CN109679926B - 禽流感病毒h9亚型jxd株及应用 - Google Patents

禽流感病毒h9亚型jxd株及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及疫苗制备技术领域，尤其是一种禽流感病毒H9亚型JXD株及应用，其保藏号为CGMCC No.15495。采用该禽流感病毒H9亚型JXD株制备的疫苗组合物，包含佐剂，佐剂包括注射用白油佐剂和司本‑80，注射用白油佐剂为所述疫苗组合物的50‑75％v/v。司本‑80为所述疫苗组合物的0‑4.5％v/v。本发明的禽流感病毒H9亚型灭活疫苗，通过血清学试验HI和免疫学攻毒试验，表明制备的禽流感病毒H9亚型灭活疫苗对禽流感H9亚型具有很好的保护力。

Description

禽流感病毒H9亚型JXD株及应用
技术领域
本发明涉及疫苗制备技术领域，具体领域为一种禽流感病毒H9亚型JXD株，通过分离、鉴定并制备成预防禽流感用的灭活疫苗。
背景技术
禽流感病毒属甲型流感病毒。流感病毒属于RNA病毒的正黏病毒科，分甲、乙、丙3个型。其中甲型流感病毒多发于禽类，一些亚型也可感染猪、马、海豹和鲸等各种哺乳动物及人类；乙型和丙型流感病毒则分别见于海豹和猪的感染。甲型流感病毒呈多形性，其中球形直径80～120nm，有囊膜。基因组为分节段单股负链RNA。依据其外膜血凝素(H)和神经氨酸酶(N)蛋白抗原性的不同，目前可分为16个H亚型(H1～H16)和9个N亚型(N1～N9)。
H9N2亚型禽流感病毒感染宿主谱很广,可在家禽、野鸟、哺乳动物和人类中造成不同程度的致病性和毒力。H9N2虽然发病率高但死亡率低，一般情况下非免疫鸡群感染后发病率高,死亡率低；免疫鸡群部分鸡在免疫效果差的情况下发病,但较少死亡。鸡群在感染H9N2亚型禽流感后主要呈现呼吸、消化、生殖系统和全身组织器官轻度出血等症状和病变；可破环免疫系统，导致严重的免疫抑制，易继发大肠杆菌或其它病原(IB、ND等)的感染，造成家禽发病率和死亡率上升；引起产蛋下降,病愈后难以恢复原有水平。
目前，市场上应用的禽流感H9亚型疫苗毒株大多分离时间距今10年以上，如SS株于1994年在广东分离、F株于1998年在上海分离、HL株2007年河南分离、WD株于1998年分离自河北望都、SD696株于1996年分离自山东、NJ02株于2002年分离等等。禽流感H9HA基因容易产生变异，各禽流感基因在机体内还会发生重组，导致新的禽流感毒株出现，这为禽流感H9的防控增加了难度。采用当下流行的H9毒株制成疫苗，才能有效防控禽流感H9的发生。
发明内容
本发明的目的在于提供一种禽流感病毒H9亚型JXD株，并制成禽流感病毒灭活疫苗，用于预防禽流感病毒H9亚型。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明涉及的禽流感病毒H9亚型JXD株由南京天邦生物科技有限公司分离与鉴定，并于2018年03月23日送至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保存，保藏编号为:CGMCC No.15495，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
本发明采用上述的禽流感病毒H9亚型JXD株制备的疫苗组合物，还包含佐剂。所述佐剂包括注射用白油佐剂和司本-80。
其中，所述注射用白油佐剂为所述疫苗组合物的50-75％v/v。
其中，所述司本-80为所述疫苗组合物的0-4.5％v/v。
本发明中制备的禽流感病毒(H9亚型)灭活疫苗，其抗原成份为灭活的禽流感病毒(H9亚型)JXD株。将用SPF鸡胚制备的禽流感病毒H9亚型JXD株抗原用甲醛溶液灭活，甲醛溶液的终浓度为0.1～0.2％；将灭活的抗原与佐剂按一定的比例混合，制成油乳剂灭活苗。
本发明任一所述的疫苗组合物，还包含新城疫病毒和/或传染性支气管炎病毒。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：采用本发明禽流感病毒H9亚型JXD株制备的灭活疫苗，通过血清学试验(HI)和免疫学攻毒试验，表明制备的禽流感病毒(H9亚型)灭活疫苗对禽流感(H9亚型)具有很好的保护力。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
1.毒株分离
将江苏地区某鸡场疑似禽流感的送检的病鸡(20130108)，分别取喉头、气管和肺脏，混合、剪碎并进行研磨，冻融3次，按1∶5加入灭菌生理盐水，5000转/min离心5分钟，上清液经0.22μm滤器过滤。取10日龄SPF鸡胚5枚，尿囊腔途径接种离心后的上清液，每胚0.2ml，置37℃继续孵化，每6小时照蛋一次，随时取出死亡的胚置2～8℃冷藏，直至120小时，取出所有活胚，置2～8℃冷藏。分别收获死胚及活胚的的尿囊液，测定血凝价(HA)，并观察鸡胚的病变情况。
2.毒株的鉴定
2.1血凝性测定
5只SPF鸡胚96小时死亡2枚，120小时死亡3枚，死亡鸡胚体表充血、出血，头部出血。尿囊液对1％鸡红细胞的血凝价为29，说明分离到的病毒具有血凝性。
2.2毒株血清学鉴定
2.2.1红细胞凝集抑制试验(HI)
根据分离病毒的血凝价配制4单位血凝抗原，分别与鸡新城疫阳性血清、产蛋下降综合征病毒血凝素单抗(二F5H3)、H9亚型禽流感阳性血清及H5亚型禽流感阳性血清进行微量法血凝抑制试验。结果，只有抗H9亚型禽流感阳性血清能够抑制该分离病毒的血凝性，血凝抑制价为210，其它血清的抗体HI均为20。实验结果表明，分离到的病毒为H9亚型禽流感病毒。
2.2.2毒株血清亚型鉴定
参照WHO提供的标准方法，应用9个神经氨酸酶亚型单价禽流感参考血清对病毒尿囊液的神经氨酸酶活性进行抑制试验。结果只有抗N2亚型神经氨酸酶参考血清能抑制分离的尿囊液的神经氨酸酶活性，而其它的血清均无抑制作用，表明分离的病毒为H9N2亚型禽流感病毒。
2.3毒株HA基因的测序和比较
根据GenBank上发表的H9N2亚型AIV的HA基因序列，设计了1对引物，采用RT-PCR方法，测定分析了JXD株病毒的HA基因片段序列。设计的PCR引物序列为：
P1:5’AGCAAAAGCAGGGGAAGTTCACA3’；
P2:5’AGTAGAAACA AGGGTGTTTTTGCCAAT3’。序列如SEQ ID No:1-2所示。
按常规方法进行RT-PCR测定，结果扩增出一条大小约1700bp的条带，与预期大小相符合。
2.4毒种对鸡的感染性
将毒种用灭菌生理盐水进行稀释，静脉注射30日龄SPF鸡10只，每只0.2ml(含108EID50)。攻毒后5天，采集攻毒鸡的泄殖腔拭子，接种10日龄SPF鸡胚进行病毒分离。攻毒后的鸡只观察14天，无明显的临床症状。分离病毒阳性率为10/10。
2.5毒种的特异性检验
将毒种用灭菌生理盐水稀释为200EID50/ml，与等量抗H9亚型禽流感阳性血清充分混合，在37℃中和1小时，中途振摇1次。同时设立阳性对照组(10EID50/0.1ml)和阴性对照(生理盐水)。均经尿囊腔途径接种10日龄SPF鸡胚，每组5枚，每胚0.1ml，在37℃下培养，观察5日。结果接种10EID50病毒组的鸡胚均死亡，死亡鸡胚尿囊液均有血凝性，而血清中和组和阴性对照组鸡胚均未发生死亡，活胚尿囊液无血凝性。说明该分离的毒种中只特异性地含有H9亚型禽流感病毒。
2.6毒种的纯净性
将毒种按现行《中国兽药典》进行检测，无细菌、霉菌和支原体污染，说明毒种纯净。
实施例2
1.毒种的制备
1.1毒种的繁殖将分离的禽流感病毒H9亚型(JXD株)用灭菌生理盐水进行1000倍稀释，尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚，每胚0.1ml，在37℃培养，观察5日，弃去48小时前的死亡鸡胚，随时取出48～120小时的死亡鸡胚，置2～8℃冷藏，直至120小时，取出所有活胚，置2～8℃冷藏。收获48～120小时的死亡鸡胚及120小时活胚的尿囊液。注明收获日期、毒种代次等，置-70℃保存。并检测毒种的纯净性、血凝价、病毒含量等。
1.2毒种的克隆取经鉴定合格的毒种作10倍系列稀释，取10-8、10-9和10-10两个稀释度分别接种10日龄SPF鸡胚，每组接种5个。弃去48小时前的死亡鸡胚，随时取出48～120小时的死亡鸡胚，置2～8℃冷藏，直至120小时，取出所有活胚，置2～8℃冷藏。每胚分别测定血凝价，取稀释度最高且HA较高的鸡胚尿囊液作为毒种，以此方法盲传3代，收取稀释度最高且HA较高的鸡胚尿囊液作为基础毒种。
1.3生产毒种的制备将基础毒种进行1000～10000倍稀释，接种10日龄SPF鸡胚，弃去48小时前的死亡鸡胚，随时取出48～120小时的死亡鸡胚，置2～8℃冷藏，直至120小时，取出所有活胚，置2～8℃冷藏。收获48～120小时的死亡鸡胚及120小时活胚的尿囊液。注明收获日期、毒种代次等，置-70℃保存。并检测毒种的纯净性、血凝价、病毒含量等。此代毒种即为送至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保存的毒种。
2.灭活疫苗的制备
2.1制苗用毒液的制备
将禽流感H9亚型(JXD株)毒种用灭菌生理盐水进行10000倍稀释，尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚，每胚0.1ml，在37℃培养。弃去48小时前的死亡鸡胚，随时取出48～72小时的死亡鸡胚，置2～8℃冷藏，直至72小时，取出所有活胚，置2～8℃冷藏。无菌收取48～72小时的死亡鸡胚及72小时活胚的尿囊液。
2.2灭活
将尿囊液中加入10％的甲醛溶液，随加随摇，甲醛溶液的最终浓度为0.2％，在37℃的摇床上灭活24小时。
2.3水相的制备
将检验合格后的96份灭活抗原液与4份吐温-80混合，搅拌均匀。
2.4油相的制备
将94份Marc52白油与6份司本-80混合均匀，置121℃高压灭菌30分钟，冷至室温备用。
2.5乳化
将水相与油相按1∶3的比例混合，用FLUKO(FA25)乳化机乳化，制成灭活疫苗。
实施例3 JXD株与其它H9毒株的免疫对比试验
将禽流感病毒(H9亚型)JXD株、NJ02株(疫苗株)、JT株(市场分离株)和F株(疫苗株)分别按实施例2制备成禽流感(H9亚型)灭活疫苗，分别免疫28日龄SPF鸡，每组40只，每只0.5ml，并设空白对照，每组10只。
交叉血凝抑制(HI)效价：
免疫后21天，逐只采集各组鸡只的翅下静脉血液，分离血清。分别用JXD株、NJ02株、JT株(分离株)和F株四种抗原，制备4单位检测抗原，检测各组鸡只的血清HI抗体效价。
交叉攻毒保护：
免疫后21天，分别用JXD株、NJ02株、F株和JT株(分离株)四种H9毒株攻毒，攻毒剂量为108EID50/羽，攻毒后5天，分别采集鸡只的喉拭子和肛拭子，接种10日龄SPF鸡胚，每只鸡的样品接种3枚SPF鸡胚，以1/3鸡胚尿囊液≥4Log2判定为攻毒不保护。
各毒株的免疫原性试验结果：
不同毒株的检测抗原检测的JXD株血清HI抗体效价均≥210.29，用相应的毒株检测相应的血清，JXD株产生的血清HI抗体水平最高，为1011.19；JXD株组不但能完全抵抗同源病毒攻击，对异源(H9)病毒攻毒保护率也高达80％以上。试验结果说明，JXD株免疫原性最好，优于疫苗株NJ02株和F株、2013分离株(JT株)。
表1不同毒株制成的疫苗交叉血凝抑制(HI)效价和交叉攻毒保护结果
Figure BDA0001977461130000061
试验例4 JXD株(克隆株)与(未克隆株)免疫效力的比较
将禽流感病毒(H9亚型)JXD株、JXD株(克隆株)分别按实施例2制备成禽流感(H9亚型)灭活疫苗，分别免疫28日龄SPF鸡，每组10只，颈部皮下注射，每只0.5ml。免疫后2周、3周、4周每只鸡分别采血，分离血清，用两种毒株抗原分别检测HI效价。
试验结果
免疫后2周，两组鸡只均产生很高的抗体水平，JXD株为9.8log2，而JXD株(克隆株)为10.2log2；3周时，JXD株为11.3log2，而JXD株(克隆株)为11.7log2；4周时，JXD株为11.8log2，而JXD株(克隆株)为12.2log2。结果显示，JXD株(克隆株)免疫效果均好于未克隆组的，高出0.4个滴度。由此，我们将JXD株(克隆株)作为毒种使用。
表2 JXD株(克隆株)与(未克隆株)免疫效果的比较
Figure BDA0001977461130000071
实施例5佐剂的筛选
油相的制备：佐剂1(94％Marcol 52注射用白油+6％司本-80)；佐剂2(SEPPICISA71VG佐剂)。
样品制备：按实施例2的方法，水相∶油相＝1∶3(V/V),制备成禽流感(JXD株)灭活疫苗。
免疫：将制备好的两组油苗免疫6日龄SPF鸡，颈部皮下注射0.2ml，每组免疫15只鸡，于免疫后0天、7天、14天、21天和28天测定H9的HI抗体水平，计算HI抗体的几何平均滴度(GMT)。
表3不同佐剂对H9HI(log2)抗体水平的影响
Figure BDA0001977461130000072
结果：Marcol 52佐剂组H9HI抗体产生较快，免疫后7天、14天均高于SEPPIC佐剂组2个滴度；免疫后28天，仍比SEPPIC佐剂组高出0.23个滴度。说明Marcol 52佐剂对该H9的免疫效果较好。
实施例6 JXD株在新支流三联灭活疫苗上的应用
将制备的JXD株抗原液按实际生产工艺要求，进行离心、纯化、浓缩、灭活等，新城疫、传染性支气管炎、禽流感各抗原的比例为1∶1∶1，按水相∶油相＝1∶3(V/V)的比例，配制成新城疫、传染性支气管炎、禽流感三联灭活疫苗(La Sota株+M41株+JXD株)，并与南京天邦公司的新支流产品1(La Sota株+M41株+NJ02株)，市场上的新支流产品2(La Sota株+M41株+Re-9株)和产品3(La Sota株+M41株+YBF003株)的免疫效力进行比较。
免疫：
将含不同禽流感H9亚型毒株的4个新支流产品分别免疫28日龄SPF鸡，每组10只，每只鸡颈部皮下注射1个羽份。免疫后2周、3周、4周每只鸡分别采血，分离血清，分别检测ND、H9HI抗体水平。
21日龄SPF雏鸡45只，其中40只，用1羽份的H120株活疫苗分别滴鼻点眼免疫，另5只作为空白对照。21天后采血，并用4个新支流产品分别进行第二次免疫，每组10只，每只鸡颈部皮下注射灭活疫苗1羽，二免28天后采血，分离血清，用HI的方法分别检测各组一免和二免后血清的IB HI的抗体水平，计算一免后及二免后血清IB HI的几何平均数，并计算抗体水平增长的倍数。
攻毒：
免疫后28天，分别用108EID50/羽的JXD株攻毒，攻毒后5天，分别采集鸡只的喉拭子和肛拭子，接种10日龄SPF鸡胚，每只鸡的样品接种3枚SPF鸡胚，以1/3鸡胚尿囊液≥4Log2判定为攻毒不保护。
结果：
免疫后2周，JXD株H9HI抗体产生最快，为10.2log2，比对照1高出0.6个滴度，比对照2高了0.4个滴度，比对照3高了0.7个滴度；免疫后3周、4周也均高于其它三组对照苗0.4个滴度以上。试验组鸡只对JXD株强毒能提供100％的攻毒保护，均高于对照产品1、2、3。具体结果见表4：
表4不同新支流免疫后H9免疫效果的比较
Figure BDA0001977461130000081
免疫后2周，各组ND HI抗体水平均≥9.0log2，其中试验组与对照1至免疫后4周，ND HI效价略高于对照2和对照3。
表5不同新支流免疫后ND免疫效果的比较
Figure BDA0001977461130000091
新支流三联灭活苗二免后，产品2的IB HI抗体水平比一免后提高1.6倍；产品1、试验苗和产品3二免后IB HI抗体水平各组差异不大，为7.5log2左右，比一免后的抗体水平提高8倍以上，试验组提高的倍数最高，为10.6倍。
表6不同新支流免疫后IB免疫效果的比较
Figure BDA0001977461130000092
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
序列表
<110> 南京天邦生物科技有限公司
<120> 禽流感病毒H9亚型JXD株及应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agcaaaagca ggggaagttc aca 23
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agtagaaaca agggtgtttt tgccaat 27

Claims (9)

1.一种禽流感病毒H9亚型JXD株，其保藏号为CGMCC No.15495。
2.采用权利要求1所述的禽流感病毒H9亚型JXD株制备的疫苗组合物。
3.根据权利要求2所述的疫苗组合物，其特征在于：还包含佐剂。
4.根据权利要求3所述的疫苗组合物，其特征在于：所述佐剂包括注射用白油佐剂和司本-80。
5.根据权利要求4所述的疫苗组合物，其特征在于：所述注射用白油佐剂为所述疫苗组合物的50-75％v/v。
6.根据权利要求4所述的疫苗组合物，其特征在于：所述司本-80为所述疫苗组合物的0-4.5％v/v。
7.根据权利要求4所述的疫苗组合物，其特征在于：将用SPF鸡胚制备的禽流感病毒H9亚型JXD株抗原用甲醛溶液灭活，甲醛溶液的终浓度为0.1～0.2％；将灭活的抗原与佐剂按一定的比例混合，制成油乳剂灭活苗。
8.根据权利要求2-7任一所述的疫苗组合物，其特征在于：还包含新城疫病毒和/或传染性支气管炎病毒。
9.权利要求2-7任一所述的疫苗组合物在制备用于免疫动物以对抗由禽流感病毒H9亚型引起的感染的药物的用途。
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