CN103525776A - 一种重组狂犬病病毒口服疫苗株及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种重组狂犬病病毒口服疫苗株，它是以SAD-B19为母本毒株，所述母本毒株G蛋白上194位的天冬氨酸突变为丝氨酸、333位的精氨酸突变为谷氨酸，并且所述母本毒株的基因组G基因和L基因之间被插入犬GM-CSF基因。本发明还公开了该重组狂犬病病毒口服疫苗株的制备方法。本发明的重组狂犬病病毒口服疫苗株具有良好的复制性，安全性，并且通过犬GM-CSF基因的插入增强了免疫原性，口服免疫后可以诱导高水平的中和抗体，显著优于LBNSE病毒（欧洲用于野生动物免疫的疫苗株），可以作为狂犬病口服疫苗的候选株。

Description

一种重组狂犬病病毒口服疫苗株及其制备方法

技术领域

本发明属于动物疫苗技术领域，具体涉及一种重组狂犬病病毒口服疫苗株及其制备方法。

背景技术

狂犬病是最古老的传染病之一，是由狂犬病毒（Rabies virus，RV）引起的一种人畜共患传染病。狂犬病是迄今为止人类病死率最高的急性传染病，一旦发病，病死率几乎达100%。据世界卫生组织(WHO)报告，全世界每年有约55000人死于狂犬病，其中绝大多数分布在非洲和亚洲。近些年，我国平均每年死于约有3000人左右死于狂犬病，多数是由于被动物咬伤或者咬伤而被感染。疫苗免疫是预防和控制狂犬病的最有效途径，当前广泛应用的狂犬病疫苗主要是原代细胞培养疫苗和传代细胞纯化疫苗等灭活疫苗，这些疫苗虽然免疫效果较好，但价格昂贵，而且主要采用的免疫方式为肌注免疫，这样对于一些流浪动物及野生动物的免疫接种则很难实现。在我国，街头的流浪狗、猫等动物为当前主要的传染源，因此，将流浪的动物进行有效的免疫是狂犬病防控的关键。

口服免疫是一种公认的易于实施的免疫方式，欧美许多国家已经将口服疫苗应用于野生动物的狂犬病防控。目前应用的口服疫苗主要有SAD-B19（Schneider LG,Cox JH,Muller WW,Hohnsbeen KP.Current oral rabiesvaccination in Europe:an interim balance.Rev Infect Dis1988,10Suppl4:S654-659.Wandeler AI,Capt S,Kappeler A,Hauser R.Oral immunization ofwildlife against rabies:concept and first field experiments.Rev Infect Dis.1988,10Suppl4:S649-653.）、VR-G（Kieny MP,Lathe R,Drillien R,Spehner D,Skory S,etal.Expression of rabies virus glycoprotein from a recombinant vaccinia virus.Nature.1984,312:163-166.Brochier B,Kieny MP,Costy F,Coppens P,Bauduin B,et al.Large-scale eradication of rabies using recombinant vaccinia-rabies vaccine.Nature.1991,354:520-522.Fearneyhough MG,Wilson PJ,Clark KA,Smith DR,Johnston DH,et al.Results of an oral rabies vaccination program for coyotes.J AmVet Med Assoc.1998,212:498-502.Hanlon CA,Niezgoda M,Hamir AN,Schumacher C,Koprowski H,et al.First North American field release of avaccinia-rabies glycoprotein recombinant virus.J Wildl Dis.1998,34:228-239），和SAG-2（Flamand A,Coulon P,Lafay F,Tuffereau C.Avirulent mutants of rabiesvirus and their use as live vaccine.Trends Microbiol.1993,1:317-320.Cliquet F,Robardet E,Must K,Laine M,Peik K,et al.Eliminating rabies in Estonia.PLoSNegl Trop Dis.2012,6:e1535.Cliquet F,Aubert M.Elimination of terrestrialrabies in Western European countries.Dev Biol(Basel).2004,119:185-204.NiinE,Barrat J,Kristian M,Demerson JM,Cliquet F.First oral vaccination of wildlifeagainst rabies in Estonia.Dev Biol(Basel).2006,125:145-147.）等。但这些口服疫苗均存在许多不足，例如，SAD虽然在欧美一些国家消灭了狂犬病在狐狸中的传播，但有研究表明SAD对小鼠及本土动物具有致病性（Winkler WG,ShaddockJH,Williams LW.Oral rabies vaccine:evaluation of its infectivity in three species ofrodents.Am J Epidemiol.1976,104:294-298.）。SAG-2为从SAD株发展而来，是在SAD株中突变2个氨基酸位点而使其致病性大大降低，但SAG-2所产生的中和抗体水平较低（Hanlon CA,Niezgoda M,Morrill P,Rupprecht CE.Oralefficacy of an attenuated rabies virus vaccine in skunks and raccoons.J Wildl Dis.2002,38:420-427.）。VR-G为痘病毒表达狂犬病G蛋白的重组毒株，虽然VR-G帮助欧美许多国家阻止了狂犬病在浣熊和狐狸等野生动物中的传播，但有研究表明，VR-G暴露给人可导致严重的皮肤炎症发应和全身的痘病毒感染（MempelM,Isa G,Klugbauer N,Meyer H,Wildi G,et al.Laboratory acquired infection withrecombinant vaccinia virus containing an immunomodulating construct.J InvestDermatol.2003,120:356-358.Rupprecht CE,Blass L,Smith K,Orciari LA,Niezgoda M,et al.Human infection due to recombinant vaccinia-rabies glycoproteinvirus.N Engl J Med.2001,345:582-586.Centers for Disease C,Prevention.Human vaccinia infection after contact with a raccoon rabies vaccine bait-Pennsylvania,2009.MMWR Morb Mortal Wkly Rep.2009,58:1204-1207.）。因此，一种安全有效价格便宜的狂犬病口服疫苗将对狂犬病的防控起到重要作用。

发明内容

本发明的目的是提供一株重组狂犬病病毒可以用于狂犬病口服免疫，它以SAD-B19为母本毒株，突变其2个氨基酸位点，得到LBNSE毒株，并将犬GM-CSF基因插入到LBNSE毒株基因组中，通过反向遗传操作系统拯救出可以表达犬GM-CSF基因的重组狂犬病毒LBNSE-dog GM-CSF，该病毒株具有较高的复制滴度，致病性低，有较好的免疫原性，可以诱导产生高水平的中和抗体。

本发明的上述目的通过以下技术方案来实现：

所用的LBNSE毒株来源于用于欧洲野生动物口服免疫用的疫苗株SAD-B19，但在SAD-B19病毒G蛋白上将194位的天冬氨酸（AAT）突变为丝氨酸（TCC），将333位的精氨酸（AGA）突变为谷氨酸（GAA），相当于另一株疫苗株SAG2（在欧洲用于免疫野生动物的疫苗株），大大减弱了病毒的致病性（Wen Y,Wang H,Wu H,Yang F,Tripp RA,et al.(2011)Rabies virus expressingdendritic cell-activating molecules enhances the innate and adaptive immuneresponse to vaccination.J Virol85:1634-1.Rasalingam P,Rossiter JP,Mebatsion T,Jackson AC.Comparative pathogenesis of the SAD-L16strain of rabies virus and amutant modifying the dynein light chain binding site of the rabies virusphosphoprotein in young mice.Virus Res.2005,111:55-60.Conzelmann KK,CoxJH,Schneider LG,Thiel HJ.Molecular cloning and complete nucleotide sequence ofthe attenuated rabies virus SAD B19.Virology.1990,175:485-499.）。另外，还将SAD-B19毒株基因组中G基因和L基因之间的假基因敲出，在G基因和L基因之间加入两个酶切位点BsiWI和NheI作为插入外源基因的位点。

狂犬病病毒疫苗株SAD-B19的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明中的犬GM-CSF基因的克隆是通过对犬的新鲜血液中PBMCs的分离，经过LPS的刺激后，然后用反转录PCR扩增得到。将扩增的犬GM-CSF基因经测序验证正确后插入到LBNSE毒株基因组的G基因和L基因之间，构建出表达犬GM-CSF基因的感染性克隆LBNSE-dog GMCSF。

犬GM-CSF基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，重组狂犬病毒LBNSE-dog GM-CSF的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

感染性克隆LBNSE-dog GMCSF与分别表达狂犬病毒N、P、G和L四个蛋白的辅助质粒共同转染BSR细胞后，经免疫荧光证明拯救了可以表达犬GM-CSF基因的重组狂犬病病毒。为了验证是否犬GM-CSF基因已经插入到狂犬病毒基因组中，将拯救的病毒LBNSE-dog GM-CSF感染BSR细胞，然后提取病毒RNA，用反转录PCR进行验证，证明了犬GM-CSF基因已插入到狂犬病毒基因组中。

本发明中的重组病毒LBNSE-dog GM-CSF在BSR细胞及NA细胞上的生长曲线与LBNSE病毒相似，表明外源基因犬GM-CSF的插入并没有影响到病毒的生长和增殖。另外，重组病毒LBNSE-dog GM-CSF在NA和BSR细胞上的滴度分别可以达到10^8.25FFU/ml和10^8.5FFU/ml，达到了口服免疫滴度的要求。

将重组病毒LBNSE-dog GM-CSF脑内接种小鼠，小鼠未出现任何发病症状，表明该重组病毒无致病性。另外，在口服免疫犬后，用棉拭子采集不同时间点的唾液样本，用RT-PCR均未检测到狂犬病毒，表明该病毒口服免疫后不会导致病毒向外传播的隐患，安全性高。

将表达犬GM-CSF基因的重组狂犬病毒LBNSE-dog GM-CSF口服免疫一次便可以诱导较高水平的中和抗体，显著高于母本毒株LBNSE，并且在口服免疫后第5周仍然具有较高水平抗体。

总之，本发明中重组病毒LBNSE-dog GM-CSF具有良好的复制性，安全性，并且通过犬GM-CSF基因的插入增强了免疫原性，口服免疫后可以诱导高水平的中和抗体，显著优于LBNSE病毒（欧洲用于野生动物免疫的疫苗株），因此，重组病毒LBNSE-dog GM-CSF可以作为狂犬病口服疫苗的候选株。

附图说明

图1是LBNSE毒株与SAD-B19的碱基序列及氨基酸序列突变位点示意图。

图2是向LBNSE毒株基因中插入犬GM-CSF基因的示意图。

图3是拯救出的重组狂犬病病毒LBNSE-dog GMCSF的免疫荧光实验检测结果。

图4是细胞对照的免疫荧光实验检测结果。

图5重组病毒LBNSE-dog GM-CSF的反转录PCR检测结果（M为DL2000marker，1为LBNSE毒株，2为LBNSE-dog GM-CSF毒株，3为阴性对照）。

图6重组病毒LBNSE-dog GM-CSF在不同细胞系上的生长曲线。

图7重组病毒口服免疫犬后的中和抗体水平。

图8口服免疫后1小时病毒残留及排毒情况反转录PCR检测结果（1-6为LBNSE组，7-12为LBNSE-GMCSF）。

图9口服免疫后1小时病毒残留及排毒情况反转录PCR检测结果（1-6为LBNSE组，7-12为LBNSE-GMCSF）。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细说明。

实施例1重组病毒LBNSE-dog GM-CSF的设计、拯救、鉴定及免疫效力初步评价

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病毒

LBNSE毒株由华中农业大学农业微生物国家重点实验室提供，该病毒的具体信息和构建方法可参考有关文献（Wen Y,Wang H,Wu H,Yang F,Tripp RA,et al.(2011)Rabies virus expressing dendritic cell-activating molecules enhances theinnate and adaptive immune response to vaccination.J Virol85:1634-1.）。

1.1.2 质粒

用于拯救LBNSE毒株的感染性克隆pLBNSE的构建策略及具体方法可参考有关文献（Wen Y,Wang H,Wu H,Yang F,Tripp RA,et al.(2011)Rabies virusexpressing dendritic cell-activating molecules enhances the innate and adaptiveimmune response to vaccination.J Virol85:1634-1.）。

1.1.3 细胞和单克隆抗体

BSR细胞（BHK-21细胞的一个克隆细胞系），生长于含10%胎牛血清（Fetal bovine serum,FBS）（Gibco,Grand Island,NY）的DMEM（Dulbecco’smodified Eagle’s medium,DMEM）（Mediatech,Herndon,VA）培养液。鼠神经瘤细胞（Mouse neuroblastoma cells,NA），生长于含10%FBS的RMPI1640培养液（Mediatech）。异硫氰酸荧光素（Fluorescein isothiocyanate,FITC）标记的狂犬病毒核蛋白单克隆抗体购自Fujirebio（Melvin,PA）公司。

1.1.4 实验动物

6-8周龄的ICR小鼠，购于公司；6-7月龄的雌性比格犬购于安陆瑞科森实验动物有限公司。

1.1.5 主要试剂

胶回收试剂盒、质粒小提和大提试剂盒、RNeasy mini-kit RNA提取试剂盒及Superfect转染试剂盒均购于QIAGEN公司，各种限制性内切酶购于NewEngland Biolabs,Beverly,MA公司。Superscript^TM RT-PCR试剂盒购于Invitrogen公司。Ficoll-1077购于sigma-aldrich公司。

1.2 引物的设计与合成

用于扩增犬GM-CSF基因及RT-PCR检测犬GM-CSF基因的引物见表1，由上海金斯瑞公司合成。

表1

注：下划线部分为限制性内切酶位点序列：犬GM-CSF基因扩增上游引物中下划线序列为BsiWI，下游引物中下划线序列为NheI。

1.3 犬血液中PMBCs的分离及犬GM-CSF基因的扩增

①将5ml新鲜的犬血液加入到预先装有5ml PBS的15ml离心管中，轻轻混匀；

②将步骤1中的混合物沿着管壁缓慢加入到预先装有3ml Ficoll-1077的离心管中，使其覆盖在Ficoll上层；

③将步骤2中的混合物在20-25℃以400G离心30分钟。

④用1000ul移液器将PBMC层吸出，尽量避免吸取血浆和Ficoll。

⑤将步骤4中吸出的PBMC置于新的离心管中，然后加入10ml PBS，轻轻混匀。

⑥将步骤5中的混合物以200G离心10分钟，弃掉上清液，轻轻弹离心管底部，使沉淀即PBMC充分重悬于剩余的PBS。

⑦重复步骤5和步骤6，即再次用PBS洗一次。

⑧用1ml含10%FBS的RPMI1640细胞培养液重悬PBMC。

⑨用台盼蓝染色进行细胞计数，将细胞浓度调整到1×10⁶个/ml，加入5ug/ml的LPS，轻轻混匀后放入37℃细胞培养箱，CO₂浓度为5%，孵育8小时。

⑩将孵育后的细胞离心后用RNeasy mini-kit RNA提取试剂盒提取RNA，再用Superscript^TM RT-PCR试剂盒进行反转录PCR扩增犬源GM-CSF。

1.4 重组病毒LBNSE-dog GM-CSF的拯救

参见文献（Wen Y,Wang H,Wu H,Yang F,Tripp RA,et al.(2011)Rabies virusexpressing dendritic cell-activating molecules enhances the innate and adaptiveimmune response to vaccination.J Virol85:1634-1.）。具体如下：转染前一天将BSR细胞接种于六孔板，使细胞于第二天使用时达到80%的覆盖度，按照转染试剂Superfect（QIAGEN公司）的产品说明说进行操作，将2ug的全长感染性克隆，0.5ug N辅助质粒，0.25ug P辅助质粒，0.15ug G辅助质粒以及0.1ug L辅助质粒共同转染BSR细胞，转染后的细胞放入37℃培养箱，CO₂浓度为5%，孵育4小时，然后将上清倒掉，用含10%FBS的DMEM培养基洗一次，再加入新鲜培养基培养4天，把上清液转移到BSR单层细胞上，在34℃含5%CO₂的培养箱培养3天，收集上清，-80℃分装保存。

1.5 拯救病毒的鉴定

1.5.1 免疫荧光检测

将拯救的病毒与BSR细胞于96孔细胞板共培养48小时后，将上清弃掉，用预冷的80%丙酮于4℃固定30分钟，然后用PBS洗2遍，将异硫氰酸荧光素（Fluorescein isothiocyanate,FITC）标记的狂犬病毒核蛋白单克隆抗体（购于Fujirebio公司）进行1:70稀释，每孔加入50ul，放入37℃孵育1小时后用PBS洗三遍，在荧光显微镜（Leica DMIRES）进行观察。

1.5.2 反转录（RT）PCR检测犬GM-CSF

将拯救的病毒与BSR细胞共培养48小时后，将细胞刮下提取总RNA，按照Superscript^TM RT-PCR试剂盒说明（购于Invitrogen公司）进行操作，

1.6 病毒滴定

取96孔细胞培养板，以4行×9列为一个样品区，每板两个分区，将每个孔内加入90μl的含10%FBS的RPMI1640细胞培养液，每个样品设4个重复，将10μl的病毒原液加入到96孔细胞板的第一列，充分混合后吸取10μl混合液到第二列，充分混匀，再吸出10ul混合液到下一列，依次连续进行10倍的倍比稀释，至第9列孔后弃掉10μl的混合液。每孔加入5×10⁴的NA细胞后于37℃，5%CO₂感作48h，然后弃细胞上清液，用80%冷丙酮（80%Ice-cold acetone）固定感染细胞。以抗狂犬病毒N蛋白荧光抗体（FITC-conjugated anti-RV N antibodies）染色后，通过荧光显微镜观察并记录抗原阳性区域（Antigen-positive foci）。根据Reed-muench法进行病毒毒力的计算并记录为FFU/ml（Fluorescent focus units permilliliter）。

1.7 重组病毒LBNSE-dog GM-CSF在BSR和NA细胞上的生长特性

将病毒以感染复数为0.01（MOI=0.01）分别感染BSR与NA细胞，分别在感染后第1天，第2天，第3天，第4天及第5天取50μl的上清液，进行病毒滴定，记录病毒在不同时间点的滴度，并绘制出生长曲线

1.8 动物实验

1.8.1 重组病毒LBNSE-dog GM-CSF致病性实验

将6-8周龄的ICR小鼠，每组10只，分别用40μl的DMEM或者1×10⁷FFU的重组病毒LBNSE，以脑内注射（i.c.）的方式进行感染，观察每天观察两次，记录小鼠的临床发病及死亡情况。

1.8.2 犬口服免疫试验

将6-7月龄的比格犬，每组6只，分别用无菌注射器（去除针头）将1ml含有1×10⁸FFU的LBNSE毒株和1×10⁸FFU的重组病毒株LBNSE-dog GM-CSF进行口服免疫，并分别于口服免疫后1小时和3小时采取棉拭子，用于病毒的残留及排毒检测。分别于口服免疫后第2周、第3周、第4周、第5周进行采血测定中和抗体水平。

2.实验结果

2.1 感染性克隆LBNSE-dog GMCSF的构建及拯救病毒检测

LBNSE毒株是在SAD-B19的基础上在G基因194位和333位进行突变（如图1所示），并且将G和L基因之间的假基因敲除，加入两个酶切位点BsiWI和NheI。重组病毒LBNSE-dog GMCSF是在LBNSE病毒的基础上，将犬GM-CSF基因扩增并测序正确后插入到G基因和L基因之间（如图2所示），利用反向遗传技术拯救病毒，拯救的病毒用免疫荧光实验进行检测，如图3所示，可以看到绿色的荧光灶，即为拯救出的重组狂犬病病毒LBNSE-dog GMCSF，而细胞对照（图4）则观察不到荧光灶。另外，为了检测犬GM-CSF基因是否已插入到拯救的病毒中，将拯救的病毒感染BSR细胞后，提前RNA进行反转录PCR检测，上游引物设计在犬GM-CSF基因插入的位点BsiWI上游，下游引物设计在另一插入位点NheI的下游，具体引物序列见表1。检测结果如图5所示，第1泳道为LBNSE毒株可以扩增到325bp的目的条带，而LBNSE-dog GM-CSF可以看到760bp的目的条带，两者之间所差的435bp即为插入的犬GM-CSF基因序列，经测序鉴定表明犬GM-CSF基因已经插入到狂犬病病毒的基因组。

2.2 病毒的体外生长特性

为了研究犬GM-CSF基因的插入是否影响狂犬病毒自身的复制及增殖，将LBNSE毒株和LBNSE-dogGM-CSF毒株同时感染BSR和NA细胞，并且于不同时间点测定其病毒的滴度，绘制出病毒的生长曲线。如图6，可以观察到重组病毒LBNSE-dog GM-CSF和病毒LBNSE具有相似的生长曲线，这表明外源基因犬GM-CSF基因的插入并未影响病毒的复制和增殖，并且最高滴度与母本病毒也相差不大。重组病毒LBNSE-dog GM-CSF在BSR细胞和NA细胞上达到的最高滴度分别为1×10^8.25FFU/ml和1×10^8.5FFU/ml，分别在感染后第3天和第4天达到滴度最高值。

2.3重组病毒致病性及口服免疫后病毒残留及排毒情况检测

重组病毒LBNSE-dog GM-CSF脑内注射6-8周龄的ICR小鼠中，观察3周，期间并未出现任何发病症状，说明重组病毒对小鼠无致病性。另外，在口服免疫犬后，在不同时间点（1小时和3小时）采集口腔棉拭子，用RT-PCR检测是否有病毒存在，如图8（1小时）和图9（3小时）实验结果表明病毒在口服免疫后并不具有病毒残留和排毒的隐患，安全性高。

2.4重组病毒口服免疫效果评价

将重组病毒LBNSE-dog GM-CSF和LBNSE毒株（欧洲用于野生动物免疫疫苗株）口服免疫比格犬，分别于免疫后2周，3周，4周，5周进行采血测定中和抗体滴度。诱导高的中和抗体水平是预防狂犬病的有效手段，因此，的中和抗体的测定作为狂犬病疫苗效果评价的方法。如图7所示，重组病毒LBNSE-dog GM-CSF诱导的中和抗体水平要显著高于LBNSE毒株，在免疫后第4周中和抗体水平最高，可以达到4.05IU/ml，而LBNSE毒株的中和抗体水平在第2周最高，也只有1.0IU/ml。值得一提的是，在免疫后第2周时，LBNSE诱导的中和抗体水平平均只有0.3IU/ml，低于狂犬病免疫保护最低要求滴度0.5IU/ml，而LBNSE-dog GM-CSF则可以诱导平均1.0IU/ml中和抗体（与LBNSE所能诱导的最高中和抗体水平相当）。

总之，本发明中的重组狂犬病病毒LBNSE-dog GM-CSF对小鼠无致病性且在口服免疫后没有排毒现象，安全性高，在免疫效果上，与欧洲用于野生动物免疫的疫苗株即实验中的母本株LBNSE相比，LBNSE-dog GM-CSF可以诱导产生显著高的中和抗体水平，最高可以达到4IU/ml。因此，本发明重组病毒LBNSE-dog GM-CSF具备了作为疫苗株的高效、低毒的特点，可以作为狂犬病口服疫苗的候选株。

Claims (2)

1.一种重组狂犬病病毒口服疫苗株，其特征在于：它是以SAD-B19为母本毒株，所述母本毒株G蛋白上194位的天冬氨酸突变为丝氨酸、333位的精氨酸突变为谷氨酸，并且所述母本毒株的基因组G基因和L基因之间被插入犬GM-CSF基因。

2.一种重组狂犬病病毒口服疫苗株的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1）以SAD-B19为母本毒株，将所述母本毒株G蛋白上194位的天冬氨酸突变为丝氨酸、333位的精氨酸突变为谷氨酸；

2）将母本毒株基因组中G基因和L基因之间的假基因敲出，在G基因和L基因之间加入两个酶切位点BsiWI和NheI，将犬GM-CSF基因插入到G基因和L基因之间，并通过反向遗传操作系统拯救出表达犬GM-CSF基因的重组狂犬病病毒。

Images