CN109295011A - 一株疫苗株rSN-R92G-E93K及其构建方法和应用 - Google Patents
一株疫苗株rSN-R92G-E93K及其构建方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN109295011A CN109295011A CN201811252814.9A CN201811252814A CN109295011A CN 109295011 A CN109295011 A CN 109295011A CN 201811252814 A CN201811252814 A CN 201811252814A CN 109295011 A CN109295011 A CN 109295011A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- primer
- rsn
- point mutation
- donor virus
- vaccine strain
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
- C12N15/1031—Mutagenizing nucleic acids mutagenesis by gene assembly, e.g. assembly by oligonucleotide extension PCR
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5252—Virus inactivated (killed)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
- A61K2039/552—Veterinary vaccine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
- C12N2760/16121—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
- C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
- C12N2760/16151—Methods of production or purification of viral material
- C12N2760/16152—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/10—Plasmid DNA
- C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
- C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Virology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
本发明提供了一株疫苗株rSN‑R92G‑E93K，属于流感疫苗制备技术领域，将HA基因片段制备成表达载体pHW‑SN‑HA，再对表达载体进行点突变，将得到的表达质粒SNHA‑R92G‑E93K再与含有其它基因质粒共转染细胞、重组后得到。本发明提供的疫苗株rSN‑R92G‑E93K的HI效价为11.6±0.5log2，血清中和效价为296.50±103.95log2，由此能够得出疫苗株rSN‑R92G‑E93K是一株比较理想的疫苗株。
Description
技术领域
本发明属于流感疫苗制备技术领域，具体涉及一株疫苗株rSN-R92G-E93K及其构建方法和应用。
背景技术
H9亚型低致病性禽流感病毒(Low Pathogenic Avian influenza virus，LPAIV)，虽然对家禽的致死率低，但可导致产蛋量急剧下降，同时引起免疫抑制，如混合感染可造成较高的死亡率，对我国养禽业造成的经济损失巨大。H9亚型AIV还会作为其他亚型流感病毒内部基因的供体，为新型流感病毒株的产生提供条件，引发新流感疫情的爆发，对公共卫生安全造成潜在威胁，如H9N2亚型AIV为2013年以来在我国流行的新型H7N9病毒提供了6个内部基因片段。
疫苗免疫是预防H9N2亚型禽流感发生与传播的有效手段之一，早期主要采用Ck/SD/6/9和Ck/SH/F/98等毒株制备的灭活疫苗对鸡群进行免疫以防控H9N2亚型禽流感。由于H9N2毒株抗原变异速度快，流行株常表现出与疫苗株不同的抗原特性，因此需要不断升级疫苗株以应对H9N2亚型禽流感的抗原变异。尽管如此，H9亚型的禽流感疫苗免疫失败在免疫鸡群中时有发生，甚至在免疫鸡群中爆发疫情。
禽流感病毒HA蛋白是病毒的主要抗原成分，HA蛋白抗原表位丰富，能够刺激机体产生针对这些表位的特异性抗体，抗体通过识别并结合相应抗原表位，使病毒无法吸附并感染靶细胞从而起到免疫保护的作用。所以对流感病毒HA蛋白上抗原表位变异进行监测，及时升级疫苗生产的种毒毒株，生产出针对流行株的有效疫苗对禽流感防控是至关重要的。目前已经鉴定出H9亚型HA基因与抗原性相关的多个氨基酸位置，但这些抗原表位对H9抗原性的影响及如何进行疫苗设计的研究还没有。
发明内容
本发明的目的在于提供一株疫苗株rSN-R92G-E93K，所述疫苗株的HI效价为11.1～12.1log2，血清中和效价为296.50±103.95log2，是一株理想的防制H9N2亚型禽流感疫苗。
本发明提供了一株疫苗株rSN-R92G-E93K，所述疫苗株rSN-R92G-E93K由包括以下构建方法构建得到：
1)以供体病毒的cDNA为模板，用供体病毒引物对进行PCR扩增，得到HA基因片段；
所述供体病毒为A/chicken/Fujian/SN/2014病毒株；
所述供体病毒引物对包括供体病毒上游引物和供体病毒下游引物，所述供体病毒上游引物具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，所述供体病毒下游引物具有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；
2)将所述步骤1)得到的HA片段与T载体进行连接，将得到的连接载体经BsmBⅠ、BsaⅠ酶切，得到连接载体酶切产物；
将载体pHW2000经BsmBⅠ酶切，得到载体pHW2000酶切产物；
将所述连接载体酶切产物与载体pHW2000酶切产物连接，得到表达载体pHW-SN-HA；
3)以所述步骤2)得到的表达载体pHW-SN-HA为模板，用点突变引物对进行PCR扩增，将得到的扩增产物转化感受态细胞后提取质粒，得到表达质粒SNHA-R92G-E93K；
所述点突变引物包括点突变上游引物和点突变下游引物，所述点突变上游引物具有SEQ ID No.3所示的核苷酸序列，所述点突变下游引物具有SEQ IDN o.4所示的核苷酸序列；
4)将所述步骤3)得到的表达质粒SNHA-R92G-E93K与分别含有PB2、PB1、PA、NP、NA、M和NS基因片段的质粒共转染细胞、重组，得到疫苗株rSN-R92G-E93K。
优选的，所述步骤1)用供体病毒引物对进行PCR扩增使用的体系每25μL包括：10×PCRbuffer 12.5μL，dNTP 0.5μL，浓度为25μmol/μL的供体病毒上游引物0.5μL，浓度为25μmol/μL的供体病毒下游引物0.5μL，高保真酶2μL，浓度为880ng/μL的cDNA模板2μL，ddH2O8.5μL。
优选的，所述步骤1)用供体病毒引物对进行PCR扩增的程序包括：95℃3min；95℃15s，58℃15s，72℃1.5min，共35个循环；72℃延伸10min。
优选的，所述步骤3)用点突变引物对进行PCR扩增使用的体系每25μL包括：10×PCRbuffer 12.5μL，dNTP 0.5μL，浓度为25μmol/μL的点突变上游引物0.5μL，浓度为25μmol/μL的点突变下游引物0.5μL，高保真酶2μL，模板0.5μL，ddH2O 10μL。
优选的，所述模板的浓度在300ng/μL以上。
优选的，所述步骤3)用点突变引物对进行PCR扩增的程序包括：94℃5min；94℃30s，54℃40s，72℃1min30s，共35个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
优选的，所述步骤4)细胞包括293T细胞和MDCK细胞。
优选的，所述293T细胞和MDCK细胞的数量比为(2.5～3.5):(0.5～1.5)。
本发明还提供了上述技术方案所述的疫苗株rSN-R92G-E93K的构建方法，包括以下步骤：
1)以供体病毒的cDNA为模板，用供体病毒引物对进行PCR扩增，得到HA基因片段；
所述供体病毒为A/chicken/Fujian/SN/2014病毒株；
所述供体病毒引物对包括供体病毒上游引物和供体病毒下游引物，所述供体病毒上游引物具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，所述供体病毒下游引物具有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；
2)将所述步骤1)得到的HA片段与T载体进行连接，将得到的连接载体经BsmBⅠ、BsaⅠ酶切，得到连接载体酶切产物；
将载体pHW2000经BsmBⅠ酶切，得到载体pHW2000酶切产物；
将所述连接载体酶切产物与载体pHW2000酶切产物连接，得到表达载体pHW-SN-HA；
3)以所述步骤2)得到的表达载体pHW-SN-HA为模板，用点突变引物对进行PCR扩增，将得到的扩增产物转化感受态细胞后提取质粒，得到表达质粒SNHA-R92G-E93K；
所述点突变引物包括点突变上游引物和点突变下游引物，所述点突变上游引物具有SEQ ID No.3所示的核苷酸序列，所述点突变下游引物具有SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；
4)将所述步骤3)得到的表达质粒SNHA-R92G-E93K与分别含有PB2、PB1、PA、NP、NA、M、NS基因片段的质粒共转染细胞、重组，得到疫苗株rSN-R92G-E93K。
本发明还提供了上述技术方案所述的疫苗株rSN-R92G-E93K在制备防制H9N2亚型禽流感灭活疫苗中的应用。
本发明提供了一株疫苗株rSN-R92G-E93K，以A/chicken/Fujian/SN/2014病毒株的cDNA为模版，扩增得到HA片段，将HA片段导入载体中得到表达载体pHW-SN-HA，再以表达载体为模版，用点突变引物扩增，将扩增产物转化感受态细胞再提取质粒，得到表达质粒SNHA-R92G-E93K，将表达质粒在于其它基因的7种质粒共转染细胞、重组后，得到疫苗株rSN-R92G-E93K。所述点突变引物将HA基因表达的HA蛋白抗原位点的第92位精氨酸突变为谷氨酸，将第93位谷氨酸突变为赖氨酸，再与其它基因片段进行重组，使制备得到的疫苗株的效价高于野生型，最终得到理想的防制H9N2亚型禽流感疫苗株。
本发明实施例的结果显示：本发明提供的疫苗株rSN-R92G-E93K的HI效价为11.6±0.5log2，野生型的效价为9.3±0.6log2；疫苗株的血清中和效价为296.50±103.95log2，野生型的效价为113.00±18.39log2；由此能够得出疫苗株rSN-R92G-E93K是一株比较理想的疫苗株。
附图说明
图1为HA基因PCR扩增结果。
具体实施方式
本发明提供了提供了一株疫苗株rSN-R92G-E93K，所述疫苗株rSN-R92G-E93K由包括以下构建方法构建得到：
1)以供体病毒的cDNA为模板，用供体病毒引物对进行PCR扩增，得到HA基因片段；
所述供体病毒为A/chicken/Fujian/SN/2014病毒株；
所述供体病毒引物对包括供体病毒上游引物和供体病毒下游引物，所述供体病毒上游引物具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，所述供体病毒下游引物具有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；
2)将所述步骤1)得到的HA片段与T载体进行连接，将得到的连接载体经BsmBⅠ、BsaⅠ酶切，得到连接载体酶切产物；
将载体pHW2000经BsmBⅠ酶切，得到载体pHW2000酶切产物；
将所述连接载体酶切产物与载体pHW2000酶切产物连接，得到表达载体pHW-SN-HA；
3)以所述步骤2)得到的表达载体pHW-SN-HA为模板，用点突变引物对进行PCR扩增，将得到的扩增产物转化感受态细胞后提取质粒，得到表达质粒SNHA-R92G-E93K；
所述点突变引物包括点突变上游引物和点突变下游引物，所述点突变上游引物具有SEQ ID No.3所示的核苷酸序列，所述点突变下游引物具有SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；
4)将所述步骤3)得到的表达质粒SNHA-R92G-E93K与分别含有PB2、PB1、PA、NP、NA、M和NS基因片段的质粒共转染细胞、重组，得到疫苗株rSN-R92G-E93K。
本发明以供体病毒的cDNA为模板，用供体病毒引物对进行PCR扩增，得到HA基因片段；
所述供体病毒为A/chicken/Fujian/SN/2014病毒株；
所述供体病毒引物对包括供体病毒上游引物和供体病毒下游引物，所述供体病毒上游引物具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，所述供体病毒下游引物具有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。
在本发明中，所述供体病毒为A/chicken/Fujian/SN/2014病毒株。本发明优选提取A/chicken/Fujian/SN/2014病毒株的RNA后再转录成cDNA。本发明对所述提取A/chicken/Fujian/SN/2014病毒株的RNA的方法没有特殊限定，采用常规提取病毒的RNA的方法即可。本发明对所述将RNA转录成cDNA的方法没有特殊限定，采用常规方法即可。
在本发明中，所述供体病毒引物对包括供体病毒上游引物和供体病毒下游引物，所述供体病毒上游引物具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，具体序列如下：
TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGG；
所述供体病毒下游引物具有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，具体序列如下：
ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTT。
在本发明中，所述供体病毒引物对是参照Hoffmann对流感病毒的8个片段设计得到。
在本发明中，所述用供体病毒引物对进行PCR扩增使用的体系每25μL优选包括：10×PCRbuffer 12.5μL，dNTP 0.5μL，浓度为25μmol/μL的供体病毒上游引物0.5μL，浓度为25μmol/μL的供体病毒下游引物0.5μL，高保真酶2μL，浓度为880ng/μL的cDNA模板2μL，ddH2O8.5μL。
在本发明中，所述用供体病毒引物对进行PCR扩增的程序优选包括：95℃3min；95℃15s，58℃15s，72℃1.5min，共35个循环；72℃延伸10min。
本发明将得到的HA片段与T载体进行连接，将得到的连接载体经BsmBⅠ、BsaⅠ酶切，得到连接载体酶切产物；将载体pHW2000经BsmBⅠ酶切，得到载体pHW2000酶切产物；将所述连接载体酶切产物与载体pHW2000酶切产物连接，得到表达载体pHW-SN-HA。
本发明对所述HA片段与T载体的连接方法没有特殊限定，采用常规方法即可。
本发明对得到的连接载体进行BsmBⅠ、BsaⅠ酶切的方法没有特殊限定，采用常规方法即可。
本发明对所述载体pHW2000经BsmBⅠ酶切的方法没有特殊限定，采用常规方法即可。
本发明对得到的连接载体酶切产物与载体pHW2000酶切产物连接的方法没有特殊限定，采用常规方法即可。
本发明优选将连接载体酶切产物与载体pHW2000酶切产物连接的连接物转化感受态细胞Trans1-T1，培养得到菌落后再提取质粒，得到表达载体pHW-SN-HA。
本发明以表达载体pHW-SN-HA为模板，用点突变引物对进行PCR扩增，将得到的扩增产物转化感受态细胞后提取质粒，得到表达质粒SNHA-R92G-E93K；所述点突变引物包括点突变上游引物和点突变下游引物，所述点突变上游引物具有SEQ ID No.3所示的核苷酸序列，所述点突变下游引物具有SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。
在本发明中，所述所述点突变上游引物具有SEQ ID No.3所示的核苷酸序列，具体序列如下：
ATCTACTGTTGGGAGGAGGAAAATGGTCCTACATCGT；
所述所述所述点突变下游引物具有SEQ ID No.4所示的核苷酸序列，具体序列如下：
GATGGTCTCTCGACGATGTAGGACCATTTTCCTCCT。
在本发明中，所述点突变引物对的设计思路为：通过查阅文献资料，获得目前已被鉴定出的H9亚型禽流感病毒HA蛋白上的相关抗原点的氨基酸序列。通过使用MegAlign软件，对两株不同亚系的H9亚型病毒SN株(A/chicken/Fujian/SN/2014)及YZ4株(A/chicken/Jiangsu/YZ4/2012)的HA基因序列进行对比分析，筛选出两株病毒在已知抗原位点及附近抗原区域内氨基酸序列存在的差异，发现HA蛋白抗原位点的第92位和93位存在差异，以将YZ4株差异抗原位点氨基酸替换至SN株病毒相应位点为原则，利用Primerpremier 5.0软件，参照定点突变试剂盒说明书设计点突变引物对。
在本发明中，所述用点突变引物对进行PCR扩增使用的体系每25μL优选包括：10×PCRbuffer 12.5μL，dNTP 0.5μL，浓度为25μmol/μL的点突变上游引物0.5μL，浓度为25μmol/μL的点突变下游引物0.5μL，高保真酶2μL，模板0.5μL，ddH2O 10μL。
在本发明中，所述模板的浓度优选在300ng/μL以上。
在本发明中，所述用点突变引物对进行PCR扩增的程序优选包括：94℃5min；94℃30s，54℃40s，72℃1min30s，共35个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
本发明将表达质粒SNHA-R92G-E93K与分别含有PB2、PB1、PA、NP、NA、M和NS基因片段的质粒共转染细胞、重组，得到疫苗株rSN-R92G-E93K。
本发明对所述质粒共转染细胞、重组方法没有特殊限定，采用常规方法即可。
本发明对所述含有PB2、PB1、PA、NP、NA、M或NS基因片段的质粒的制备方法没有特殊限定，采用常规即可。
在本发明中，所述细胞包括293T细胞和MDCK细胞，所述293T细胞和MDCK细胞的数量比优选为(2.5～3.5):(0.5～1.5)，更优选为3:1。
本发明还提供了上述技术方案所述的疫苗株rSN-R92G-E93K的构建方法，所述构建方法与上述技术方案所述的疫苗株rSN-R92G-E93K的构建方法相同，在此不再赘述。
本发明还提供了上述技术方案所述的疫苗株rSN-R92G-E93K在制备防制H9N2亚型禽流感灭活疫苗中的应用。
下面结合具体实施例对本发明所述的一株疫苗株rSN-R92G-E93K及其构建方法和应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
实施例1
1.血凝试验筛选候选疫苗毒株
选取不同亚系不同年份的H9N2禽流感病毒分离株A/chicken/Jiangsu/CZ02/2012(H9N2，简称CZ0)、A/chicken/Fujian/SN/2014(H9N2，简称SN)、A/chicken/Shandong/QD5/2012(H9N2，简称QD5)、A/chicken/Anhui/FY040/2014(H9N2，简称FY040)、A/chicken/Jiangsu/wj100/2015(H9N2，简称WJ100)和A/chicken/Jiangsu/YZ4/2012(H9N2，简称YZ4)作为候选株。对候选毒株进行血凝试验，测定各候选H9N2亚型AIV的HA效价，选取其中血凝效价最高的病毒，构建其HA基因表达质粒，结果见表1。
表1 H9N2亚型AIV毒株血凝效价
| 毒株 | HA效价(log<sub>2</sub>) |
| SN | 9 |
| QD5 | 7 |
| CZ20 | 7 |
| FY040 | 6 |
| WJ100 | 8 |
| YZ4 | 8 |
结果显示，SN株的HA效价为9log2，大于其他5株候选病毒。根据血凝试验结果选择SN株构建HA基因表达质粒。
2.HA片段表达质粒的构建
2.1引物设计
参照Hoffmann的扩增流感病毒HA的通用引物，合成HA片段全长扩增引物(见表2)，带下划线处为相应限制性酶的识别位点。
表2 HA扩增引物
| 引物 | 引物序列(5‘-3’) | 扩增片段 |
| Bm<sup>a</sup>-HA-F | TATT<u>CGTCTC</u>AGGGAGCAAAAGCAGGGG | HA |
| Bm-HA-R | ATAT<u>CGTCTC</u>GTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTT | HA |
注：aBm是限制性内切酶BsmBⅠ的缩写；
bBa是限制性内切酶BsaⅠ的缩写；
c下划线处是添加的限制性内切酶位点
2.2病毒RNA的提取及cDNA反转录
根据Trizol Reagent试剂说明提取病毒RNA，将A/chicken/Fujian/SN/2014病毒尿囊液8000rpm离心10min取250μL加入RNase-free的离心管中。加入500μLTrizolReagent，充分混匀后，放置5min。加入200μL三氯甲烷，剧烈混匀后，13000rpm离心10min。将上步中离心上清液450μL加入新的离心管中，再加入900μL异丙醇，混匀后放入-20℃作用5min后13000rpm离心10min。弃上清，加入1mL 75％DEPC水处理的乙醇，轻轻混匀，放入-20℃作用5min后13000rpm离心10min，弃上清。
根据HiScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒说明书进行病毒cDNA的反转录。反转录好的cDNA，于-20℃保存备用。
2.3目的片段的扩增及纯化
使用PhantaMax Super-Fidelity DNA Polymerase，以病毒cDNA为模板，扩增HA基因片段。25μL PCR体系如下：
表3 25μL PCR体系
| 10×PCR buffer | 12.5μL |
| dNTP(10Mm) | 0.5μL |
| 供体病毒上游引物(25μmol/μL) | 0.5μL |
| 供体病毒下游引物(25μmol/μL) | 0.5μL |
| 高保真酶 | 0.5μL |
| DNA模板 | 2μL |
| ddH<sub>2</sub>O | 8.5μL |
反应程序：预变性温度为95℃3min；然后以95℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸1.5min，进行35个循环，最后72℃延伸10min。
将PCR产物通过1％琼脂糖凝胶水平电泳进行鉴定，以核酸Marker GeneRuler 1kbDNALadder为标准参照，染色后观察结果，成功扩增出了SN株HA基因片段(片段大小约为1700bp)，命名为SN-HA(如图1)，核苷酸序列如SEQ ID No.11所示，具体序列如下所示：
ATGGAAACAGTACTGTTGATAACTACACTATTAGCAGTAACAACAAGCAATGCAGATAAAATCTGCATCGGCTACCAATCAACAAACTCCACAGAAACTGTAGACACACTAACAGAAAACAATGTCCCTGTGACACATGCCAAAGAACTGCTCCATACAGAACACAATGGGATGTTGTGTGCAACAAACTTGGGACATCCTCTTATTCTAGACACCTGTTCCATTGAAGGGCTAATCTACGGCAATCCTTCTTGTGATCTACTGTTGGGAGGAAGAGAATGGTCCTACATCGTCGAGAGACCATCGGCTGTTAATGGATTGTGTTACCCTGGGAATGTAGAAAATCTAGAAGAGCTAAGGTCACTTTTTAGTTCTGCTAGTTCTTATCAAAGGATCCAGATTTTCCCAGACACAATCTGGAATGTGTCTTACAATGGAACAAGCAAAGCATGTTCAGATTCATTCTACAGAAGCATGAGATGGTTGACTCAAAAGAACAACGCTTATCCTATTCAAGACGCCCAATACACAAATAATCAAGAGAAGAACATTCTTTTCATGTGGGGCATAAATCACCCACCCACCGAGACTGTGCAGACAAATCTGTACACAAGAACCGACACAACCACAAGTGTTGCAACAGAAGAAATAAATAGGACCTTCAAACCGTTGATAGGACCAAGACCTCTTGTCAATGGTTTGCAGGGAAGAATTGATTATTATTGGTCAGTATTGAAACCAGGTCAAACACTGCGAATAAGATCAAATGGGAATCTAATAGCTCCATGGTATGGACACATTCTTTCTGGAGAGAGCCACGGAAGAATCCTGAAGACTGATTTAAAAAGAGGTAGCTGTACAGTGCAATGTCAGACAGAAAAAGGTGGTTTAAACACAACATTGCCATTCCAAAATGTAAGTAAGTATGCATTTGGAAACTGCTCGAAATATGTTGGAATAAAGAGTCTCAAACTTGCAGTGGGTCTGAGGAATGTGCCTTCTAGATCTAGTAGAGGATTATTTGGGGCCATAGCTGGATTTATAGAGGGAGGTTGGTCAGGACTAGTTGCAGGTTGGTATGGATTCCAGCATTCAAATGACCAAGGGGTTGGTATGGCAGCAGATAGAGACTCAACCCAAAAGGCAATTGACAAAATAACATCCAAAGTGAATAACATAGTAGATAAAATGAACAAACAGTATGAAATTATTGATCATGAATTCAGTGAGGTTGAAAATAGACTTAACATGATCAATAATAAGATTGATGATCAAATTCAAGACATATGGGCATATAACGCAGAACTACTAGTGCTGCTTGAAAATCAGAAAACACTCGATGAACATGATGCAAATGTAAACAATCTATATAATAAAGTGAAGAGGGCATTGGGTTCCAATGCAGTGGAAGATGGGAAAGGATGTTTCGAGCTATATCACAAATGTGATGACCAGTGCATGGAGACAATTCGGAACGGGACCTACAACAGGAGGAAGTATCAAGAGGAATCAAAATTAGAAAGACAGAAAATAGAGGGGGTCAAGCTGGAATCTGAAGGAACTTACAAAATCCTCACCATTTATTCGACTGTCGCCTCATCTCTTGTGATTGCAATGGGGTTTGCTGCCTTTTTGTTCTGGGCCATGTCCAATGGGTCTTGCAGATGCAACATTTGTATATAA。
产物条带切下后，按照使用用凝胶纯化回收试剂盒说明进行目的片段的纯化，测定纯化产物的浓度和纯度。
2.5目的片段与T载体的连接
参照pEASY-Blunt3 Cloning Kit和Trans1-T1感受态细胞使用说明，将其克隆至T载体，连接产物转化Trans1-T1感受态细胞，挑斑小提质粒，经EcoRI酶切鉴定阳性的质粒送金斯瑞生物工程有限公司测序验证，测序正确的质粒-20℃保存备用。
2.6 HA片段及真核表达载体的酶切与连接
将鉴定为阳性克隆的HA质粒测定浓度后，分别用BsmBⅠ、Bsa I限制性内切酶进行酶切，将pHW2000载体用BsmBⅠ酶切。酶切后产物进行琼脂糖凝胶电泳，把相应大小条带的胶块切下并胶回收，用T4连接酶将酶切后的pHW2000载体和目的产物连接。连接产物转化感受态细胞Trans1-T，于37℃培养箱培养12-14h。挑取单个菌落于15mL氨苄LB液体培养基中培养过夜，菌落PCR鉴定，将大小正确的菌液进行测序，测序结果正确后，用QIAGEN试剂盒提取质粒，得到pHW-SN-HA，测定其浓度和纯度，选取浓度在300ng/μL以上，OD260/OD280在1.8-2.0之间的质粒保存备用。
3.抗原位点的查找与筛选
通过查阅文献资料，获得目前已被鉴定出的H9亚型禽流感病毒HA蛋白上的相关抗原点的氨基酸序列。通过使用MegAlign软件，对两株不同亚系的H9亚型病毒SN株及YZ4株的HA基因序列进行对比分析，筛选出两株病毒在已知抗原位点及附近抗原区域内氨基酸序列存在的差异，见表4。
表4抗原位点氨基酸差异
aH9序号
4.突变引物的设计
通过查找出的不同抗原位点，以将YZ4株差异抗原位点氨基酸替换至SN株病毒相应位点为原则，利用Primer premier 5.0软件，参照定点突变试剂盒说明书设计点突变引物，见表5。
表5点突变扩增引物
5.点突变表达质粒的构建及鉴定
使用定点突变试剂盒Mut Express MultiS Fast Mutagenesis Kit V2以“2.6”中构建好的pHW-SN-HA表达质粒为模板，分别用设计的点突变引物进行PCR扩增。扩增体系为：10×PCR buffer 12.5μL，dNTP(10mM)0.5μL，上游引物(25μmol/μL)0.5μL，下游引物(25μmol/μL)0.5μL，高保真酶0.5μL，质粒0.5μL(质粒浓度在300ng/μL以上)，ddH2O补足25μL；
扩增程序：94℃5min；94℃30s，54℃40s，72℃1min30s，共35个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
反应后取5μL产物进行电泳检测，确认目标质粒正确后，将扩增产物消化，去除甲基化模板质粒。
DpnⅠ0.5μL
上一步扩增产物20μL
轻轻混匀后，37℃水浴1h。
扩增产物消化后进行重组反应。在冰水浴中加入如下体系：
5×CEⅡbuffer 4μL
ExnaseⅡ2μL
DpnⅠ消化产物50-400ng
ddH2O补足20μL
轻轻混匀后，37℃水浴30min。
反应结束后，将产物转化感受态细胞Trans1-T1，涂板，待长出菌落后挑菌进行PCR和测序验证鉴定。
引物：
Bma-HA-F(SEQ ID No.1)：
TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGG；
Bm-HA-R(SEQ ID No.2)：
ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTT。
扩增体系为：10×PCR buffer 12.5μL，dNTP(10mM)0.5μL，上游引物(25μmol/μL)0.5μL，下游引物(25μmol/μL)0.5μL，高保真酶0.5μL，菌液2μL，ddH2O补足25μL。
扩增程序：94℃5min；94℃30s，54℃40s，72℃1min30s，共35个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
测序正确后，用QIAGEN试剂盒提取质粒，测定其浓度和纯度，选取浓度在300ng/μL以上，OD260/OD280在1.8-2.0之间的质粒保存备用。
6.抗原位点替换的重组病毒拯救
将构建好的抗原位点突变表达质粒SNHA-R92G-E93K、SNHA-N145S、SNHA-E196D-V198A和SNHA-L234Q分别与PR8的PB2、PB1、PA、NP、NA、M、NS基因片段的表达质粒共转染293T和MDCK混合细胞，拯救替换抗原位点的重组病毒。细胞用含10％胎牛血清的DMEM细胞培养基提前复苏并扩大培养，在转染前一天，将293T细胞及MDCK细胞以3:1的比例混匀铺于35mm的细胞培养皿，培养至细胞汇合度70％-80％时，可以进行转染，转染之前1h将细胞培养液换成1mL的无抗无血DMEM培养基。转染用每片段质粒量应为300ng，转染质粒总用量为2.4μg。取4只无菌1.5mL指形管，分别加入50μL无抗无血DMEM，再将质粒按照重组方案分别加入4个离心管中，用微量移液器轻轻吹匀。另取4只无菌指形管，分别加入50μL无抗无血DMEM和3μL PolyJetTM转染试剂，轻轻混匀。混匀后立即分别加入上述质粒溶液中(需要注意的是顺序不能颠倒)，轻轻吹吸混匀，室温孵育10-15min以形成PolyJetTM–DNA复合物，孵育结束后将混合液逐滴加入培养皿中，边加边轻微晃动以混匀。然后移入CO2细胞培养箱中静置培养。转染8-12h后，加入终浓度为2μg/mL的TPCK胰酶。转染后72h将培养皿置于-70℃反复冻融三次，收取细胞上清，接种10日龄的SPF鸡胚，0.2mL/胚，检测重组病毒拯救是否成功。每12h照胚一次，弃去24h内死亡的鸡胚。培养72h后收取鸡胚的尿囊液，并用血凝试验测定HA效价，收取有HA效价的澄清尿囊液。最终成功拯救出3株抗原位点突变病毒rSN-R92G-E93K、rSN-N145S和rSN-L234Q。同时构建野生型重组病毒作为对照，命名为rSN。
将收获的尿囊液提取RNA进行反转录并PCR，测序鉴定各序列是否正确。将血凝阳性且鉴定正确的病毒尿囊液用四抗PBS稀释10000倍，用10日龄SPF鸡胚传至第5代，测定各代次尿囊液的血凝效价，检测重组转染病毒是否能在鸡胚中稳定传代。将第5代病毒尿囊液提取RNA并反转录进行序列测定，鉴定是否发生突变，序列完全正确后进行后续试验。
7.抗原位点替换病毒与野生病毒抗血清交叉反应性
将拯救成功并稳定传代的抗原位点替换病毒与SN株及YZ4株抗血清进行交叉血凝抑制试验，分析抗原位点替换后，病毒交叉反应的变化。测定各病毒尿囊液HA效价，将病毒HA价调至2log2(4单位病毒)，在96孔血凝板中加入25μLPBS，每行第1孔加入各个重组病毒的抗血清，并将各血清倍比稀释后，再加入配好的4单位病毒，37℃条件下作用15min，作用后加入1％鸡红细胞，并转移到37℃条件下作用10min后观察结果。试验结果显示，突变病毒rSN-R92G-E93K与母本毒株SN株以及YZ4株抗血清的反应性均高于rSN。rSN-N145S株的交叉血凝抑制情况与rSN相似。而改变234位氨基酸的病毒rSN-L234与SN株及YZ4株抗血清反应性低于rSN，见表6.
表6突变病毒与野生型病毒抗血清间的血凝抑制
8.抗原位点替换病毒免疫血清与野生型病毒交叉反应性
将与两株病毒抗血清交叉反应均较好的病毒制备抗血清，测定该病毒抗血清中抗体与两株病毒的交叉反应性。
8.1病毒灭活及血清制备
取病毒rSN-R92G-E93K和rSN尿囊液，以8000r/min离心10min后取上清测定病毒灭活前HA效价，病毒尿囊液与稀释好的1:50甲醛溶液以43:7的比例混合均匀至4℃摇床放置，震摇灭活24h。取出灭活的病毒尿囊液，测定灭活后血凝效价(血凝效价>4log2时满足要求)。
在灭活好的病毒尿囊液中以24:1比例加入吐温80，混匀后，以3:1比例将白油加入灭活病毒后乳化制备疫苗。用制成的疫苗颈部皮下注射3周龄SPF鸡，0.2mL/只，每组注射5只SPF鸡。免疫后，测定血清HI效价≥7log2时可采集鸡血，若未达到则在一免后21d加强免疫一次，二免后测定血清HI效价≥7log2时采集鸡血，分离血清，冻存于-70℃冰箱中备用。
8.2交叉血凝抑制试验
测定rSN-R92G-E93K和rSN免疫血清与病毒SN及YZ4的交叉血凝抑制性。结果显示，病毒rSN-R92G-E93K的免疫血清与对于SN及YZ4病毒的血凝抑制价高于rSN免疫血清，见表7。
表7突变病毒抗血清与野生型病毒间的交叉血凝抑制
8.3血清中和试验
选取SN及YZ4毒株，测定EID50。进行中和试验时，将病毒稀释成200个EID50，使其与稀释好的血清等量混合后，每个接种剂量中含有100个EID50。选取重组病毒及野生型SN抗血清，先将血清灭活处理(56℃处理30min)，随后将血清用四抗PBS从1:10开始进行2倍连续稀释。将定量好的两种病毒分别与等体积稀释好的各组血清混合均匀，并在37℃作用1h，作用后迅速将混合物接种10日龄SPF鸡胚，每个混合物接种4个鸡胚。同时，将稀释为100个EID50的病毒接种SPF鸡胚，作为阳性对照。接种后每日观察，4天后检测鸡胚感染情况，根据Reed-Muench法计算血清中和效价。
中和试验结果显示，rSN-R92G-E93K免疫血清对病毒SN和YZ4的中和效价均高于病毒rSN免疫血清的中和效价，为后者的2-3倍，因此，rSN-R92G-E93K是一株比较理想的疫苗候选株，见表8。
表8候选株血清中和效价
由以上实施例可以得出，本发明提供的疫苗株rSN-R92G-E93K的HI效价为11.6±0.5log2，野生型的效价为9.3±0.6log2；疫苗株的血清中和效价为296.50±103.95log2，野生型的效价为113.00±18.39log2；由此能够得出疫苗株rSN-R92G-E93K是一株比较理想的疫苗株。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 扬州大学
国药集团扬州威克生物工程有限公司
<120> 一株疫苗株rSN-R92G-E93K及其构建方法和应用
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tattcgtctc agggagcaaa agcagggg 28
<210> 2
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atatcgtctc gtattagtag aaacaagggt gtttt 35
<210> 3
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atctactgtt gggaggagga aaatggtcct acatcgt 37
<210> 4
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gatggtctct cgacgatgta ggaccatttt cctcct 36
<210> 5
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
acacaatctg gaatgtgtct tacagtggaa caagc 35
<210> 6
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ctgaacatgc tttgcttgtt ccactgtaag acacatt 37
<210> 7
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
taaatcaccc acccaccgat actgcacaga caaatct 37
<210> 8
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ttcttgtgta cagatttgtc tgtgcagtat cggtgggt 38
<210> 9
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
aagacctctt gtcaatggtc agcagggaag aattgat 37
<210> 10
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ctgaccaata ataatcaatt cttccctgct gaccattg 38
<210> 11
<211> 1683
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
atggaaacag tactgttgat aactacacta ttagcagtaa caacaagcaa tgcagataaa 60
atctgcatcg gctaccaatc aacaaactcc acagaaactg tagacacact aacagaaaac 120
aatgtccctg tgacacatgc caaagaactg ctccatacag aacacaatgg gatgttgtgt 180
gcaacaaact tgggacatcc tcttattcta gacacctgtt ccattgaagg gctaatctac 240
ggcaatcctt cttgtgatct actgttggga ggaagagaat ggtcctacat cgtcgagaga 300
ccatcggctg ttaatggatt gtgttaccct gggaatgtag aaaatctaga agagctaagg 360
tcacttttta gttctgctag ttcttatcaa aggatccaga ttttcccaga cacaatctgg 420
aatgtgtctt acaatggaac aagcaaagca tgttcagatt cattctacag aagcatgaga 480
tggttgactc aaaagaacaa cgcttatcct attcaagacg cccaatacac aaataatcaa 540
gagaagaaca ttcttttcat gtggggcata aatcacccac ccaccgagac tgtgcagaca 600
aatctgtaca caagaaccga cacaaccaca agtgttgcaa cagaagaaat aaataggacc 660
ttcaaaccgt tgataggacc aagacctctt gtcaatggtt tgcagggaag aattgattat 720
tattggtcag tattgaaacc aggtcaaaca ctgcgaataa gatcaaatgg gaatctaata 780
gctccatggt atggacacat tctttctgga gagagccacg gaagaatcct gaagactgat 840
ttaaaaagag gtagctgtac agtgcaatgt cagacagaaa aaggtggttt aaacacaaca 900
ttgccattcc aaaatgtaag taagtatgca tttggaaact gctcgaaata tgttggaata 960
aagagtctca aacttgcagt gggtctgagg aatgtgcctt ctagatctag tagaggatta 1020
tttggggcca tagctggatt tatagaggga ggttggtcag gactagttgc aggttggtat 1080
ggattccagc attcaaatga ccaaggggtt ggtatggcag cagatagaga ctcaacccaa 1140
aaggcaattg acaaaataac atccaaagtg aataacatag tagataaaat gaacaaacag 1200
tatgaaatta ttgatcatga attcagtgag gttgaaaata gacttaacat gatcaataat 1260
aagattgatg atcaaattca agacatatgg gcatataacg cagaactact agtgctgctt 1320
gaaaatcaga aaacactcga tgaacatgat gcaaatgtaa acaatctata taataaagtg 1380
aagagggcat tgggttccaa tgcagtggaa gatgggaaag gatgtttcga gctatatcac 1440
aaatgtgatg accagtgcat ggagacaatt cggaacggga cctacaacag gaggaagtat 1500
caagaggaat caaaattaga aagacagaaa atagaggggg tcaagctgga atctgaagga 1560
acttacaaaa tcctcaccat ttattcgact gtcgcctcat ctcttgtgat tgcaatgggg 1620
tttgctgcct ttttgttctg ggccatgtcc aatgggtctt gcagatgcaa catttgtata 1680
taa 1683
Claims (10)
1.一株疫苗株rSN-R92G-E93K，其特征在于，所述疫苗株rSN-R92G-E93K由包括以下构建方法构建得到：
1)以供体病毒的cDNA为模板，用供体病毒引物对进行PCR扩增，得到HA基因片段；
所述供体病毒为A/chicken/Fujian/SN/2014病毒株；
所述供体病毒引物对包括供体病毒上游引物和供体病毒下游引物，所述供体病毒上游引物具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，所述供体病毒下游引物具有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；
2)将所述步骤1)得到的HA片段与T载体进行连接，将得到的连接载体经BsmB Ⅰ、Bsa Ⅰ酶切，得到连接载体酶切产物；
将载体pHW2000经BsmB Ⅰ酶切，得到载体pHW2000酶切产物；
将所述连接载体酶切产物与载体pHW2000酶切产物连接，得到表达载体pHW-SN-HA；
3)以所述步骤2)得到的表达载体pHW-SN-HA为模板，用点突变引物对进行PCR扩增，将得到的扩增产物转化感受态细胞后提取质粒，得到表达质粒SNHA-R92G-E93K；
所述点突变引物包括点突变上游引物和点突变下游引物，所述点突变上游引物具有SEQ ID No.3所示的核苷酸序列，所述点突变下游引物具有SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；
4)将所述步骤3)得到的表达质粒SNHA-R92G-E93K与分别含有PB2、PB1、PA、NP、NA、M和NS基因片段的质粒共转染细胞、重组，得到疫苗株rSN-R92G-E93K。
2.根据权利要求1所述的疫苗株rSN-R92G-E93K，其特征在于，所述步骤1)用供体病毒引物对进行PCR扩增使用的体系每25μL包括：10×PCR buffer 12.5μL，dNTP 0.5μL，浓度为25μmol/μL的供体病毒上游引物0.5μL，浓度为25μmol/μL的供体病毒下游引物0.5μL，高保真酶2μL，浓度为880ng/μL的cDNA模板2μL，ddH2O 8.5μL。
3.根据权利要求1或2所述的疫苗株rSN-R92G-E93K，其特征在于，所述步骤1)用供体病毒引物对进行PCR扩增的程序包括：95℃3min；95℃15s，58℃15s，72℃1.5min，共35个循环；72℃延伸10min。
4.根据权利要求1所述的疫苗株rSN-R92G-E93K，其特征在于，所述步骤3)用点突变引物对进行PCR扩增使用的体系每25μL包括：10×PCR buffer 12.5μL，dNTP 0.5μL，浓度为25μmol/μL的点突变上游引物0.5μL，浓度为25μmol/μL的点突变下游引物0.5μL，高保真酶2μL，模板0.5μL，ddH2O 10μL。
5.根据权利要求4所述的疫苗株rSN-R92G-E93K，其特征在于，所述模板的浓度在300ng/μL以上。
6.根据权利要求1或4所述的疫苗株rSN-R92G-E93K，其特征在于，所述步骤3)用点突变引物对进行PCR扩增的程序包括：94℃5min；94℃30s，54℃40s，72℃1min30s，共35个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
7.根据权利要求1所述的疫苗株rSN-R92G-E93K，其特征在于，所述步骤4)细胞包括293T细胞和MDCK细胞。
8.根据权利要求7所述的疫苗株rSN-R92G-E93K，其特征在于，所述293T细胞和MDCK细胞的数量比为(2.5～3.5):(0.5～1.5)。
9.权利要求1～8任意一项所述的疫苗株rSN-R92G-E93K的构建方法，包括以下步骤：
1)以供体病毒的cDNA为模板，用供体病毒引物对进行PCR扩增，得到HA基因片段；
所述供体病毒为A/chicken/Fujian/SN/2014病毒株；
所述供体病毒引物对包括供体病毒上游引物和供体病毒下游引物，所述供体病毒上游引物具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，所述供体病毒下游引物具有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；
2)将所述步骤1)得到的HA片段与T载体进行连接，将得到的连接载体经BsmB Ⅰ、Bsa Ⅰ酶切，得到连接载体酶切产物；
将载体pHW2000经BsmB Ⅰ酶切，得到载体pHW2000酶切产物；
将所述连接载体酶切产物与载体pHW2000酶切产物连接，得到表达载体pHW-SN-HA；
3)以所述步骤2)得到的表达载体pHW-SN-HA为模板，用点突变引物对进行PCR扩增，将得到的扩增产物转化感受态细胞后提取质粒，得到表达质粒SNHA-R92G-E93K；
所述点突变引物包括点突变上游引物和点突变下游引物，所述点突变上游引物具有SEQ ID No.3所示的核苷酸序列，所述点突变下游引物具有SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；
4)将所述步骤3)得到的表达质粒SNHA-R92G-E93K与分别含有PB2、PB1、PA、NP、NA、M和NS基因片段的质粒共转染细胞、重组，得到疫苗株rSN-R92G-E93K。
10.权利要求1～8任意一项所述的疫苗株rSN-R92G-E93K或权利要求9所述构建方法构建得到的疫苗株rSN-R92G-E93K在制备防制H9N2亚型禽流感灭活疫苗中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201811252814.9A CN109295011B (zh) | 2018-10-25 | 2018-10-25 | 一株疫苗株rSN-R92G-E93K及其构建方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201811252814.9A CN109295011B (zh) | 2018-10-25 | 2018-10-25 | 一株疫苗株rSN-R92G-E93K及其构建方法和应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN109295011A true CN109295011A (zh) | 2019-02-01 |
| CN109295011B CN109295011B (zh) | 2020-06-19 |
Family
ID=65157881
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201811252814.9A Active CN109295011B (zh) | 2018-10-25 | 2018-10-25 | 一株疫苗株rSN-R92G-E93K及其构建方法和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN109295011B (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109777835A (zh) * | 2019-03-01 | 2019-05-21 | 扬州大学 | 一种H9N2亚型禽流感病毒疫苗候选株rHANA3的构建方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103789273A (zh) * | 2012-11-26 | 2014-05-14 | 北京华都诗华生物制品有限公司 | 一种禽流感h9n2亚型病毒毒株及其应用 |
| CN103789272A (zh) * | 2012-10-31 | 2014-05-14 | 普莱柯生物工程股份有限公司 | H9亚型禽流感病毒分离株以及由其制得的疫苗组合物 |
| CN105671002A (zh) * | 2015-10-09 | 2016-06-15 | 华中农业大学 | H9n2亚型禽流感病毒细胞高产疫苗株构建及应用 |
-
2018
- 2018-10-25 CN CN201811252814.9A patent/CN109295011B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103789272A (zh) * | 2012-10-31 | 2014-05-14 | 普莱柯生物工程股份有限公司 | H9亚型禽流感病毒分离株以及由其制得的疫苗组合物 |
| CN103789273A (zh) * | 2012-11-26 | 2014-05-14 | 北京华都诗华生物制品有限公司 | 一种禽流感h9n2亚型病毒毒株及其应用 |
| CN105671002A (zh) * | 2015-10-09 | 2016-06-15 | 华中农业大学 | H9n2亚型禽流感病毒细胞高产疫苗株构建及应用 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| ZHU R ET AL: "Genetic and biological characterization of H9N2 avian influenza viruses isolated in China from 2011 to 2014", 《PLOS ONE》 * |
| 叶贺佳 等: "2012-2015年H9N2亚型AIV分离株HA基因的克隆及序列分析", 《中国畜牧兽医》 * |
| 徐丹雯 等: "H9N2亚型禽流感病毒的序列分析及其生物学特性研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 农业科技辑 D050-931》 * |
| 王冬冬 等: "2010-2014年山东H9N2亚型禽流感病毒分离鉴定及HA和NA基因序列分析", 《畜牧兽医学报》 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109777835A (zh) * | 2019-03-01 | 2019-05-21 | 扬州大学 | 一种H9N2亚型禽流感病毒疫苗候选株rHANA3的构建方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN109295011B (zh) | 2020-06-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Saito et al. | Characterization of a human H9N2 influenza virus isolated in Hong Kong | |
| JP5261338B2 (ja) | 低温適応性ウマインフルエンザウィルス | |
| US7399477B2 (en) | Cold-adapted equine influenza viruses | |
| CN109563492A (zh) | 突变的病毒、其制备方法和应用 | |
| US20070196388A1 (en) | Cold-adapted equine influenza viruses | |
| CN104962581B (zh) | 一种表达非洲猪瘟病毒p72蛋白的重组病毒疫苗株 | |
| CN103451158A (zh) | 用于犬科动物中呼吸系统疾病控制的物质和方法 | |
| CN104232594B (zh) | 重组类禽型h1n1流感病毒灭活疫苗株(js40/pr8)及其制备方法和应用 | |
| CN101508978B (zh) | 一株鸡源h9n2禽流感病毒毒株的分离鉴定和纯化方法及其应用 | |
| CN110305898A (zh) | 哺乳动物细胞非易感h9n2亚型冷适应禽流感病毒的拯救 | |
| US11607448B2 (en) | Whole avian-origin reverse genetic system and its use in producing H7N9 subtype avian influenza vaccine | |
| US11512117B1 (en) | Whole avian-origin reverse genetic system and recombinant H5N2 subtype avian influenza virus, vaccine and uses thereof | |
| CN110680912B (zh) | H3n2和h3n8亚型犬流感二价灭活苗及其制备方法与应用 | |
| CN109266623B (zh) | 一株疫苗株rSHA-△200及其构建方法和应用 | |
| CN104830811A (zh) | H9n2亚型禽流感病毒ns1基因缺失减毒活疫苗候选株及其构建方法和应用 | |
| CN109295011A (zh) | 一株疫苗株rSN-R92G-E93K及其构建方法和应用 | |
| CN109777835A (zh) | 一种H9N2亚型禽流感病毒疫苗候选株rHANA3的构建方法 | |
| CN104073470A (zh) | 一种h9n2亚型禽流感病毒的转瓶培养方法 | |
| CN107353328A (zh) | 一种重组的h9n2亚型禽流感病毒样颗粒及其制备方法和用途 | |
| Park et al. | Seroprevalence of mumps in healthcare workers in South Korea | |
| EP3715459B1 (en) | H9 avian influenza vaccine strain which differentiates infected from vaccinated animals, and preparation method therefor | |
| CN108300702B (zh) | 一株鸡源h9n2禽流感病毒冷适应株筛选方法及其应用 | |
| CN100410378C (zh) | 编码禽流感血凝素的基因及其植物表达载体和应用 | |
| CN109943576A (zh) | 一种嵌合犬瘟热病毒主要免疫基因的重组狂犬病病毒及其应用 | |
| CN100467591C (zh) | 重组禽流感病毒毒株、其制备方法及由其制得的疫苗 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |