CN103789273A

CN103789273A - 一种禽流感h9n2亚型病毒毒株及其应用

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Publication number: CN103789273A
Application number: CN201210488720.8A
Authority: CN
Inventors: 张坦; 郑杰; 张红; 孙丰廷; 杨国良; 王亚丽; 张凌云; 张发明; 张洪
Original assignee: BEIJING CEVA HUADU BIOLOGICAL PRODUCT Co Ltd
Current assignee: BEIJING CEVA HUADU BIOLOGICAL PRODUCT Co Ltd
Priority date: 2012-11-26
Filing date: 2012-11-26
Publication date: 2014-05-14
Anticipated expiration: 2032-11-26
Also published as: CN103789273B

Abstract

本发明提供了一种禽流感H9N2亚型病毒毒株，其保藏编号为CGMCC No.6757。本发明的禽流感H9N2亚型病毒毒株具有良好的特异性和免疫原性，鸡胚尿囊液凝集红细胞的作用不能被抗NDV阳性血清、抗EDS76阳性血清、抗M41阳性血清、抗H5亚型禽流感病毒阳性血清以及抗H 7亚型禽流感病毒子阳性血清所抑制，而能被H9亚型禽流感病毒阳性血清抑制，免疫雏鸡能产生对H9特异的HI抗体。本发明提供的禽流感H9N2亚型病毒毒株可作为疫苗毒株，预防禽类的H9亚型禽流感，还可用于禽流感病毒的鉴定和流行病学的调查，具有良好的市场应用前景。

Description

一种禽流感H9N2亚型病毒毒株及其应用

技术领域

本发明属于微生物病毒领域，具体地，涉及一种禽流感H9N2亚型病毒毒株及其应用。

背景技术

禽流感(Avian influenza，AI)是由A型禽流感病毒（Avian influenzavirus，AIV）引起的严重危害养禽业的高度传染性疾病。禽流感病毒属于正粘病毒科，流感病毒属。血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）是病毒的两种主要保护性抗原，根据HA、NA的抗原性差异，可将A型流感病毒分为不同的亚型。迄今为止，A型禽流感病毒的HA已发现16种，NA有10种，分别以H1～H16、N1～N10命名，不同H抗原或N抗原之间无交叉反应。各亚型间血凝素氨基酸序列同源性70%以下，相同亚型氨基酸序列同源性为80%~90%。流感病毒为多形性的囊膜病毒，常呈球形，直径为80~120nm，一些毒株也呈丝状或杆状。

该病于1878年首次发生于意大利，以后国内外不少学者都相继报道了该病的发生及其给养鸡业造成的巨大经济损失。H9N2亚型禽流感是目前世界上分布最广泛的禽流感病毒亚型。H9N2亚型禽流感病毒最早于1966年从北美的火鸡体内分离得到，该亚型的流感病毒最初只感染火鸡，几乎不感染鸡。但从20世纪90年代以来，H9N2亚型禽流感病毒就在亚洲很多养鸡场传播开来。该病目前已流行于世界上许多国家和地区，给养禽业造成了巨大的经济损失。在我国，高致病性禽流感以H5N1亚型为代表，低致病性禽流感以H9N2亚型为主型。

AIV血清亚型较多，不同亚型AIV甚至不同毒株对不同宿主的易感性不同，而易感性变化又会因为病毒变异而发生改变。流感病毒变异迅速，其变异的分子机制有：点突变、基因重组、缺陷性干扰粒子、 RNA组合，每一种机制都可导致AIV的进化。HA基因变异率高，是病毒发生抗原变异的主要原因。HA上潜在的糖基化位点是影响AIV毒力的可能因素之一。近年来的研究表明，HA突变导致邻近血凝素(HA)链的裂解位点上的碱性氨基酸成为优势氨基酸，后者与毒力的增强有关，从而不可避免的演变成为高致病性的毒株。HA受体结合位点的氨基酸可以影响受体结合特性，从而改变对病毒与细胞的亲和力及宿主范围。这可能就是H9N2亚型禽流感病毒毒力变异和感染谱不断扩大的真正原因。NA蛋白主要和病毒的成熟和释放有密切关系，可能会影响到病毒的复制、传播等。禽H9N2病毒的受体特异性和HB位点的变化与人流感病毒的相似性表明，一些禽类能够作为中间宿主将水禽流感病毒传播给人。Li等通过系统进化分析了中国近10年来从家禽分离出的20株H9N2的HA基因变异情况，发现有18株分离株能对其中的5株分离株所产生的抗血清产生较好的交叉反应。

由于禽流感病毒变异非常快，给禽流感防控带来困难，治疗性药物的研发周期较长，一定程度上影响了临床防控效果。接种疫苗是防控禽流感的主要手段，但由于禽流感病毒变异快，流行毒株多，血清学多且无交叉免疫，其作用大大受到限制。解决这一难题，有赖于对本地区流行的毒株的流行特点，变异特点进行研究以及筛选分离出合适的优势疫苗毒株，以使禽流感的防控更具有针对性和有效性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种禽流感H9N2亚型病毒毒株。

本发明的另一目的在于提供该禽流感H9N2亚型病毒毒株的应用。

本发明提供的一株禽流感H9N2亚型病毒毒株HF株，是在安徽某鸡场严重呼吸困难、急性死亡的鸡只的肝脏、肺脏、气管及气管干酪样物质中中分离得到的。将分离的毒株灭活后，送哈尔滨兽医研究所，做HI和NI试验，确定病毒的亚型。结果表明分离到的毒株为 H9亚型禽流感，定名为A/Chicken/Anhui/HF/2010(H9N2亚型)株(简称HF株)。该毒株已于2012年11月5日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101）保藏，分类命名为禽流感病毒H9N2亚型，保藏号为CGMCC No.6757。

在初次分离时，尿囊液血凝滴度为1∶128，凝集不被ND、AIV H5亚型和EDS76抗血清抑制，鸡胚出现规律性的出血(以脑部和爪子比较明显)；死亡时间多集中在84h～120h之间。

尽管从致鸡胚症状看，该毒株对禽类有一定的致病力。但根据分离病毒对鸡胚的致死时间、对雏鸡的致病力和鸡脑内致病指数(ICPI)的测定结果，依据国际通用标准和国际兽医局(OIE)推荐的鉴定标准，判定分离的病毒株为低致病力禽流感病毒株。

对HF株的全基因测序发现，其HA基因编码的氨基酸与经典代表毒株的部分位点氨基酸不一致，HF株的HA基因编码的氨基酸部分位点发生了突变。HF株在HA蛋白氨基酸的第63位，N突变为G；180-181位，RG/EG突变为QE；210位，T突变为K；216位，D突变为E；234位，L/Q突变为M；237位，R突变为K；283位，S突变为R；304位，H突变为Q；318-320位，VGV突变为IGI；335位，A突变为R；370位，V/T突变为A；475位，C突变为W；484位，D突变为N；491位，R突变为W。

本发明禽流感H9N2亚型病毒HF株的HA蛋白含有如SEQ IDNo.1所述的氨基酸序列。

对HF株的全基因测序还发现，其NA基因编码的氨基酸与经典代表毒株的部分位点氨基酸不一致，HF株的NA基因编码的氨基酸部分位点发生了突变。HF株在NA蛋白的氨基酸的第17位，A/T突变为I；30位，A突变为T；225位，G突变为S；260-261位，VH/AH突变为IN；第327位，N/Y突变为D；第356位，N突变为D；365 位，K/E突变为S，378位，D/G突变为N；第397-400位，SDNW/SDIR/SDNS/NNNW突变为SDSW。具体地，本发明禽流感H9N2亚型病毒NA蛋白含有如SEQ ID No.2所述的氨基酸序列。

本发明提供了含有病毒毒株HF株的诊断用抗原试剂。

本发明提供了含有病毒毒株HF株的诊断试剂盒。

本发明提供了含有病毒毒株HF株的疫苗。

本发明提供了病毒毒株HF株在制备疫苗中的应用。

本发明提供了病毒毒株HF株在制备禽流感诊断用抗原试剂中的应用。

本发明提供了病毒毒株HF株在制备禽流感诊断用阳性血清试剂中的应用。

本发明提供了病毒毒株HF株在制备禽流感治疗用抗血清试剂中的应用。

本发明的禽流感H9N2亚型病毒毒株HF株具有良好的特异性和免疫原性，鸡胚尿囊液凝集红细胞的作用不能被抗NDV阳性血清、抗EDS76阳性血清、抗H5亚型禽流感病毒阳性血清以及抗H7亚型禽流感病毒阳性血清所抑制，而能被H9亚型禽流感病毒阳性血清抑制。免疫雏鸡能产生对H9特异的HI抗体。用H9亚型特异抗血清中和后接种鸡胚，鸡胚均不死亡，而未中和的对照接种胚都死亡，这进一步说明了本发明毒株的特异性。本发明作为制造效果良好的疫苗毒株，预防禽类的H9亚型禽流感，用于病毒的鉴定和流行病学的调查。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。SPF鸡胚购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司。禽流感H5、H7和H9亚型抗血清购自哈尔滨维科生物技术有限公司；新城疫（ND）、减蛋综合征（EDS76）、传染性支气管炎病毒M41抗血清购自中国兽医药品监察所。

实施例1禽流感H9N2亚型病毒毒株HF株的分离和鉴定

1、流行病学调查

安徽某鸡场发以严重呼吸困难、急性死亡为特征的病例，7800只自20日龄草鸡在6天内陆续死亡300多只。剖检后发现几乎所有死亡鸡，支气管粘膜严重出血、支气管堵塞，充满淡黄色干酪样物质，肾脏肿大、有暗红色充血性坏死灶。

2、病毒分离

无菌采集病、死鸡支气管干酪样物质及其肝脏、脾脏、肺脏等组织,剪碎研磨后按1：5比例加入生理盐水制成悬液,置-20℃下反复冻融3次,3000r/min离心15min,取上清液用0.22μm除菌滤器过滤,将处理好的无菌组织样品经绒毛尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚,共接种10枚,0.2mL/枚,置37℃孵育,每8h照一次胚,弃去24h内非特异性死亡胚,收集24~48h死亡胚及48h未死亡胚的胚液(绒毛尿囊液、羊水)及绒毛尿囊膜,放置-20℃冻结保存备用。

按照上述方法，从病鸡的病料中分离到有血凝性的病毒，HA试验证明HF株能够凝集鸡红细胞，HI试验证明HF株的血凝性不能被新城疫病毒（NDV）抗血清、抗AIV H5亚型血清和抗AIV H7亚型血清所抑制，能被AIV H9亚型阳性血清抑制。结果见表1。

表1病料初次分离结果

3、HA和HI试验

按微量法在V型血凝试验微量板上进行，鸡红细胞浓度为1% （v/v），反应总量为0.075mL。

4、病毒继代

病毒在10-11日龄SPF鸡胚中继续传代，收获尿囊液。

5、亚型鉴定

将分离的HF株鸡胚尿囊液送哈尔滨兽医研究所流感参考实验室，进行亚型鉴定。经鉴定：HF株分离物为AIV H9N2亚型，命名为A/Chicken/Anhui/HF/2010(H9N2亚型)株，简称HF株。该毒株已于2012年11月5日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101）保藏，分类命名为禽流感病毒H9N2亚型，保藏号为CGMCC No.6757。

实施例2禽流感H9N2亚型病毒毒株HF株的毒力测定

1、1日龄鸡脑内致病指数（ICPI）测定

将第3代SPF鸡胚尿囊液用灭菌生理盐水10倍稀释，灭菌滤器过滤后，对10只1日龄雏鸡脑内注射，0.05ml/只，另取2只以同样的方法注射稀释病毒的用的灭菌生理盐水各0.05ml。隔离饲养，观察8d，记录试验结果。

按照打分系数标准（正常鸡，0分；发病鸡，1分；死亡鸡，2分）给正常、发病和死亡鸡只打分，试验结果见表2。

按照计算ICPI的公式：ICPI=（发病数+死亡数）/总观察数，计算得：ICPI=120/80=1.5。

根据国际通用标准，ICPI在1.6-2.5范围内，可判定病毒为强致病力毒株。本试验ICPI的结果为1.5，故判定分离的病毒株为低致病力禽流感病毒株。

表2脑内致病指数测定结果

2、鸡胚半数感染量（EID₅₀）的测定

将待检病毒液做10倍系列稀释，取10^-5、10^-6、10^-7、10^-84个稀释度，分别接种9-11日龄SPF鸡胚，每胚0.1mL，每个稀释度接种5枚鸡胚，另一组接种同量PBS做对照，置37℃温箱中观察120h，24h内死亡的弃去。记录鸡胚病变情况，测定鸡胚尿囊液的血凝效价，效价在1:16以上判为感染。AIV H9亚型HF株E0代鸡胚尿囊液EID₅₀测定见表3。

表3鸡胚EID₅₀的测定

由表3结果可知，HF株对鸡胚的半数感染量EID₅₀=10^-8.17/0.1mL，即将病毒悬液作10^-8.17稀释后，给鸡胚接种0.1mL，可以使50%的鸡胚感染。

3、HF株对鸡胚的毒力

将HF株第1代尿囊液毒，用无菌PBS稀释，接种9-11日龄SPF鸡胚30枚，每胚尿囊腔接种0.1mL，37℃孵育至120h，每天两次观察记录死亡胚。结果见表4。

表4HF株对鸡胚的毒力

4、HF株对雏鸡的毒力

按OIE标准和欧盟标准分别接种4周龄和6周龄鸡，虽然两组鸡均未见明显临诊症状和大体变化，但采集脏器作切片发现有明显病理组织学变化；胸腺髓质区出血、弥散性坏死；法氏囊和脾脏有弥散性坏死；心肌纤维间多淋巴细胞浸润；心肌纤维组织坏死；胰腺间质充血出血、部分腺体组织坏死；肾脏间质充血出血，部分肾小管上皮细胞核圆缩，上皮坏死。

表5HF株对雏鸡的毒力

注：分母为接种只数，分子为发病或死亡只数。

实施例3禽流感H9N2亚型病毒毒株HF株的免疫原性评价

用7-10日龄SPF鸡20只，其中10只鸡每只皮下接种1：10稀释的HF株尿囊液，另10只皮下接种生理盐水作对照，分别隔离饲养，21天后采血分离血清，用标准H9抗原作HI试验。结果见表6。结果显示该HF株具有良好的免疫原性。

表6HF株的免疫原性

实施例4禽流感H9N2亚型病毒毒株HF株的特异性评价

将HF毒种分别与禽流感H5、H7、H9亚型及ND、EDS76、M41抗血清进行HI试验。将HF株尿囊液用灭菌生理盐水作1:1000稀释，与等量AIV H9亚型特异抗血清混合，经37℃中和60min，接种SPF鸡胚10枚，每胚尿囊腔注射0.2mL，同时设H9抗血清中和NDV的对照和HF株尿囊液1:1000稀释未经中和的对照(接种0.1mL)。HF株对H9亚型等特异抗血清的HI试验，结果见表7；HF株经H9特异抗血清中和作用后鸡胚接种试验的结果见表8。

表7HF株对AIV H9、H7、H5亚型特异的抗血清和对ND、EDS76、M41抗血清的HI试验结果

表8HF株经H9特异性抗血清中和作用后鸡胚接种试验

实施例5禽流感H9N2亚型病毒毒株HF株的全基因分析

1、全基因扩增结果

利用试剂盒提取病毒E1代RNA，用PCR仪进行扩增病毒HA基因，回收PCR产物，连接到pMD18-T载体上，转化到DH5α感受态细胞内，鉴定阳性质粒送华大基因生物工程有限公司测序。

测序结果上传NCBI，结果见表9。

表9HF株全基因在NCBI索取号

2、HA基因氨基酸变异性分析

利用DNASTAR软件，将HF株的HA基因编码的氨基酸与经典代表毒株（参考毒株见表10）进行比对分析，发现该毒株属于部分位点氨基酸发生突变（见表11）。

表10HA和NA基因参考毒株

表11HA蛋白氨基酸位点变异分析

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3、NA基因氨基酸变异性分析

利用DNASTAR软件，将HF株的NA基因编码的氨基酸与经典代表毒株（参考毒株见表10）进行比对分析，发现该毒株部分位点氨基酸发生突变（见表12）。

表12NA蛋白氨基酸位点变异分析

实施例6禽流感H9N2亚型病毒毒株HF株灭活疫苗安全性试验

取2周龄SPF鸡10只，每只鸡肌肉注射禽流感病毒H9N2亚型HF株灭活疫苗1mL（用一定浓度的甲醛溶液将病毒尿囊液灭活，灭活后的尿囊液与弗氏佐剂按1:2的比例混匀，每毫升含有病毒量大于等于10⁸EID₅₀，即为HF株灭活疫苗）。同时设对照组鸡5只，连续14d，观察是否出现由禽流感H9N2亚型HF株灭活油苗接种引起的任何局部或全身不良反应。

试验结果（见表13），所有接种鸡均未有跛行症状发生，也无其他任何临床病理症状或病理变化，灭活后加弗氏佐剂的H9N2亚型禽流感病毒对接种鸡是安全的，不会造成任何的局部或全身反应。

表13SPF鸡发病和棉拭子病毒分离结果

实施例7HF株灭活疫苗免疫保护性试验

取28日龄SPF鸡20只，分为2组，10只每组，分为免疫组和对照组。免疫组接种禽流感病毒H9N2亚型HF株灭活疫苗，每只肌肉注射0.5ml，28天后，用禽流感病毒H9N2亚型HF株做攻毒试验。剩下的为对照组，只攻毒不接种疫苗。攻毒剂量均为10^5.0EID₅₀。攻毒后5天采集棉拭子，接种10日龄鸡胚分离该病毒。

通过实验可知（试验结果见表14），免疫组都没有出现疑似禽流感的临床症状，棉拭子病毒分离结果是：免疫组10只分离到病毒的数量为0，对照组10只分离到病毒的数量为10只。棉拭子结果显示禽流感病毒H9N2亚型HF株灭活疫苗能够使鸡免受该毒株的攻击，显示该毒株具有良好的免疫保护效果。

表14SPF鸡发病和棉拭子病毒分离结果

实施例8HF株免疫攻毒交叉保护试验

取商品化的禽流感H9亚型灭活疫苗H株与用本发明实施例1的禽流感H9亚型HF株制作的灭活疫苗进行交叉免疫保护试验，验证HF株灭活疫苗的免疫保护性能。

取28日龄SPF鸡50只，分为6组，第1组、第2组、第4组和第5组都是10只，第3组和第6组都是5只，第1组和第2组肌肉和皮下接种H株灭活疫苗每只0.5ml/只，第4组和第5组肌肉和皮下接种HF株灭活疫苗0.5ml/只，第3组和第6组肌肉和皮下接种无菌PBS 0.5ml/只。在免疫后28天，第1、2、3组用禽流感H9N2亚型HF株攻毒10⁵EID₅₀/只，第4、5、6组用禽流感H9N2亚型H株攻毒10⁵EID₅₀/只；攻毒后每天观察鸡群情况，观察两周，并在第5天采集口腔和泄殖腔棉拭子，进行病毒分离等。攻毒后第14天，剖检所有试验鸡，观察内脏病变等。

试验结果表明（试验结果见表15）。攻毒后，所以组别都没有出现明显的临床症状；而棉拭子病毒分离结果显示，第1组有2份棉拭子能够分离到AIV H9亚型禽流感病毒，接种PBS的第3组和第6组全部都能分离到病毒。说明禽流感病毒H9N2亚型HF株能够为鸡提供良好的保护力，防止HF株和H株的攻击；禽流感病毒H9N2亚型H株产生的抗体能够防止H毒株的攻击，而对HF株的攻击只能产生80%的免疫保护力。进一步说明本发明的禽流感H9N2亚型病毒HF株灭活疫苗具有较好的交叉保护力，能够抵抗HF株以及其他禽流感病毒株的攻击。

表15 H9亚型禽流感HF株与H株的SPF鸡免疫攻毒交叉保护实验

实施例9HF株稳定抗原的制备及稳定性试验

将禽流感病毒HF株接种10日龄SPF鸡胚，弃去24h死胚，收获 24h-96h死胚的尿囊液，将尿囊液进行灭活，离心后，加入适当佐剂制成禽流感病毒HF株的稳定抗原，该抗原在使用和储备时不存在散毒的危险，减少了因为使用活病毒抗原而对环境和人体的危害，该产品具有很好的稳定性，在2~8℃条件下，保存12个月以上该产品血凝价不变，可用于禽流感H9N2亚型的HI检测（结果见表16）。

表16HF株稳定抗原保存稳定性试验结果

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一株禽流感H9N2亚型病毒毒株HF株，其保藏编号为CGMCCNo.6757。

2.如权利要求1所述的病毒毒株HF株，其特征在于，其HA蛋白含有如SEQ ID No.1所述的氨基酸序列。

3.如权利要求1所述的病毒毒株HF株，其特征在于，其NA蛋白含有如SEQ ID No.2所述的氨基酸序列。

4.含有权利要求1~3任一所述病毒毒株HF株的诊断用抗原试剂。

5.含有权利要求1~3任一所述病毒毒株HF株的诊断试剂盒。

6.含有权利要求1~3任一所述病毒毒株HF株的疫苗。

7.权利要求1~3任一所述的病毒毒株HF株在制备疫苗中的应用。

8.权利要求1~3任一所述的病毒毒株HF株在制备禽流感诊断用抗原试剂中的应用。

9.权利要求1~3任一所述的病毒毒株HF株在制备禽流感诊断用阳性血清试剂中的应用。

10.权利要求1~3任一所述的病毒毒株HF株在制备禽流感治疗用抗血清试剂中的应用。