随着我国养鸽业的迅速发展，该病的发生呈上升趋势，甚至一些养鸽场呈暴发流行，给养鸽业带来较大的经济损失。近几年的流行调查显示，我国鸽群中流行的鸽新城疫病毒以基因Ⅵb亚型为主，与当前世界上流行的新城疫病毒优势基因Ⅶ亚型存在抗原性差异，对鸽具有明显的宿主特异性。
近几年从鸽群中分离的鸽新城疫毒株与常规鸡新城疫疫苗株La Sota株的遗传距离较远，它们的核苷酸和氨基酸与新城疫疫苗株La Sota的同源性相对较低，仅为82％～84％；在交叉病毒中和试验中，基因Ⅵ型的鸽源毒株与La Sota株间的抗原同源性低至65％左右。在交叉血凝抑制试验中，两者测定的HI效价相差2～3个滴度。
本发明是通过Ⅵb亚型鸽新城疫毒株LY/2020/Pi株制备的灭活疫苗多次免疫经筛选的阴性鸽后获得阳性血清标准品。该阳性血清标准品的研制可为鸽群中Ⅵb亚型新城疫流行毒株的准确监测、鸽新城疫种毒的免疫原性评价、特异性检验、外源病毒检验及疫苗免疫效力评价提供保障，同时可填补研制Ⅵb亚型鸽新城疫疫苗无标准阳性血清的空白。
发明内容
本发明的目的在于通过多次免疫阴性鸽后获得鸽新城疫的阳性血清标准品，用于Ⅵb亚型鸽新城疫疾病的监测、鸽源新城疫疫苗毒种的免疫原性评价、特异性检验、外源病毒检验和疫苗免疫效力的评价等。
为了实现上述目的，本发明采取了如下技术方案：
1.一种鸽新城疫Ⅵb亚型阳性血清标准品，其特征在于所述阳性血清标准品是用Ⅵb亚型鸽新城疫病毒LY/2020/Pi株抗原免疫接种健康阴性鸽；
所述的免疫抗原为鸽新城疫病毒Ⅵb亚型毒株LY/2020/Pi株疫苗，其制备方法为：用鸽新城疫病毒Ⅵb亚型毒株LY/2020/Pi株接种SPF鸡胚培养，收获感染鸡胚液，经β-丙内酯灭活后，与矿物油佐剂混合乳化制成；
所述鸽新城疫病毒LY/2020/Pi株是由中崇信诺生物科技泰州有限公司分离、提供，该毒株将送交中国科学院微生物研究所中国微生物保藏委员会普通微生物保藏中心保藏，保藏号为：CGMCC No.20289。
2.本发明所述一种鸽新城疫Ⅵb亚型阳性血清标准品的制备方法，包括：
(1)免疫用健康阴性鸽的筛选：
1)选择饲养管理条件好且满足以下条件的鸽群：采食、饮水、生长发育均正常，羽毛有光泽，警惕性强，粪便呈螺旋状，且带一点白色尿素；无细菌、病毒、寄生虫等发病史；
2)对试验鸽逐只采血，检测血清中新城疫抗体，剔除HI抗体高于1:4者；
3)应用鸽圆环病毒、鸽腺病毒、鸽痘检测试剂盒逐只检测各病毒感染情况，剔除阳性或可疑者；
4)筛选的试验鸽隔离观察一周，健康者可用于制备阳性血清。
(2)免疫抗原的制备：将Ⅵb亚型鸽新城疫病毒LY/2020/Pi株接种10日龄SPF鸡胚培养，收获感染鸡胚液，经β-丙内酯灭活后，与矿物油佐剂混合乳化制成；
(3)免疫程序为：1～2月龄阴性鸽首免，0.5mL/只；两周后二免，1.0mL/只；再两周后三免，1.0mL/只。最后一次采血时间为免疫后21～28天；
(4)阳性血清的制备及纯化：采集后静置的鸽血用5000r/min离心10min，收集血清，经层析柱纯化后，用0.22μm一次性滤器过滤除菌后混合于无菌容器中，分装保存；
(5)阳性血清标准品检验：对制备的阳性血清标准品进行无菌、支原体、外源病毒、特异性检验、HI效价及中和效价测定。其中HI效价不低于1:128，中和效价不低于1:1600；同时与鸡新城疫抗原进行交叉反应实验，用LY/2020/Pi株抗原和La Sota株抗原分别与鸽新城疫病毒阳性血清进行HI试验，HI效价分别为10.0log2和7.5log2。
本发明具体实施方式
1.鸽新城疫灭活疫苗的制备
制备鸽新城疫灭活疫苗所用疫苗株为鸽新城疫病毒LY/2020/Pi株，由中崇信诺生物科技泰州有限公司分离、鉴定，该毒株将送交中国科学院微生物研究所中国微生物保藏委员会普通微生物保藏中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.20289。
(1)抗原液的制备用重组鸽新城疫病毒LY/2020/Pi株毒种作适当稀释，尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚培养，弃去48h前死亡鸡胚。至96h，取出鸡胚冷冻，无菌收获尿囊液，抽样测定血凝价及病毒含量，同时按《中华人民共和国兽药典》(中国兽药典委员会，中华人民共和国兽药典，二〇一五年版三部，中国农业出版社，2016，以下称2015年版《中国兽药典》)附录进行无菌、支原体及外源病毒检验。将检验合格的胚液用β-丙内酯充分灭活，灭活方法：按抗原量的1/4000(V/V)加入β-丙内酯，混匀后置于4℃冰箱灭活20h，然后置于37℃水浴锅中水解2h。灭活完成后取样进行无菌检验和灭活检验。检验合格后大部分用于疫苗制备，一小部分作为血凝抑制试验抗原备用。
(2)疫苗制备油相制备：取注射用白油95份，置于油相制备罐中加热至80℃，再加入司本-805份，搅拌至透明，当温度达到125℃时维持30min，冷却后备用；水相制备：将灭活后检验合格的鸽新城疫病毒液93份，灭菌的吐温-80 7份，加入配液罐中，开动搅拌电机搅拌20～30min，使吐温-80完全溶解；之后按水油比1:3进行乳化。乳化后，取疫苗10mL加入离心管中，以3000r/min离心15min，观察管底是否有水相析出。将乳化合格的疫苗分装备用。同时取样按2015年版《中国兽药典》方法进行性状、无菌、甲醛残留量检验。检验合格的疫苗用于阳性血清的制备。
2.筛选阴性鸽
(1)初筛。选择至少三家鸽场进行调研，查看鸽场饲养管理条件，询问鸽场发病史、疫苗免疫史及兽药使用情况。排除饲养管理条件差且不能满足以下条件的鸽群：1)采食、饮水正常，羽毛有光泽，警惕性强，粪便呈螺旋状，且带一点白色尿素；2)无细菌、病毒、寄生虫等发病史。
(2)对所选鸽子逐只采血，分离血清，检测血清中新城疫抗体，剔除HI抗体高于1:4者。
(3)按照鸽圆环病毒抗体(CV-Ab)ELISA检测试剂盒说明书、鸽腺病毒PCR检测试剂盒说明书和鸽痘病毒PCR检测试剂盒说明书对(2)中分离的血清进行检测，剔除阳性或可疑者。
(4)鸽子购回后置于隔离器内饲养观察一周，健康者可用于制备阳性血清。
3.阳性血清标准品的制备及纯化
(1)将筛选的1～2月龄阴性鸽无菌采血并收集血清，分装作为阴性血清，取样进行无菌、支原体、外源病毒检验和HI效价测定。具体操作参照2015年版《中国兽药典》附录。
(2)取鸽新城疫灭活疫苗对阴性鸽进行免疫，每只鸽胸部肌肉注射0.5mL。首免两周后逐只采血，分离血清，用鸽新城疫ⅥbI4株血凝抑制抗原测定HI效价，同时进行第二次免疫，每只胸部肌肉注射灭活苗1.0mL。二免两周后逐只采血，分离血清，测定HI效价，同时进行第三次免疫，每只胸部肌肉注射灭活苗1.0mL。三免后28天采血，分离血清，测定HI效价，抗体效价达到1:512，确定采血时间，准备无菌采血。
(3)采用心脏采血或翅下静脉采血，采集后置于37℃水浴锅中静置30min，用5000r/min离心10min，收集血清，经层析柱纯化后，用0.22μm一次性滤器过滤除菌后混合于无菌容器内，1.0mL/瓶分装保存。
(4)取制备的血清进行特异性检验、HI抗体效价和中和效价测定，同时按照2015年版《中国兽药典》附录进行无菌、支原体和外源病毒检验。
本发明涉及的微生物资源信息
本发明涉及的微生物是鸽新城疫病毒LY/2020/Pi株，该毒株是由中崇信诺生物科技泰州有限公司分离、鉴定，该株病毒已于2021年06月17日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.20289。
本发明的有益效果
本发明涉及一种鸽新城疫阳性血清标准品的制备方法。通过对阴性鸽多次免疫鸽新城疫灭活疫苗来制备鸽新城疫阳性血清，主要包括疫苗制备、阴性鸽的筛选、动物免疫、阳性血清制备及检验。该方法中制备的该阳性血清的HI效价不低于1:128，中和效价不低于1:1600，能够完全中和Ⅵb亚型鸽新城疫病毒，用于血凝抑制试验阳性对照标准品和疫苗种毒特异性及外源病毒检验，在血凝抑制试验中能够保证抗体检测结果的准确性，充分反映鸽子免疫后的抗体水平，为鸽群中Ⅵb亚型新城疫流行毒株的准确监测、鸽新城疫种毒的免疫原性、特异性检验、外源病毒检验及疫苗免疫效力评价提供保障。本发明填补了研制Ⅵb亚型鸽新城疫疫苗及流行病学调查无标准阳性血清的空白。
实施例
以下实施例为进一步对本发明进行阐述，但这些实施例不构成对本发明的限制。
实施例1——鸽新城疫灭活疫苗的制备
1.1抗原液的制备：用鸽新城疫病毒LY/2020/Pi株毒种用灭菌生理盐水10-4稀释，尿囊腔内接种10日龄SPF胚，每胚0.1mL，置37℃继续孵育，弃去48h前死亡鸡胚。至96h，取出鸡胚冷冻，无菌收获尿囊液，抽样测定血凝价及病毒含量，同时按2015年版《中国兽药典》附录进行无菌、支原体及外源病毒检验。将检验合格的胚液按1/4000(V/V)加入β-丙内酯，充分混匀后置4℃灭活20h，37℃水解2h，置2～8℃保存。同时取样进行无菌检验和灭活检验。检验结果见表1。
表1 鸽新城疫抗原液检验结果
Figure GDA0004003643590000051
1.2疫苗制备
1.2.1油相制备：取注射用白油95份，置于油相制备罐中加热至80℃，再加入司本-805份，搅拌至透明，当温度达到125℃时维持30min，冷却后备用；
1.2.2水相制备：将灭活后检验合格的鸽新城疫病毒液93份，灭菌的吐温-80 7份，加入配液罐中，开动搅拌电机搅拌20～30min，使吐温-80完全溶解；
1.2.3乳化：按水油比1:3进行乳化，乳化条件为8000r/min乳化6min。乳化后，取疫苗10mL加入离心管中，以3000r/min离心15min，观察管底是否有水相析出。将乳化合格的疫苗分装，备用。同时取样按2015年版《中国兽药典》方法进行性状、无菌检验。检验结果见表2。
表2 疫苗检验结果
Figure GDA0004003643590000052
实施例2——阴性鸽的筛选
1.初筛。选择江阴、如皋及泰州高港各一家鸽场进行调研，查看鸽场饲养管理条件，询问鸽场发病史、疫苗免疫史及兽药使用情况。排除饲养管理条件差且不能满足以下条件的鸽群：1、采食、饮水正常，羽毛有光泽，警惕性强，粪便呈螺旋状，且带一点白色尿素；2、无细菌、病毒、寄生虫等发病史。经调查，三地鸽场饲养管理条件较好，一年内均未发生过细菌、病毒和寄生虫感染，从三鸽场中各选一个精神、采食、饮水、粪便及生长发育等均正常的鸽群作为候选鸽群。
2.从江阴、如皋和高港鸽场各选择30只40日龄左右的鸽子进行编号并逐只采血，分离血清，用鸡新城疫血凝抑制试验抗原检测血清中新城疫抗体，剔除HI抗体高于1:4者。经检测，江阴、如皋和高港鸽场分别有24只、6只和9只鸽子新城疫抗体为3log2～5log2，其余鸽子新城疫抗体均≤2log2。由于江阴鸽场父母代鸽6个月前免疫过新城疫疫苗，导致雏鸽的母源抗体较高，会影响免疫效果，将其排除。检测结果见表3。
表3 三地鸽子血清HI抗体检测结果
Figure GDA0004003643590000061
3.按照鸽圆环病毒抗体(CV-Ab)ELISA检测试剂盒说明书、鸽腺病毒PCR检测试剂盒说明书和鸽痘病毒PCR检测试剂盒说明书对如皋、高港鸽场分离的血清进行检测，结果除如皋鸽场028号鸽子鸽痘检验疑似弱阳性外，其余血清样品检测结果均为阴性。结合检测结果和路程实际问题，从高港鸽场选择10只鸽子带回，编号分别为382、386、388、390、397、398、399、407、409、415。
4.鸽子购回后置于隔离器内饲养观察一周，鸽子精神、采食、饮水、粪便等均正常，可用于制备阳性血清。
实施例3——鸽新城疫阴性血清的制备
将实施例2中筛选的编号为397、398的鸽子经翅下静脉无菌采血，采集后置于37℃水浴锅中静置30分钟，用5000r/min离心10min，收集血清，经纯化后，用0.22μm一次性滤器过滤除菌，1.0mL/瓶分装保存，作为阴性血清，取样进行HI试验和无菌、支原体及外源病毒检验。结果显示，所制阴性血清HI检测为阴性，且纯净性好，无细菌、霉菌、支原体及外源病毒污染。纯净性检验结果见表4。
表4 鸽新城疫阳性血清和阴性血清纯净性检验结果
Figure GDA0004003643590000071
注：“-”表示无微生物生长或阴性。
实施例4——鸽新城疫阳性血清标准品的制备
1.动物免疫：取检验合格的鸽新城疫病毒灭活疫苗对阴性鸽进行免疫，每只鸽胸部肌肉注射0.5mL。首免两周后逐只采血，分离血清，用鸽新城疫LY/2020/Pi株血凝抑制抗原测定HI效价，同时进行第二次免疫，每只胸部肌肉注射灭活苗1.0mL。二免两周后逐只采血，分离血清，测定HI效价，同时进行第三次免疫，每只胸部肌肉注射灭活苗1.0mL。三免后28天采血，分离血清，测定HI效价，编号为386、397、398、407、409、415的鸽子抗体效价均达29，确定采血时间，准备无菌采血。
2.血清制备及纯化：采用心脏无菌采血，采集后置于37℃水浴锅中静置30min，用5000r/min离心10min，收集血清，经层析柱纯化后，用0.22μm一次性滤器过滤除菌后混合于无菌容器中，1.0mL/瓶分装保存。
3.取制备的血清进行以下检验。
(1)纯净性按照2015年版《中国兽药典》附录进行无菌、支原体和外源病毒检验。结果均为阴性，说明制备的阳性血清无细菌、霉菌、支原体及外源病毒污染。检验结果见表4。
(2)特异性检验将待检血清在同一条件下分别与鸽新城疫、H5、H7、H9亚型禽流感、减蛋综合征病毒抗原进行血凝抑制试验，结果待检血清仅与鸽新城疫病毒抗原呈阳性反应(HI效价为9log2)，与H5、H7、H9亚型禽流感和减蛋综合征病毒抗原均呈阴性反应(无HI效价)，说明所制血清特异性好。结果见表5。
表5 鸽新城疫阳性血清特异性检验结果
Figure GDA0004003643590000081
注：“-”表示阴性。
(3)HI抗体效价测定按照2015年版《中国兽药典》附录进行HI效价测定，检测用抗原为鸽新城疫LY/2020/Pi株血凝抑制试验抗原。经3次重复检测，待检血清HI效价均为1:512(即9log2)。结果见表6。
表6 鸽新城疫阳性血清HI效价测定结果
Figure GDA0004003643590000082
注：1、重复3次，每次加2孔。2、“-”表示未凝集，“+”表示部分凝集，“++”表示全部凝集。
(4)中和效价测定将待检血清用灭菌生理盐水作1600、3200、6400、12800倍稀释，分别与等量的鸽新城疫LY/2020/Pi株毒种(200EID50/0.1mL)混合，置37℃作用60min。各稀释度接种10日龄SPF鸡胚5枚，0.1mL/胚。接种后置36～37℃继续孵育，48h以前死亡的鸡胚弃去不计，在48～120h死亡的鸡胚随时取出，至120h，取出所有鸡胚，逐枚收取鸡胚液，分别测定其红细胞凝集价，凝集价不低于1∶128者判为感染，按Reed-Muench法计算中和效价。经检测，所制血清中和效价为1∶5650。详见表7。
表7 鸽新城疫阳性血清中和效价测定结果
Figure GDA0004003643590000091
实施例5——与鸡新城疫抗原及阳性血清的交叉反应
用鸽新城疫病毒LY/2020/Pi株所制抗原和鸡新城疫病毒La Sota株所制抗原根据2015年版《中国兽药典》附录方法进行HI试验，每种反应各做两个平行孔。分别测定鸽新城疫阳性血清和鸡新城疫阳性血清的HI效价。结果显示用鸽新城疫病毒阳性血清分别与LY/2020/Pi株抗原和La Sota株抗原进行HI试验时，HI效价分别为10.0log2和7.5log2；用鸡新城疫病毒La Sota株阳性血清分别与LY/2020/Pi株抗原和La Sota株抗原进行HI试验时，HI效价分别为7.5log2和8.5log2。说明用鸽新城疫病毒LY/2020/Pi株制备的检测抗原及阳性血清来评价鸽新城疫灭活疫苗免疫后的抗体水平更准确。详见表8。
表8 鸽新城疫和鸡新城疫抗原及阳性血清HI交叉反应试验
Figure GDA0004003643590000092
/>

Claims (2)

1.一种鸽新城疫Ⅵb亚型阳性血清标准品，其特征在于，所述阳性血清标准品是用鸽新城疫病毒Ⅵb亚型毒株疫苗接种健康阴性鸽所制备；
所述鸽新城疫病毒Ⅵb亚型毒株疫苗，其制备方法为：用鸽新城疫病毒Ⅵb亚型毒株LY/2020/Pi株接种SPF鸡胚培养，收获感染鸡胚液，经β-丙内酯灭活后，与矿物油佐剂混合乳化制成；
所述鸽新城疫病毒LY/2020/Pi株已于2021年6月17日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.20289。
2.权利要求1所述一种鸽新城疫Ⅵb亚型阳性血清标准品的制备方法，包括：
(1)免疫用健康阴性鸽的筛选：
1)选择饲养管理条件好且满足以下条件的鸽群：采食、饮水、生长发育均正常，羽毛有光泽，警惕性强，粪便呈螺旋状，且带一点白色尿素；无细菌、病毒、寄生虫发病史；
2)对试验鸽逐只采血，检测血清中新城疫抗体，剔除HI抗体高于1:4者；
3)应用鸽圆环病毒检测试剂盒、鸽腺病毒检测试剂盒、鸽痘检测试剂盒逐只检测各病毒感染情况，剔除阳性或可疑者；
4)筛选的试验鸽隔离观察一周，健康者可用于制备阳性血清；
(2)免疫抗原的制备：将Ⅵb亚型鸽新城疫病毒LY/2020/Pi株接种10日龄SPF鸡胚培养，收获感染鸡胚液，经β-丙内酯灭活后，与矿物油佐剂混合乳化制成；
(3)免疫程序为：1～2月龄阴性鸽首免，0.5mL/只；两周后二免，1.0mL/只；再两周后三免，1.0mL/只；最后一次采血时间为免疫后21～28天；
(4)阳性血清标准品的制备及纯化：采集后静置的鸽血用5000r/min离心10min，收集血清，经层析柱纯化后，用0.22μm一次性滤器过滤除菌后混合于无菌容器中，分装保存；
(5)阳性血清标准品检验：对制备的阳性血清标准品进行无菌、支原体、外源病毒、特异性检验、HI效价及中和效价测定；其中HI效价不低于1:128，中和效价不低于1:1600；同时与鸡新城疫抗原进行交叉反应实验，用LY/2020/Pi株抗原和La Sota株抗原分别与阳性血清标准品进行HI试验，HI效价分别为10.0log2和7.5log2。
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