CN109777835A - 一种H9N2亚型禽流感病毒疫苗候选株rHANA3的构建方法 - Google Patents

Abstract

一种H9N2亚型禽流感病毒疫苗候选株rHANA3的构建方法，属于禽流感疫苗研制技术领域，通过红细胞解凝试验从本实验室分离、保存的毒株中筛出三株解凝速度不同的H9N2亚型禽流感病毒，构建其NA片段的真核表达质粒，并以毒株构建HA片段表达质粒，运用8质粒拯救系统，以H1N1的内部基因为骨架，获得NA片段不同的疫苗候选株病毒，免疫鸡制备血清，挑选出血清交叉中和能力好的毒株作为疫苗候选株，本发明构建方法科学，原理清晰，通过该方法制备的疫苗抗血清可提高对Y280‑Like和F98‑Like病毒的交叉反应性以及中和效价，克服现有疫苗只能保护单一抗原型及交叉保护差的问题，大大节约了成本，为流感防控提供更为有效的工具，为研制广谱型疫苗提供了一种新方法。

Description

一种H9N2亚型禽流感病毒疫苗候选株rHANA3的构建方法

技术领域

本发明属于禽流感疫苗研制技术领域，涉及一种广谱性H9N2亚型AIV反向遗传灭活疫苗的研制方法，特别是涉及一种Y280-Like、F98-Like H9N2亚型禽流感病毒疫苗候选株rHANA3的构建方法。

背景技术

H9N2亚型AIV引起的通常为低致病性禽流感，其本身引发的禽类死亡率较低，但由于其分布范围广泛和传播速度较快，感染后会使蛋鸡产蛋量急剧下降，肉鸡生长缓慢，降低料肉比，对家禽养殖业造成了巨大的经济损失。H9亚型AIV感染后容易导致禽类自身免疫力的急剧下降，从而出现和其他细菌或病毒的并发或继发感染导致死亡率的升高。另外，H9N2亚型AIV可以感染人，表现为轻度的流感症状，不会致人死亡。H9亚型AIV还会作为其他亚型流感病毒内部基因的供体，为新型流感病毒株的出现提供条件，引发人类流感疫情的爆发，对公共卫生安全造成潜在威胁。自2013年以来，研究者们发现目前在中国流行的H9N2亚型AIV为在人类中分离的新型H7N9和H10N8病毒提供了6个内部基因片段。

疫苗免疫是预防H9N2亚型禽流感发生与传播的有效手段之一。我国自1998年来主要采用Ck/SD/6/9和Ck/SH/F/98等毒株制备的灭活疫苗对鸡群进行免疫以防控H9N2亚型禽流感。H9N2亚型AIV具有流感病毒的变异特性，其变异模式主要有两种，一种是抗原转换，变异原因是不同毒株基因片段之间发生了重配，这种基因片段间的重配可能会引起病毒基因组的改变，产生人类尚缺乏免疫力的新毒株，从而引发新病毒在人群中的暴发流行。另一种是抗原漂移，这种变异是病毒基因组自发的点突变引起的小幅度变异，当这种改变积累到一定程度或者突变氨基酸刚好改变了病毒的抗原决定簇，就会引起病毒抗原性的改变。AIV基因组中突变频率最高的是HA基因，其次是NA基因。由于H9N2毒株抗原变异速度快，目前的流行株已经表现出了与疫苗株不同的抗原特性，所以自2009年以来，H9免疫失败在免疫鸡群中时有发生，特别是2010-2013年期间，H9N2亚型流感病毒的持续变异导致H9N2亚型禽流感在我国免疫鸡群中加剧发生，病毒持续在鸡群中流行，甚至在免疫鸡群中爆发。H9N2亚型禽流感病毒的抗原多样性以及防控现状提示我们，研制交叉保护性较好的新型广谱性H9N2亚型禽流感疫苗显得十分必要。

发明内容

本发明的目的是针对目前H9N2毒株抗原变异速度快，流行株已经表现出了与疫苗株不同的抗原特性，由于抗原的持续变异导致H9N2亚型禽流感近年来在我国免疫鸡群中加剧发生，病毒持续在鸡群中流行，对家禽养殖业造成巨大经济损失等不足，提出一种H9N2亚型禽流感病毒疫苗候选株rHANA3的构建方法及应用，通过该方法可提高对Y280-Like和F98-Like病毒的交叉反应性以及中和效价，克服现有疫苗只能保护单一抗原型及交叉保护差的问题，大大节约了成本，为流感防控提供更为有效的工具，为研制广谱型疫苗提供了一种新方法。

本发明的技术方案：一种H9N2亚型禽流感病毒疫苗候选株rHANA3的构建方法，其特征在于，所述构建方法如下：

(1)解凝试验筛选不同解凝速度的H9N2亚型毒株

分离鉴定保存H9N2AIV：W2-17、SN、QD5、FY2014040、WJ100和YZ4作为候选株，将候选H9N2亚型禽流感病毒经2倍梯度稀释后，再加等量的1％鸡红细胞，4℃作用30min后转移至37℃中，每隔一小时记录每个病毒株的HA效价，绘制解凝曲线，分析病毒解凝速度，筛选毒株；

(2)血凝试验筛选HA片段

对候选毒株进行血凝试验，测定各候选H9N2亚型AIV的HA效价，选取其中血凝效价最高的病毒，构建其HA基因表达质粒；

(3)HA及NA片段表达质粒的构建方法如下：

(3-1)引物设计

参照Hoffmann对流感病毒的8个片段设计的通用引物，设计HA及NA片段全长扩增引物；

(3-2)病毒RNA的提取及cDNA反转录

根据Trizol Reagent试剂说明提取病毒RNA；将病毒尿囊液8000rpm离心10min取250μL加入RNase-free的离心管中；加入500μL Trizol Reagent，充分混匀后，放置5min；加入200μL三氯甲烷，剧烈混匀后，13000rpm离心10min；将上步中离心上清液450μL加入新的离心管中，再加入900μL异丙醇，混匀后放入-20℃作用5min后13000rpm离心10min；弃上清，加入1mL 75％DEPC水处理的乙醇，轻轻混匀，放入-20℃作用5min后13000rpm离心10min，弃上清；根据HiScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒说明书进行病毒cDNA的反转录；反转录好的cDNA，于-20℃保存备用；

(3-3)目的片段的扩增及纯化

(3-3-1)使用Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase，以病毒cDNA为模板，扩增HA及NA基因片段，25μL PCR体系如下：10×PCR buffer/12.5μL、dNTP(10Mm)/0.5μL、上游引物(25μmol/μL)/0.5μL、下游引物(25μmol/μL)/0.5μL、高保真酶/0.5μL、DNA模板/2μL、ddH2O/8.5μL；

(3-3-2)反应程序：预变性温度为95℃3min；然后以95℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸1.5min，进行35个循环，最后72℃延伸10min；

(3-3-3)将PCR产物通过1％琼脂糖凝胶水平电泳进行鉴定，以核酸MarkerGeneRuler 1kb DNA Ladder为标准参照，染色后观察结果，成功扩增出了SN株HA基因片段，命名为SN-HA，以及三株病毒的NA基因片段，分别命名为NA1、NA2和NA3；

(3-3-4)将PCR产物条带切下后，按照使用用凝胶纯化回收试剂盒说明进行目的片段的纯化，测定纯化产物的浓度和纯度；

(3-4)目的片段与T载体的连接

参照pEASY-Blunt3Cloning Kit和Trans1-T1感受态细胞使用说明，将其克隆至T载体，连接产物转化Trans1-T1感受态细胞，挑斑小提质粒，经EcoR I酶切鉴定阳性的质粒送金斯瑞生物工程有限公司测序验证，测序正确的质粒-20℃保存备用；

(3-5)HA、NA片段及真核表达载体的酶切与连接

将鉴定为阳性克隆的HA及NA质粒测定浓度后，分别用BsmBⅠ、Bsa I限制性内切酶进行酶切，将pHW2000载体用BsmBⅠ酶切，酶切后产物进行琼脂糖凝胶电泳，把相应大小条带的胶块切下并胶回收，用T4连接酶将酶切后的pHW2000载体和目的产物连接，连接产物转化感受态细胞Trans1-T，于37℃培养箱培养12-14h，挑取单个菌落于15mL氨苄LB液体培养基中培养过夜，菌落PCR鉴定，将大小正确的菌液进行测序，测序结果正确后，用QIAGEN试剂盒提取质粒，测定其浓度和纯度，选取浓度在300ng/μL以上，OD260/OD280在1.8-2.0之间的质粒保存备用；

(4)病毒拯救

(4-1)将构建好的HA片段表达质粒pHW-SN-HA分别与构建好的不同解凝速度病毒的NA片段表达质粒pHW-NA1、pHW-NA2以及pHW-NA3组合，以PR8其余6个片段为骨架进行转染，同时转染pHW-SN-HA与PR8其他7个片段组合的重组病毒作为对照；

(4-2)用含10％胎牛血清的DMEM细胞培养基提前复苏并扩大培养293T细胞和MDCK细胞，在转染前一天，将293T细胞及MDCK细胞以3:1的比例混匀铺于35mm的细胞培养皿，培养至细胞汇合度70％-80％时，可以进行转染，转染之前1h将细胞培养液换成1mL的无抗无血DMEM培养基；转染用每片段质粒量应为300ng，转染质粒总用量为2.4μg；取4只无菌1.5mL指形管，分别加入50μL无抗无血DMEM，再将质粒按照重组方案分别加入4个离心管中，用微量移液器轻轻吹匀；另取4只无菌指形管，分别加入50μL无抗无血DMEM和3μL PolyJet^TM转染试剂，轻轻混匀；混匀后立即分别加入上述质粒溶液中，轻轻吹吸混匀，室温孵育10-15min以形成PolyJet^TM–DNA复合物，孵育结束后将混合液逐滴加入培养皿中，边加边轻微晃动以混匀；然后移入CO2细胞培养箱中静置培养；转染8-12h后，加入终浓度为2μg/mL的TPCK胰酶；转染后72h将培养皿置于-70℃反复冻融三次，收取细胞上清，接种10日龄的SPF鸡胚，0.2mL/胚，检测重组病毒拯救是否成功；每12h照胚一次，弃去24h内死亡的鸡胚；培养72h后收取鸡胚的尿囊液，并用血凝试验测定HA效价，收取有HA效价的澄清尿囊液；

(4-3)将收获的尿囊液提取RNA进行反转录并PCR，测序鉴定各序列是否正确；将血凝阳性且鉴定正确的病毒尿囊液用四抗PBS稀释10000倍，用10日龄SPF鸡胚传至第5代，测定各代次尿囊液的血凝效价，检测重组转染病毒是否能在鸡胚中稳定传代；将第5代病毒尿囊液提取RNA并反转录进行序列测定，鉴定是否发生突变，序列完全正确后进行后续试验；

(5)候选株病毒血清交叉反应性

(5-1)病毒灭活及血清制备

(5-1-1)取重组病毒及母本病毒SN株尿囊液，以8000r/min离心10min后取上清测定病毒灭活前HA效价，病毒尿囊液与稀释好的1:50甲醛溶液以43:7的比例混合均匀至4℃摇床放置，震摇灭活24h；取出灭活的病毒尿囊液，测定灭活后血凝效价，血凝效价>4log₂时满足要求；

(5-1-2)在灭活好的病毒尿囊液中以24:1比例加入吐温80，混匀后，以3:1比例将白油加入灭活病毒后乳化制备疫苗；用制成的疫苗颈部皮下注射3周龄SPF鸡，0.2mL/只，每组注射5只SPF鸡；免疫后，测定血清HI效价≥7log₂时可采集鸡血，若未达到则在一免后21d加强免疫一次，二免后测定血清HI效价≥7log₂时采集鸡血，分离血清，冻存于-70℃冰箱中备用；

(5-2)血清交叉血凝抑制试验

(5-2-1)测定各病毒尿囊液HA效价，将病毒HA价调至2log₂，在96孔血凝板中加入25μL PBS，每行第1孔加入各个重组病毒的抗血清，并将各血清倍比稀释后，再加入配好的4单位病毒，37℃条件下作用15min，作用后加入1％鸡红细胞，并转移到37℃条件下作用10min后观察结果；

(5-2-2)选取不同亚系不同年份的H9N2禽流感病毒分离株进行交叉血凝抑制试验；其中W2-17、QD5、WJ100、TX和28-1株属于Y280-Like，WXQ株为G1-Like，YZ4株为F98-Like；

(5-3)血清中和试验

(5-3-1)选取SN及YZ4毒株，测定EID₅₀；进行中和试验时，将病毒稀释成200个EID₅₀，使其与稀释好的血清等量混合后，每个接种剂量中含有100个EID₅₀；选取重组病毒及野生型SN抗血清，先将血清灭活处理(56℃处理30min)，随后将血清用四抗PBS从1:10开始进行2倍连续稀释；将定量好的两种病毒分别与等体积稀释好的各组血清混合均匀，并在37℃作用1h，作用后迅速将混合物接种10日龄SPF鸡胚，每个混合物接种4个鸡胚；同时，将稀释为100个EID₅₀的病毒接种SPF鸡胚，作为阳性对照；接种后每日观察，4天后检测鸡胚感染情况，根据Reed-Muench法计算血清中和效价；

(5-3-2)中和试验结果显示，候选株rHANA3组血清对Y280-Like病毒SN的中和效价高于rHANA1、rHANA2、rHANAPR8及野生型病毒SN组抗血清；对F98-Like病毒YZ4的中和效价高于rHANA1、rHANA2及野生型病毒SN组抗血清。

本发明的有益效果为：本发明提出的一种H9N2亚型禽流感病毒疫苗候选株rHANA3的构建方法，构建方法科学，原理清晰，通过红细胞解凝试验从本实验室分离、保存的毒株中筛出三株解凝速度不同的H9N2亚型禽流感病毒，构建其NA片段的真核表达质粒，并以毒株构建HA片段表达质粒，运用8质粒拯救系统，以H1N1的内部基因为骨架，获得NA片段不同的疫苗候选株病毒，免疫鸡制备血清，挑选出血清交叉中和能力好的毒株作为疫苗候选株，通过该方法制备的疫苗抗血清可提高对Y280-Like和F98-Like病毒的交叉反应性以及中和效价，克服现有疫苗只能保护单一抗原型及交叉保护差的问题，大大节约了成本，为流感防控提供更为有效的工具，为研制广谱型疫苗提供了一种新方法。

附图说明

图1是本发明中H9N2亚型AIV的红细胞解凝曲线图。

图2是本发明中HA基因PCR扩增结果图。

图3是本发明中NA基因PCR扩增结果图。

具体实施方式

下面结合实施方式对本发明作进一步说明：

1.解凝试验筛选不同解凝速度的H9N2亚型毒株

以本实验室分离鉴定保存H9N2AIV：A/chicken/Jiangsu/CZ02/2012(H9N2，简称W2-17)、A/chicken/Fujian/Shengnong/2014(H9N2，简称SN)、A/chicken/Shandong/QD5/2012(H9N2，简称QD5)、A/chicken/Anhui/FY040/2014(H9N2，简称FY2014040)、A/chicken/Jiangsu/wj100/2015(H9N2，简称WJ100)、和A/chicken/Jiangsu/YZ4/2012(H9N2，简称YZ4)作为候选株，将候选H9N2亚型禽流感病毒经2倍梯度稀释后，再加等量的1％鸡红细胞，4℃作用30min后转移至37℃中，每隔一小时记录每个病毒株的HA效价，绘制解凝曲线，分析病毒解凝速度，筛选毒株。结果见图1。

解凝试验结果显示，W2-17、FY201404两株病毒2h可完全解凝；病毒QD5 3h可完全解凝；SN在5h时完全解凝；WJ100经过10h可完全解凝，而病毒YZ410h后也不能够完全解凝。我们筛选出了W2-17(解凝速度较快)、SN(解凝速度中等)及YZ4(解凝速度慢)的NA基因片段来构建表达质粒。

2.血凝试验筛选HA片段

对候选毒株进行血凝试验，测定各候选H9N2亚型AIV的HA效价，选取其中血凝效价最高的病毒，构建其HA基因表达质粒。结果显示(见表1)，SN株的HA效价为9log₂，大于其他5株候选病毒。根据血凝试验结果选择SN株构建HA基因表达质粒。

表1H9N2亚型AIV毒株血凝效价

3.HA及NA片段表达质粒的构建

3.1引物设计

参照Hoffmann对流感病毒的8个片段设计的通用引物，设计HA及NA片段全长扩增引物(见表2)，带下划线处为相应限制性酶的识别位点。

表2HA、NA全长扩增引物

^a Bm is the abbreviation for the BsmBⅠrestriction enzyme.

^b Ba is the abbreviation for the BsaⅠrestriction enzyme.

^c The residues of the restriction enzymes introduced in the primersare shown with underline.

3.2病毒RNA的提取及cDNA反转录

根据Trizol Reagent试剂说明提取病毒RNA。将病毒尿囊液8000rpm离心10min取250μL加入RNase-free的离心管中。加入500μL Trizol Reagent，充分混匀后，放置5min。加入200μL三氯甲烷，剧烈混匀后，13000rpm离心10min。将上步中离心上清液450μL加入新的离心管中，再加入900μL异丙醇，混匀后放入-20℃作用5min后13000rpm离心10min。弃上清，加入1mL 75％DEPC水处理的乙醇，轻轻混匀，放入-20℃作用5min后13000rpm离心10min，弃上清。

根据HiScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒说明书进行病毒cDNA的反转录。反转录好的cDNA，于-20℃保存备用。

3.3目的片段的扩增及纯化

使用Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase，以病毒cDNA为模板，扩增HA及NA基因片段。25μL PCR体系如下

反应程序：预变性温度为95℃3min；然后以95℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸1.5min，进行35个循环，最后72℃延伸10min。

将PCR产物通过1％琼脂糖凝胶水平电泳进行鉴定，以核酸MarkerGeneRuler1kbDNA Ladder为标准参照，染色后观察结果，成功扩增出了SN株HA基因片段(片段大小约为1700bp)，命名为SN-HA(如图2，图中M:1Kb plus Marker；1:SN-HA)，以及三株病毒的NA基因片段(片段大小约为1400bp)，分别命名为NA1、NA2和NA3(如图3，图中M:1Kb plus Marker；1:NA1；2:NA2；3:NA3)。

将PCR产物条带切下后，按照使用用凝胶纯化回收试剂盒说明进行目的片段的纯化，测定纯化产物的浓度和纯度。

3.4目的片段与T载体的连接

参照pEASY-Blunt3Cloning Kit和Trans1-T1感受态细胞使用说明，将其克隆至T载体，连接产物转化Trans1-T1感受态细胞，挑斑小提质粒，经EcoR I酶切鉴定阳性的质粒送金斯瑞生物工程有限公司测序验证，测序正确的质粒-20℃保存备用。

3.5HA、NA片段及真核表达载体的酶切与连接

将鉴定为阳性克隆的HA及NA质粒测定浓度后，分别用BsmBⅠ、Bsa I限制性内切酶进行酶切，将pHW2000载体用BsmBⅠ酶切。酶切后产物进行琼脂糖凝胶电泳，把相应大小条带的胶块切下并胶回收，用T4连接酶将酶切后的pHW2000载体和目的产物连接。连接产物转化感受态细胞Trans1-T，于37℃培养箱培养12-14h。挑取单个菌落于15mL氨苄LB液体培养基中培养过夜，菌落PCR鉴定，将大小正确的菌液进行测序，测序结果正确后，用QIAGEN试剂盒提取质粒，测定其浓度和纯度，选取浓度在300ng/μL以上，OD260/OD280在1.8-2.0之间的质粒保存备用。

4.病毒拯救

将构建好的HA片段表达质粒pHW-SN-HA分别与构建好的不同解凝速度病毒的NA片段表达质粒pHW-NA1、pHW-NA2以及pHW-NA3组合，以PR8其余6个片段为骨架进行转染。同时转染pHW-SN-HA与PR8其他7个片段组合的重组病毒作为对照。

用含10％胎牛血清的DMEM细胞培养基提前复苏并扩大培养293T细胞和MDCK细胞，在转染前一天，将293T细胞及MDCK细胞以3:1的比例混匀铺于35mm的细胞培养皿，培养至细胞汇合度70％-80％时，可以进行转染，转染之前1h将细胞培养液换成1mL的无抗无血DMEM培养基。转染用每片段质粒量应为300ng，转染质粒总用量为2.4μg。取4只无菌1.5mL指形管，分别加入50μL无抗无血DMEM，再将质粒按照重组方案分别加入4个离心管中，用微量移液器轻轻吹匀。另取4只无菌指形管，分别加入50μL无抗无血DMEM和3μL PolyJet^TM转染试剂，轻轻混匀。混匀后立即分别加入上述质粒溶液中(需要注意的是顺序不能颠倒)，轻轻吹吸混匀，室温孵育10-15min以形成PolyJet^TM–DNA复合物，孵育结束后将混合液逐滴加入培养皿中，边加边轻微晃动以混匀。然后移入CO2细胞培养箱中静置培养。转染8-12h后，加入终浓度为2μg/mL的TPCK胰酶。转染后72h将培养皿置于-70℃反复冻融三次，收取细胞上清，接种10日龄的SPF鸡胚，0.2mL/胚，检测重组病毒拯救是否成功。每12h照胚一次，弃去24h内死亡的鸡胚。培养72h后收取鸡胚的尿囊液，并用血凝试验测定HA效价，收取有HA效价的澄清尿囊液。

将收获的尿囊液提取RNA进行反转录并PCR，测序鉴定各序列是否正确。将血凝阳性且鉴定正确的病毒尿囊液用四抗PBS稀释10000倍，用10日龄SPF鸡胚传至第5代，测定各代次尿囊液的血凝效价，检测重组转染病毒是否能在鸡胚中稳定传代。将第5代病毒尿囊液提取RNA并反转录进行序列测定，鉴定是否发生突变，序列完全正确后进行后续试验。

5.候选株病毒血清交叉反应性

5.1病毒灭活及血清制备

取重组病毒及母本病毒SN株尿囊液，以8000r/min离心10min后取上清测定病毒灭活前HA效价，病毒尿囊液与稀释好的1:50甲醛溶液以43:7的比例混合均匀至4℃摇床放置，震摇灭活24h。取出灭活的病毒尿囊液，测定灭活后血凝效价(血凝效价>4log₂时满足要求)。

在灭活好的病毒尿囊液中以24:1比例加入吐温80，混匀后，以3:1比例将白油加入灭活病毒后乳化制备疫苗。用制成的疫苗颈部皮下注射3周龄SPF鸡，0.2mL/只，每组注射5只SPF鸡。免疫后，测定血清HI效价≥7log₂时可采集鸡血，若未达到则在一免后21d加强免疫一次，二免后测定血清HI效价≥7log₂时采集鸡血，分离血清，冻存于-70℃冰箱中备用。

5.2血清交叉血凝抑制试验

测定各病毒尿囊液HA效价，将病毒HA价调至2log₂(4单位病毒)，在96孔血凝板中加入25μL PBS，每行第1孔加入各个重组病毒的抗血清，并将各血清倍比稀释后，再加入配好的4单位病毒，37℃条件下作用15min，作用后加入1％鸡红细胞，并转移到37℃条件下作用10min后观察结果。

选取不同亚系不同年份的H9N2禽流感病毒分离株进行交叉血凝抑制试验。其中W2-17、QD5、WJ100、TX和28-1株属于Y280-Like，WXQ株为G1-Like，YZ4株为F98-Like。结果显示，疫苗候选株rHANA3免疫血清对各病毒的血凝抑制价均高于rHANA1和rHANA2(rSN)组血清(见表3)。

表3不同H9N2病毒与候选株抗血清间的交叉血凝抑制性

5.3血清中和试验

选取SN及YZ4毒株，测定EID₅₀。进行中和试验时，将病毒稀释成200个EID₅₀，使其与稀释好的血清等量混合后，每个接种剂量中含有100个EID₅₀。选取重组病毒及野生型SN抗血清，先将血清灭活处理(56℃处理30min)，随后将血清用四抗PBS从1:10开始进行2倍连续稀释。将定量好的两种病毒分别与等体积稀释好的各组血清混合均匀，并在37℃作用1h，作用后迅速将混合物接种10日龄SPF鸡胚，每个混合物接种4个鸡胚。同时，将稀释为100个EID₅₀的病毒接种SPF鸡胚，作为阳性对照。接种后每日观察，4天后检测鸡胚感染情况，根据Reed-Muench法计算血清中和效价。

中和试验结果显示，候选株rHANA3组血清对Y280-Like病毒SN的中和效价高于rHANA1、rHANA2(rSN)、rHANAPR8及野生型病毒SN组抗血清；对F98-Like病毒YZ4的中和效价高于rHANA1、rHANA2(rSN)及野生型病毒SN组抗血清(见表4)。

表4候选株血清中和效价

Claims (1)

1.H9N2亚型禽流感病毒疫苗候选株rHANA3的构建方法，其特征在于，所述构建方法如下：

(1)解凝试验筛选不同解凝速度的H9N2亚型毒株

分离鉴定保存H9N2 AIV：W2-17、SN、QD5、FY2014040、WJ100和YZ4作为候选株，将候选H9N2亚型禽流感病毒经2倍梯度稀释后，再加等量的1%鸡红细胞，4℃作用30min后转移至37℃中，每隔一小时记录每个病毒株的HA效价，绘制解凝曲线，分析病毒解凝速度，筛选毒株；

(2)血凝试验筛选HA片段

对候选毒株进行血凝试验，测定各候选H9N2亚型AIV的HA效价，选取其中血凝效价最高的病毒，构建其HA基因表达质粒；

(3)HA及NA片段表达质粒的构建方法如下：

(3-1)引物设计

参照Hoffmann对流感病毒的8个片段设计的通用引物，设计HA及NA片段全长扩增引物；

(3-2)病毒RNA的提取及cDNA反转录

根据Trizol Reagent试剂说明提取病毒RNA；将病毒尿囊液8000 rpm 离心10 min取250 µL加入RNase-free的离心管中；加入500 µL Trizol Reagent，充分混匀后，放置5min；加入200 µL三氯甲烷，剧烈混匀后，13000 rpm离心10 min；将上步中离心上清液450 µL加入新的离心管中，再加入900 µL异丙醇，混匀后放入-20℃作用5 min后13000 rpm离心10 min；弃上清，加入1 mL 75% DEPC水处理的乙醇，轻轻混匀，放入-20℃作用5 min后13000 rpm离心10 min，弃上清；根据HiScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒说明书进行病毒cDNA的反转录；反转录好的cDNA，于-20℃保存备用；

(3-3)目的片段的扩增及纯化

(3-3-1)使用Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase，以病毒cDNA 为模板，扩增HA及NA基因片段，25µL PCR体系如下：10×PCR buffer/12.5 μL、dNTP(10 Mm)/0.5 μL、上游引物(25 µmol/µL)/0.5 μL、下游引物(25 µmol/µL)/0.5 μL、高保真酶/0.5 μL、DNA模板/2 μL、ddH2O/8.5 μL；

(3-3-2)反应程序：预变性温度为95℃3min；然后以95℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸1.5 min，进行35个循环，最后72℃延伸10min；

(3-3-3)将PCR产物通过1%琼脂糖凝胶水平电泳进行鉴定，以核酸MarkerGeneRuler 1kb DNA Ladder为标准参照，染色后观察结果，成功扩增出了SN株HA基因片段，命名为SN-HA，以及三株病毒的NA基因片段，分别命名为NA1、NA2和NA3；

(3-3-4)将PCR产物条带切下后，按照使用用凝胶纯化回收试剂盒说明进行目的片段的纯化，测定纯化产物的浓度和纯度；

(3-4)目的片段与T载体的连接

参照pEASY-Blunt3 Cloning Kit和Trans1-T1感受态细胞使用说明，将其克隆至T载体，连接产物转化Trans1-T1感受态细胞，挑斑小提质粒，经EcoR I酶切鉴定阳性的质粒送金斯瑞生物工程有限公司测序验证，测序正确的质粒-20℃保存备用；

(3-5)HA、NA片段及真核表达载体的酶切与连接

将鉴定为阳性克隆的HA及NA质粒测定浓度后，分别用BsmBⅠ、Bsa I限制性内切酶进行酶切，将pHW2000载体用BsmBⅠ 酶切，酶切后产物进行琼脂糖凝胶电泳，把相应大小条带的胶块切下并胶回收，用T4连接酶将酶切后的pHW2000载体和目的产物连接，连接产物转化感受态细胞Trans1-T，于37℃培养箱培养12-14 h，挑取单个菌落于15 mL氨苄LB液体培养基中培养过夜，菌落PCR鉴定，将大小正确的菌液进行测序，测序结果正确后，用QIAGEN试剂盒提取质粒，测定其浓度和纯度，选取浓度在300 ng/μL以上，OD260/OD280在1.8-2.0之间的质粒保存备用；

(4)病毒拯救

(4-1)将构建好的HA片段表达质粒pHW-SN-HA分别与构建好的不同解凝速度病毒的NA片段表达质粒pHW-NA1、pHW-NA2以及pHW-NA3组合，以PR8其余6个片段为骨架进行转染，同时转染pHW-SN-HA与PR8其他7个片段组合的重组病毒作为对照；

(4-2)用含10%胎牛血清的DMEM细胞培养基提前复苏并扩大培养293T细胞和MDCK细胞，在转染前一天，将293T细胞及MDCK细胞以3:1的比例混匀铺于35 mm的细胞培养皿，培养至细胞汇合度70%-80%时，可以进行转染，转染之前1 h将细胞培养液换成1 mL的无抗无血DMEM培养基；转染用每片段质粒量应为300 ng，转染质粒总用量为2.4 μg；取4只无菌1.5mL指形管，分别加入50 μL无抗无血DMEM，再将质粒按照重组方案分别加入4个离心管中，用微量移液器轻轻吹匀；另取4只无菌指形管，分别加入50 μL无抗无血DMEM和3 μL PolyJet^TM转染试剂，轻轻混匀；混匀后立即分别加入上述质粒溶液中，轻轻吹吸混匀，室温孵育10-15min以形成PolyJet^TM–DNA 复合物，孵育结束后将混合液逐滴加入培养皿中，边加边轻微晃动以混匀；然后移入CO2细胞培养箱中静置培养；转染8-12 h后，加入终浓度为2 μg/mL的TPCK胰酶；转染后72 h将培养皿置于-70℃反复冻融三次，收取细胞上清，接种10日龄的SPF鸡胚，0.2 mL/胚，检测重组病毒拯救是否成功；每12 h照胚一次，弃去24 h内死亡的鸡胚；培养72 h后收取鸡胚的尿囊液，并用血凝试验测定HA效价，收取有HA效价的澄清尿囊液；

(4-3)将收获的尿囊液提取RNA进行反转录并PCR，测序鉴定各序列是否正确；将血凝阳性且鉴定正确的病毒尿囊液用四抗PBS稀释10000倍，用10日龄SPF鸡胚传至第5代，测定各代次尿囊液的血凝效价，检测重组转染病毒是否能在鸡胚中稳定传代；将第5代病毒尿囊液提取RNA并反转录进行序列测定，鉴定是否发生突变，序列完全正确后进行后续试验；

(5)候选株病毒血清交叉反应性

(5-1)病毒灭活及血清制备

(5-1-1)取重组病毒及母本病毒SN株尿囊液，以8000 r/min离心10 min后取上清测定病毒灭活前HA效价，病毒尿囊液与稀释好的1:50甲醛溶液以43:7的比例混合均匀至4℃摇床放置，震摇灭活24 h；取出灭活的病毒尿囊液，测定灭活后血凝效价，血凝效价>4 log₂时满足要求；

(5-1-2)在灭活好的病毒尿囊液中以24:1比例加入吐温80，混匀后，以3:1比例将白油加入灭活病毒后乳化制备疫苗；用制成的疫苗颈部皮下注射3周龄SPF鸡，0.2 mL/只，每组注射5只SPF鸡；免疫后，测定血清HI效价≥7 log₂时可采集鸡血，若未达到则在一免后21d加强免疫一次，二免后测定血清HI效价≥ 7 log₂时采集鸡血，分离血清，冻存于-70℃冰箱中备用；

(5-2)血清交叉血凝抑制试验

(5-2-1)测定各病毒尿囊液HA效价，将病毒HA价调至2 log₂，在96孔血凝板中加入25 μLPBS，每行第1孔加入各个重组病毒的抗血清，并将各血清倍比稀释后，再加入配好的4单位病毒，37℃条件下作用15 min，作用后加入1%鸡红细胞，并转移到37℃条件下作用10 min后观察结果；

(5-2-2)选取不同亚系不同年份的H9N2禽流感病毒分离株进行交叉血凝抑制试验；其中W2-17、QD5、WJ100、TX和28-1株属于Y280-Like，WXQ 株为G1-Like，YZ4 株为F98-Like；

(5-3)血清中和试验

(5-3-1)选取SN及YZ4毒株，测定EID₅₀；进行中和试验时，将病毒稀释成200个EID₅₀，使其与稀释好的血清等量混合后，每个接种剂量中含有100个EID₅₀；选取重组病毒及野生型SN抗血清，先将血清灭活处理（56℃处理30 min），随后将血清用四抗PBS从1:10开始进行2倍连续稀释；将定量好的两种病毒分别与等体积稀释好的各组血清混合均匀，并在37℃ 作用1h，作用后迅速将混合物接种10日龄SPF鸡胚，每个混合物接种4个鸡胚；同时，将稀释为100个EID₅₀的病毒接种SPF鸡胚，作为阳性对照；接种后每日观察，4天后检测鸡胚感染情况，根据Reed-Muench法计算血清中和效价；

(5-3-2)中和试验结果显示，候选株rHANA3组血清对Y280-Like病毒SN的中和效价高于rHANA1、rHANA2、rHANAPR8及野生型病毒SN组抗血清；对F98-Like病毒YZ4的中和效价高于rHANA1、rHANA2及野生型病毒SN组抗血清。