CN102533675A - 表达尼帕脑炎病毒F蛋白的重组新城疫病毒LaSota疫苗株 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种表达尼帕脑炎病毒F蛋白的重组新城疫病毒LaSota疫苗株及其制备方法和应用。具体而言，本发明提供表达尼帕脑炎病毒F蛋白的重组新城疫病毒LaSota疫苗株rLa-NiVF(其保藏号为CGMCC No.5401)及其在制备用于预防尼帕病脑炎的疫苗中的应用。

Description

表达尼帕脑炎病毒F蛋白的重组新城疫病毒LaSota疫苗株

技术领域

本发明提供一种表达尼帕脑炎病毒F蛋白的重组新城疫病毒LaSota疫苗株及其制备方法和应用。具体而言，本发明提供表达尼帕脑炎病毒F蛋白的重组新城疫病毒LaSota疫苗株rLa-NiVF(其保藏号为CGMCC No.5401)及其在制备用于预防尼帕病脑炎的疫苗中的应用。

背景技术

尼帕病脑炎是一种高度烈性人畜共患传染病，其病原尼帕病毒属于副粘病毒科，亨尼帕病毒属，同属的只有亨德拉病毒[1]。尼帕病毒宿主范围非常广泛，其中猪是重要的易感动物。尼帕病毒的自然宿主为果蝠[2]。该病于1998年9月下旬至1999年6月中旬于马来西亚首次爆发，发病例数高达265例，死亡105例，死亡率为38.5％。为了控制疾病的蔓延，马来西亚政府屠杀了一百多万头猪，占该国养猪量40％。此后，该病又在印度、孟加拉等国陆续发生，而本病的致死率也呈现上升趋势(67％-92％)[3]。尼帕病毒给这些国家的畜牧业发展和人民健康造成了严重危害。

我国目前虽然没有该病爆发，但其已经对我国构成了巨大威胁。果蝠在东南亚地区广泛分布，在我国南方地区分布较多，国内已有学者从我国南方地区的蝙蝠当中检测到了尼帕病毒抗体的存在[4]。由于我国周边多个国家爆发该病，伴随着贸易往来的不断加深该病传入我国的压力也不断增大。且我国养猪数量极大，养猪业已成为我国农业的重要支柱性产业之一，因此该病一旦爆发势必会对我国的养猪业及人民群众的正常生活和生命安全造成严重危害，防控形势不容乐观。因此，储备可以有效防控尼帕病毒的疫苗具有非常重要的战略意义。

尼帕病毒的融合蛋白(F蛋白)是位于病毒粒子表面的I型跨膜糖蛋白，其主要功能是介导病毒囊膜与宿主细胞膜的融合，从而使病毒基因组进入细胞。F蛋白是尼帕病毒的主要免疫保护性抗原，是诱导机体产生CTL(杀伤性T细胞)免疫反应的主要结构蛋白。F蛋白也能使免疫动物产生中和抗体[5，6]。本研究利用新城疫病毒LaSota疫苗株反向遗传操作系统成功构建了表达尼帕病毒F蛋白的重组新城疫病毒活载体疫苗-rLa-NiVF，并在小鼠和猪体内对rLa-NiVF的免疫效果进行了评价，证明此疫苗可以诱导机体产生良好的细胞和体液免疫反应，是防控尼帕脑炎病毒的优秀的候选疫苗，在我国应对尼帕病毒的潜在威胁中显示了良好的应用前景，因而具有重要的战略意义。

发明内容

本发明提供一种表达尼帕脑炎病毒F蛋白的重组新城疫病毒LaSota疫苗株及其制备方法和应用。具体而言，本发明提供表达尼帕脑炎病毒F蛋白的重组新城疫病毒LaSota疫苗株rLa-NiVF(其保藏号为CGMCC No.5401)及其在制备用于预防尼帕病脑炎的疫苗中的应用。

具体地，本发明成功构建了表达尼帕病毒(Nipah virus，NiV)F蛋白的重组新城疫病毒LaSota疫苗株rLa-NiVF(该疫苗株于2011年10月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，中国北京，中国科学院微生物研究所，100101)，并在小鼠和断奶仔猪上系统评价了所述重组病毒产生的体液和细胞免疫反应。

本发明采用新城疫病毒LaSota弱毒株反向遗传操作系统构建了表达尼帕病毒F蛋白的重组新城疫病毒rLa-NiVF。用间接免疫荧光和特异性细胞融合实验证实尼帕病毒F蛋白的表达；将所述重组病毒免疫小鼠，用酶联免疫吸附试验(ELISA)和水泡性口炎病毒囊膜嵌合尼帕脑炎病毒G/F蛋白伪型病毒粒子做中和试验(VNA)以检测重组病毒诱导的体液免疫水平；用流式细胞术(FACS)评价重组病毒产生的特异性细胞免疫。以rLa-NiVF免疫断奶仔猪并检测中和抗体水平。结果显示，rLa-NiVF能够正确表达尼帕病毒F蛋白。将重组病毒免疫Balb/c小鼠，ELISA表明免疫组小鼠可产生特异性IgG，病毒中和试验显示免疫小鼠可以产生针对尼帕病毒的中和抗体；流式细胞术表明免疫组小鼠能够产生高水平的F蛋白特异性CD8细胞免疫反应。猪免疫试验表明，rLa-NiVF可以诱导猪产生较高水平的中和抗体。本发明的成果目前国内外均无报道，具有很强的创新性。rLa-NiVF作为一种具有前瞻性，创新性，并且高效安全的防控尼帕病毒的候选疫苗，对我国应对尼帕病毒潜在威胁具有重要的战略意义。

本发明提供制备表达尼帕病毒F蛋白的重组新城疫病毒LaSota疫苗株的方法，所述方法包括下述步骤：

(1)构建重组转录质粒，该转录质粒包括其中插入尼帕病毒F基因的所述新城疫LaSota疫苗株的基因组cDNA序列，将所述重组转录质粒命名为pBRN-NiVF；

(2)构建转录辅助质粒系统，该辅助质粒系统包括编码所述新城疫LaSota疫苗株的核蛋白(NP)的cDNA序列的辅助质粒pBSNP、编码所述新城疫LaSota疫苗株的磷酸蛋白(P)的cDNA序列的辅助质粒pBSP、和编码所述新城疫LaSota疫苗株的大聚合酶蛋白(L)的cDNA序列的辅助质粒pBSL；

(3)将步骤(1)的所述重组转录质粒pBRN-NiVF和步骤(2)的转录辅助质粒pBSNP、pBSP、pBSL共转染所述新城疫LaSota疫苗株复制许可的宿主细胞，培养转染后的宿主细胞；和

(4)收获上清液，过滤后接种鸡胚尿囊腔拯救重组病毒株。

更具体地，制备表达尼帕病毒F蛋白的重组新城疫病毒LaSota疫苗株的方法描述如下：以人工合成的尼帕病毒F基因cDNA(SEQ ID No.1，其编码的F蛋白氨基酸序列为SEQ ID No.2)为模板，利用PCR方法分别在F基因两端插入新城疫病毒特异性基因起始和终止序列以及Pme I限制性酶切位点，测序鉴定无误，将F基因插入到LaSota全长基因组质粒(该质粒由本实验室构建，构建方法可参见已获得授权的专利：申请号：200510097997.8，发明名称为“新城疫LaSota疫苗株反向遗传操作系统及其应用”，发明人：步志高，陈化兰，申请时间：2005年9月2日)的P(磷蛋白)和M(基质蛋白)基因之间的Pme I位点，构建成全长重组质粒pBRN-NiVF，利用质粒提取试剂盒大量制备此重组质粒，同时以辅助质粒pBSNP、pBSP、pBSL(所述辅助质粒的构建参见参考文献[7])共同转染BHK-21细胞(预先感染表达T7聚合酶的重组痘病毒)，72小时后以转染的细胞上清接种10日龄SPF鸡胚尿囊腔，接种72小时后取接种鸡胚的尿囊液做血凝试验HA和新城疫血凝抑制试验HI均呈阳性，初步表明病毒拯救成功。以拯救得到的重组病毒rLa-NiVF感染BHK-21细胞，并同时转染表达尼帕病毒G蛋白的真核表达质粒PCAGG-NiVG，24小时后可以观察到尼帕病毒F和G蛋白共同表达介导的特异性细胞融合；另用鼠抗NiV F蛋白单克隆抗体作一抗用间接免疫荧光检测尼帕F蛋白在rLa-NiVF感染的BHK-21细胞中的表达，在荧光显微镜下可以观察到特异性的强烈的荧光信号。细胞融合试验与间接免疫荧光均证明重组病毒rLa-NiVF能够正确表达尼帕病毒F蛋白。

本发明所用的新城疫LaSota疫苗株为AV1615(中国兽医微生物菌种保藏管理中心，CVCC)，也由本实验室制备，制备方法参见已获得授权的专利：申请号：200510097997.8，发明名称为“新城疫LaSota疫苗株反向遗传操作系统及其应用”，发明人：步志高，陈化兰，申请时间：2005年9月2日。

本发明还提供所述表达尼帕病毒F蛋白的重组新城疫病毒LaSota疫苗株用于制备预防尼帕病脑炎的疫苗的应用，优选地，所述表达尼帕病毒F蛋白的重组新城疫病毒LaSota疫苗株为rLa-NiVF。所述应用还包括所述表达尼帕病毒F蛋白的重组新城疫病毒LaSota疫苗株与表达尼帕病毒G蛋白的重组新城疫病毒LaSota疫苗株进行联合免疫。

本发明还提供用于预防尼帕病脑炎的疫苗，所述疫苗包含有效量的本发明所述的表达尼帕脑炎病毒F蛋白的重组新城疫病毒LaSota疫苗株。优选地，所述疫苗包含有效量的重组新城疫病毒LaSota疫苗株rLa-NiVF。另外，所述疫苗还可以包含药用的佐剂或赋形剂等。

本发明的用于预防尼帕病脑炎的疫苗可以用于预防哺乳动物中的尼帕病脑炎，所述哺乳动物包括，但不限于，猪、小鼠、犬，猫及马等。本发明还提供用于预防哺乳动物中的尼帕病脑炎的方法，所述方法包括给所述哺乳动物施用有效量的包含本发明所述的表达尼帕脑炎病毒F蛋白的重组新城疫病毒LaSota疫苗株的疫苗，优选为rLa-NiVF。

附图简述

参考下述附图，进一步描述本发明，在所述附图中：

图1.rLa-NiVF的构建示意图；

图2.rLa-NiVF感染细胞的间接免疫荧光；

图3.尼帕病毒G、F蛋白共表达形成的合胞体；

图4.重组病毒的鸡胚生长曲线；

图5.最大剂量重组病毒免疫后小鼠体重变化；

图6A.rLa-NiVF免疫小鼠血清中特异性IgG水平(ng/ml)，图6B.rLa-NiVF免疫小鼠中和抗体水平，纵坐标表示血清稀释的倍数；

图7.重组病毒免疫小鼠的特异性CD8细胞免疫反应；

图8.重组病毒诱导猪产生抗尼帕病毒中和抗体。

具体实施方式

以下通过实施例来进一步阐明本发明。但是应该理解，所述实施例只是举例说明的目的，并不意欲限制本发明的范围和精神。

需要说明的是，本领域技术人员应该理解，下述实施例中所用的试剂、酶类等除特别说明外，均为可从试剂公司商购的分析纯级别的试剂或酶类。

1材料和方法

1.1：材料

1.1.1：毒株与质粒：新城疫病毒LaSota弱毒疫苗株(GenBank登录号AY845400.2，由本实验室制备，制备方法参见已获得授权的专利：申请号：200510097997.8，发明名称为“新城疫LaSota疫苗株反向遗传操作系统及其应用”，发明人：步志高，陈化兰，申请时间：2005年9月2日)，表达尼帕病毒F蛋白的重组杆状病毒rBac-NiVF[8]由本实验室保存(其详细的构建方法参见参考文献8)。表达T7聚合酶的重组痘病毒vTF7-3由美国NIH的Bernard Moss博士提供，其制备与滴定过程均按文献[9]进行，滴定后的病毒于-70℃保存备用。LaSota全长基因组转录质粒pBRN-FL以及辅助质粒pBSNP、pBSP、pBSL由本实验室制备保存[7](参考文献7详细说明了上述质粒的制备方法)。另外LaSota疫苗株的反向遗传操作系统参见已获得授权的专利：申请号：200510097997.8，发明名称为“新城疫LaSota疫苗株反向遗传操作系统及其应用”，发明人：步志高，陈化兰，申请时间：2005年9月2日。表达尼帕病毒G和F蛋白的真核表达质粒pCAGG-NiVG和pCAGG-NiVF均由本实验室保存[10](参考文献10详细说明了上述质粒的制备方法)。用于制备囊膜嵌合尼帕病毒G和F蛋白的表达绿色荧光蛋白的重组水泡性口炎假病毒粒子(VSVΔG*GFP-NiVG/F)的重组VSV基因组cDNA克隆质粒pVSVΔG*GFP及辅助表达质粒pBS-G、pBS-L、pBS-N和pBS-P由美国田纳西大学MichaelWhitt博士提供[11](参考文献11详细说明了上述质粒的制备方法)。1.1.2：细胞和血清：细胞系BHK-21，Sf9昆虫细胞(购自美国典型培养物保藏中心ATCC)并在本实验室使用和保存。BHK-21细胞生长及维持液为含5％胎牛血清(FBS)的DMEM(购自Gibco)；SF9昆虫细胞培养液为SF900II(购自Gibco)无血清培养液。

1.1.3单克隆抗体和多肽表位：尼帕病毒F蛋白特异性单克隆抗体F2G1由本实验室制备并保存，详细制备方法参见文献[12]；尼帕病毒F蛋白小鼠CD8细胞表位多肽F280(VYFPILTEI，H2K^d)(VYFPILTEI是多肽的氨基酸序列，H2K^d是指小鼠的MHC I(I型主要组织相容性复合体)单倍体基因型)，人免疫缺陷病毒Gag蛋白小鼠CD8表位多肽(AMQMLKETI，H2K^d)由北京中科亚光公司合成并由本实验室保存。

1.1.4：实验动物：6周龄雌性BALB/c小鼠购自北京维通利华实验动物公司。四周龄断奶仔猪购自哈尔滨兽医研究所实验动物基地并由哈尔滨兽医研究所实验动物基地繁殖并饲养。

1.2：表达NiV F基因的病毒基因组cDNA克隆的构建

以PCAGG-NiVF为模板，通过PCR引物(见表1)在尼帕病毒F基因(其基因序列为SEQ ID No.1，所编码的蛋白序列为SEQ ID No.2)开放阅读框5′端引入Pme I限制性酶切位点识别序列(GTTTAAAC)和NDV自身聚合酶L识别的转录终止序列GE(TTAAGAAAAAA)及转录起始序列GS(ACGGGTAGAA)，在3′端引入Pme I限制性酶切位点；PCR产物经测序验证后，末端用Pme I酶切后插入pBRN-FL-PmeI(即，经过Pme I酶切的pBRN-FL质粒)，构建成的重组全长基因组cDNA克隆命名为pBRN-FL-NiVF。

表1扩增NiV F插入LaSota全长基因组的PCR引物

注：粗体表示Pme I限制性酶切位点序列；小写字母表示新城疫病毒特异性基因起始和终止序列；斜体表示Kozak序列；下划线表示F基因特异性互补序列。

1.3：重组病毒的拯救

将BHK-21细胞接种六孔板(购自Corning)，待细胞生长达到80％汇合时，于转染前1小时感染vTF7-3(MOI＝0.01)(表达T7聚合酶的重组痘病毒vTF7-3，由美国NIH的Bernard Moss博士提供[9])，感染完毕后采用磷酸钙转染法将构建好的全长基因组质粒pBRN-FL-NIVF以及辅助质粒pBS-N、pBS-P和pBS-L分别以5μg、2.5μg、1.25μg、1.25μg的比例共转染BHK-21细胞。转染8-12小时后，弃去转染上清，用含10％DMSO的PBS缓冲液休克细胞2.5分钟，之后加入完全DMEM培养液(购自Gibco)，12小时后更换Opi-MEM培养基(购自Gibco)，并加入TPCK处理的胰酶(1μg/mL，购自Sigma)继续孵育72小时后收获培养物上清，经0.22μM孔径滤器(购自Millipore)过滤后接种9-11日龄SPF鸡胚尿囊腔(购自哈尔滨兽医研究所国家禽类种子资源中心)；接种72小时后取鸡胚尿囊液50μL进行新城疫病毒血凝(HA)和血凝抑制(HI)试验。收获HA及HI试验结果呈阳性的鸡胚尿囊液，分装后保存-70℃冻存备用。拯救出的重组病毒命名为rLa-NiVF。

1.4：重组病毒的鉴定

1.4.1：间接免疫荧光(IFA)

rLa-NiVF和LaSota疫苗株分别以MOI为0.01感染BHK-21细胞，感染24小时后弃去培养液，用PBS冼两次，之后用3％多聚甲醛(购自Sigma)室温固定30min，用PBST(含0.05％Tween-20的PBS)洗3遍，将rLa-NiVF感染的细胞分别加入1∶50倍稀释的小鼠抗NiV F单克隆抗体F2G1(如前所述，详细制备方法参见文献[12])、鸡抗新城疫阳性血清[7]、和非免疫小鼠血清(来源：将非免疫小鼠麻醉后采用眼球后静脉丛刺破法采取静脉血并分离得到)；LaSota疫苗株感染孔分别加1∶50倍稀释的鸡抗NDV血清(制备方法详见参考文献[7])、小鼠抗NiV F单克隆抗体F2G1、和非免疫小鼠血清，室温作用2小时；之后用PBST洗三次，再分别对应加入加1∶200倍稀释的FITC标记山羊抗鼠IgG(或抗鸡IgY)(购自Sigma)室温避光孵育1小时，之后用PBST洗5次，置于荧光显微镜(Leica DMIRES2)下观察结果。

1.4.2：细胞融合活性检测

将表达尼帕病毒G蛋白的真核表达质粒PCAGG-NiVG用Lipofectamine 2000脂质体转染试剂(购自Invitrogen)转染生长至80％-90％的单层BHK-21细胞。4小时后弃去培养液，用重组病毒rLa-NiVF以MOI约为0.1感染细胞，并做LaSota感染对照，感染一小时后加入完全DMEM培养液，置于5％CO2环境，37℃培养48小时后观察细胞融合情况。

1.5重组病毒的鸡胚生长动力学

将rLa-NIVF接种SPF鸡胚(购自哈尔滨兽医研究所国家禽类种子资源中心)，分别在24，48，72，96小时取样，并测定每个时间点样品的鸡胚半数感染量EID50。

1.6rLa-NiVF对小鼠的安全性实验

将rLa-NiVF用最大剂量(10⁶EID50/0.1ml)同时滴鼻30ul、肌肉注射100ul免疫10只6周龄雌性Balb/c小鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)，同时设立LaSota疫苗株免疫组及PBS组作为对照。免疫后每天固定时间称量小鼠体重并记录发病情况，持续两周。

1.7：重组病毒免疫Balb/c小鼠的体液和细胞免疫评价。

重组新城疫病毒rLa-NiVF按10⁶EID50/只肌肉注射免疫10只6周龄雌性Balb/c小鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)，并设立PBS对照组。初次免疫4周后加强免疫，免疫剂量和途径与初次免疫相同。在初次和加强免疫后两周，每组分别取5只小鼠采取安乐死，采集血液分离血清用ELISA以及中和试验测定体液免疫水平；同时采取小鼠脾脏细胞用尼帕病毒F蛋白特异性CD8细胞表位进行体外刺激，用流式细胞术(FACS)检测分泌IFN-γ的CD8T细胞所占百分比，以此作为评价细胞免疫的指标。

1.7.1酶联免疫吸附试验(ELISA)和病毒中和试验(VNA)评价免疫小鼠的体液免疫水平。

ELISA实验过程简述如下：以表达尼帕病毒F蛋白的重组杆状病毒感染的Sf9细胞裂解物作为包被抗原，用以检测rLa-NiVF初次和加强免疫后小鼠血清中IgG的浓度，具体操作步骤参见文献[13]。同时用已知浓度的鼠IgG(Southern Biotech)做梯度稀释包被ELISA板制作标准曲线。根据标准曲线获取的OD值与包被的标准抗原浓度之间的线性关系计算公式，根据所得公式计算血清中抗原特异性IgG的含量，用每毫升血液中含有的纳克数表示。中和试验(VNA)利用囊膜嵌合尼帕病毒G和F蛋白并表达绿色荧光蛋白的复制缺陷型水泡性口炎病毒假病毒粒子VSVΔG*GFP-NiVG/F进行。BHK-21细胞生长于96孔培养板至80％密度备用。待检血清做两倍连续稀释，每个稀释度25μl，与等体积约含200IU的伪型病毒VSVΔG*GFP-NiVG/F悬液混合，每份血清做三个重复。37℃感作1小时后感染BHK-21细胞，置于5％CO2，37℃培养24小时后在荧光显微镜下(Leica DMIRES2)观察并计数GFP阳性细胞。

1.7.2rLa-NiVF免疫小鼠的细胞免疫评价。

在免疫两周后对小鼠实施安乐死并分离脾脏细胞，用尼帕病毒F蛋白特异性CD8表位肽段刺激6小时，同时设置PMA和Ionomycin(佛波酯和离子霉素，Sigma)共刺激组作为阳性对照，以及不相关肽段刺激组为阴性对照(HIV Gag蛋白CD8表位)，所用刺激肽段终浓度均为10μg/ml。刺激结束后用含有3％胎牛血清的PBS洗细胞两次，之后用PE标记的小鼠CD3抗体，PerCP标记的小鼠CD8抗体(BDPharmingen)进行细胞表面标志染色。染色结束后用Fix&Perm试剂盒(Caltag)固定并破膜，随后加入APC标记的小鼠γ干扰素抗体(BDPharmingen)进行细胞内因子染色。染色结束后用FACS Aria(BectonDickinson)流式细胞仪对样品中γ干扰素阳性的CD8细胞进行计数。

1.8rLa-NiVF免疫猪的中和抗体效价

取2ml rLa-NiVF SPF鸡胚尿囊液经肌肉注射免疫4周龄断奶仔猪，初次免疫后四周加强免疫，免疫途径和剂量与初次免疫相同。免疫后每周采血并测定血清中和效价(实验步骤同小鼠)。

2结果

2.1表达NiV F蛋白的重组新城疫病毒构建和病毒拯救

在新城疫LaSota疫苗株反向遗传操作系统基础上[7]，在LaSota基因组Pme I位点插入5′端引入了NDV聚合酶特异性识别的基因起始/终止序列(GS/GE)的尼帕病毒F基因作为一个独立的转录单元，构建成表达NiV F蛋白的重组全长cDNA克隆rLa-NiVF。

将pBRN-FL-NiVF及表达NP、P、L蛋白的辅助质粒共同转染BHK-21细胞，72小时后收获转染细胞上清并接种于9-11日龄SPF鸡胚。72小时后收获HA及HI试验呈阳性的鸡胚尿囊液。RT-PCR以及测序结果显示，F基因正确插入到rLaSota基因组Pme I位点。拯救得到的重组病毒命名为rLa-NiVF，于2011年10月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(中国北京，中国科学院微生物研究所，100101)，保藏号为CGMCC No.5401。

2.2重组病毒rLa-NiVF能够正确表达尼帕病毒F蛋白

为证实重组病毒中F蛋白能够得到正确表达，分别以rLa-NiVF和LaSota疫苗株感染BHK-21细胞，以小鼠抗NiV G蛋白单克隆抗体F2G1、鸡抗NDV血清为一抗进行间接免疫荧光检测。结果如图2所示：rLa-NiVF感染BHK-21细胞用F2G1可以检测到特异性绿色荧光信号，而LaSota感染组和未感染对照组均呈阴性，表明重组病毒可以正确表达NiV F蛋白。

2.3rLa-NiVF与PCAGG-NiVG共表达导致细胞融合

尼帕病毒粘附蛋白G和融合蛋白F共同表达于细胞表面方可导致融合现象发生，单独表达任何一方均不能产生细胞融合。且尼帕病毒G和F蛋白导致的细胞融合具有特异性，尼帕病毒G蛋白和新城疫病毒F蛋白或尼帕病毒F蛋白与新城疫病毒HN蛋白共表达均不能导致细胞融合[14]。因此我们用尼帕病毒G蛋白真核表达质粒PCAGG-NiVG(表达已验证[15])转染BHK-21细胞，然后再以重组病毒rLa-NiVF进行感染，48小时后显微镜下即可观察到明显的细胞融合(图3如箭头所示)，表明rLa-NiVF可以正确表达具有生物学活性的F蛋白。

2.4插入尼帕病毒F基因没有改变重组病毒rLa-NiVF的鸡胚生长特性

为了验证插入尼帕病毒F基因没有改变重组病毒rLa-NiVF的鸡胚的生长特性，我们将rLa-NiVF接种SPF鸡胚，并在不同时间点取样并滴定每个时间点样品的EID50。参见图4，结果显示rLa-NiVF的鸡胚生长曲线与LaSota一致，表明重组病毒保持了与亲本毒株相似的高滴度鸡胚生长特性。

2.5重组病毒rLa-NiVF对小鼠具有良好的安全性。

rLa-NiVF以最大剂量同时经滴鼻和肌肉注射途径免疫小鼠，与对照组相比，观察期内三组小鼠全部存活，精神状态良好，小鼠体重均有所增加，但无明显差异(参见图5)，表明重组病毒与其亲本毒株一样对小鼠具有良好的安全性。

2.6rLa-NiVF能够诱导小鼠产生良好的体液和细胞免疫反应

参见图6，重组病毒rLa-NiVF能够诱导小鼠产生良好的ELISA抗体和中和抗体。初次免疫两周后，与对照组相比即能检测到明显的尼帕病毒特异性IgG抗体以及中和抗体(P＜0.05)，加强免疫后两种抗体水平较初次免疫显著上升(P＜0.01)。

rLa-NiVF能够诱导小鼠产生活跃的特异性CD8细胞免疫反应。在初次免疫和加强免疫后分别取5只小鼠脾脏细胞，用尼帕病毒F蛋白特异性CD8细胞表位进行刺激，并用流式细胞术检测能够对此表位刺激产生反应而活化的CD8淋巴细胞(表现为产生γ干扰素)占总CD8细胞的比例来反映机体的特异性细胞免疫水平。图7的结果显示，小鼠在初次免疫后即可产生针对NiV F蛋白的特异性CD8细胞免疫反应，加强免疫后CD8细胞免疫反应比初次免疫后显著增强(P＜0.05)。

2.7rLa-NiVF能够诱导猪产生高水平抗尼帕病毒中和抗体。

猪对尼帕病毒高度易感，是尼帕病毒传播最重要的中间宿主，也是对人类最具威胁的传染源，因而是尼帕病毒防控的重要环节。尼帕病毒疫苗能否在猪体内诱导中和抗体是判断疫苗成功与否的重要标准。我们用2ml重组病毒SPF鸡胚尿囊液经肌肉注射免疫4周龄断奶仔猪。初次免疫4周后以相同免疫剂量和途径加强免疫。初次和加强免疫后采血并分离血清，利用囊膜嵌合尼帕病毒G和F蛋白并表达绿色荧光蛋白的复制缺陷型水泡性口炎病毒假病毒粒子VSVΔG*GFP-NiVG/F模拟尼帕病毒粒子进行中和试验。从图8的结果可以看出，猪在初次免疫两周后即可产生中和抗体，虽然水平不高，但加强免疫后血清中和抗体显著上升(P＜0.01)。

3讨论

本研究利用新城疫病毒LaSota疫苗株反向遗传操作系统，将尼帕病毒F基因插入LaSota基因组作为一个独立的转录单元，成功构建并拯救出了表达尼帕病毒F蛋白的重组新城疫病毒rLa-NiVF，试验结果证明rLa-NiVF能够正确表达尼帕病毒F蛋白，且重组病毒保持了与LaSota疫苗株一致的高鸡胚生长滴度和对哺乳动物的高安全性。新城疫病毒LaSota疫苗株作载体具有以下优势：新城疫病毒遗传相对稳定，仅有一个血清型，毒株间发生重组及毒力返强可能性极小。NDV在哺乳动物上只一过性感染，安全性很高；复制过程在细胞浆内完成，从RNA到RNA，不存在DNA阶段及与细胞基因组整合的可能；NDV弱毒疫苗对哺乳动物是一种良好的佐剂，可诱导良好的先天性免疫以及特异性体液和细胞免疫从而产生更加全面、平衡的免疫保护；NDV弱毒具有高滴度的鸡胚生长特性，生产成本极为低廉。

重组新城疫病毒LaSota疫苗株是一种优秀的活疫苗载体，相较其他类型的疫苗(如亚单位疫苗，灭活疫苗等)其诱导特异性CTL细胞免疫应答的能力十分显著，从而为机体提供了更加全面的免疫保护。在本研究中我们用本实验室鉴定的尼帕病毒F蛋白Balb/c小鼠CD8细胞优势表位刺激免疫小鼠的淋巴细胞，发现rLa-NiVF免疫的小鼠可以对此表位产生良好的免疫应答。CD8细胞免疫主要介导杀伤性T细胞(CTL)反应。CTL反应迅速，它不仅能直接杀伤被感染细胞，且活化的CTL也能产生包括γ干扰素在内的多种细胞因子，从而进一步增强机体的免疫功能。与中和抗体不能清除细胞内病毒相比，CTL的优势显而易见。机体对病毒的清除过程中，CTL的作用不可或缺。rLa-NiVF在一次免疫小鼠10天后即可产生高水平的F蛋白特异性CD8细胞免疫，足以说明重组病毒在诱导CTL免疫反应方面具有非常理想的功效。本研究结果充分证实了rLa-NiVF不仅能使小鼠产生中和抗体，而且可以诱导产生非常显著的尼帕病毒F蛋白特异性CD8细胞免疫，我们预计这种CTL反应在保护机体对尼帕病毒攻击的过程中将会起到十分重要的作用。目前认为副粘病毒科成员的融合蛋白(F蛋白)是机体CTL细胞免疫应答的主要对象，而用F蛋白免疫机体则会诱导产生高水平的CD8细胞免疫应答。由于技术原因(缺少F蛋白猪的MHC I的表位)，本研究目前未能检测rLa-NiVF在猪体内诱导的特异性CD8免疫反应，但用小鼠模型得出的实验结果仍具有极高的参考价值，因此有理由相信rLa-NiVF在猪体内也能够诱导良好的CTL反应。

我国目前尚未发生过尼帕病毒脑炎，且操作尼帕病毒需要在生物安全IV级的条件下进行，因而本研究不能利用尼帕活病毒本身进行中和试验。因此我们制备了囊膜嵌合尼帕病毒G和F蛋白，具备一过性感染能力且表达绿色荧光蛋白的复制缺陷型(VSV基因组缺失其本身G基因)水泡性口炎病毒(VSV)伪型病毒VSVΔG*-NiVG/F模拟NiV活病毒进行中和试验[10]。被中和的尼帕病毒-水泡性口炎假病毒粒子不能侵入细胞，因而不会产生绿色荧光；反之未被中和的假病毒粒子经由尼帕病毒G和F蛋白介导的吸附和融合进入细胞，从而使被侵入细胞产生绿色荧光，因此血清中和效价可以表示为能使荧光细胞减少一半的最高血清稀释倍数。这种方法具有安全、稳定、快速，敏感性高的特点，实际应用效果良好。

Guillaume等人用表达尼帕病毒G或F蛋白的重组痘病毒免疫仓鼠并制备高免血清，用高免血清被动免疫仓鼠可以使其对致死剂量尼帕病毒的攻击产生保护[5]，说明中和抗体在机体抵御和清除尼帕病毒过程中起重要作用。本研究构建的表达尼帕病毒F蛋白的重组新城疫病毒rLa-NiVF在初次免疫两周后即能诱导猪产生一定水平的中和抗体，加强免疫后中和抗体水平较初次免疫后显著上升。Kaku[16]等人的研究比较了用尼帕病毒G和F蛋白囊膜嵌合水泡性口炎假病毒粒子以及尼帕活病毒做中和试验的血清稀释效价，发现两种方法得出的血清中和效价存在正相关关系。因此我们有理由相信rLa-NiVF产生的中和抗体在猪体实际接触尼帕病毒或进行实验性攻毒中能够为其提供免疫保护。

本实验室研发的表达尼帕病毒F蛋白的重组新城疫病毒LaSota疫苗株目前在国内外尚属首次报道，研究结果具有很强的创新性。rLa-NiVF不仅能够在哺乳动物模型中产生良好的细胞和体液免疫，而且可以使现地猪产生良好的中和抗体。rLa-NiVF作为一种具有储备性，前瞻性的优秀尼帕病毒候选疫苗对我国应对尼帕病毒的潜在威胁具有十分重要的战略意义。

除了用作预防尼帕病毒脑炎外，此疫苗株还可用于肿瘤治疗。用新城疫病毒作肿瘤治疗的疫苗载体已经见诸研究报道[17]，有的甚至已进入二期临床试验[18]。本发明提供的rLa-NiVF所表达的尼帕病毒F蛋白，可以在尼帕病毒G蛋白共同表达的条件下(如共同感染表达G蛋白的重组新城疫病毒LaSota疫苗株)，形成尼帕病毒特异性的合胞体，从而极大增强重组新城疫病毒溶解和破坏肿瘤组织的能力，以及避免之前存在的新城疫抗体对载体的影响。因为rLa-NiVF保持了与其载体病毒相同的高度哺乳动物安全性，所以对于正常健康组织仍然是高度安全的。

应该理解，尽管参考其示例性的实施方案，已经对本发明进行具体地显示和描述，但是本领域的普通技术人员应该理解，在不背离由后附的权利要求所定义的本发明的精神和范围的条件下，可以在其中进行各种形式和细节的变化，可以进行各种实施方案的任意组合。

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Claims (10)

1.一种表达尼帕脑炎病毒F蛋白的重组新城疫病毒LaSota疫苗株。

2.根据权利要求1所述的重组新城疫病毒LaSota疫苗株，其中尼帕脑炎病毒F蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No.2。

3.根据权利要求1所述的重组新城疫病毒LaSota疫苗株，其中尼帕脑炎病毒F蛋白的基因序列为SEQ ID No.1。

4.根据权利要求1所述的重组新城疫病毒LaSota疫苗株，其中所述用于表达F蛋白的新城疫LaSota疫苗株是AV1615。

5.根据权利要求1所述的重组新城疫病毒LaSota疫苗株，其命名为rLa-NiVF，保藏号为CGMCC No.5401。

6.一种用于预防尼帕病脑炎的疫苗，其包含有效量的权利要求1所述的表达尼帕脑炎病毒F蛋白的重组新城疫病毒LaSota疫苗株。

7.根据权利要求6所述的疫苗，其包含有效量的权利要求5所述的重组新城疫病毒LaSota疫苗株rLa-NiVF。

8.权利要求1-5中任一项所述的表达尼帕脑炎病毒F蛋白的重组新城疫病毒LaSota疫苗株用于制备预防尼帕病脑炎的疫苗的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其还包括所述表达尼帕病毒F蛋白的重组新城疫病毒LaSota疫苗株与表达尼帕病毒G蛋白的重组新城疫病毒LaSota疫苗株进行联合免疫。

10.构建表达尼帕脑炎病毒F蛋白的重组新城疫病毒LaSota疫苗株的方法，所述方法包括下述步骤：

(1)构建重组转录质粒，该转录质粒包括其中插入尼帕病毒F基因的所述新城疫LaSota疫苗株的基因组cDNA序列，将所述重组转录质粒命名为pBRN-NiVF；

(2)构建转录辅助质粒系统，该辅助质粒系统包括编码所述新城疫LaSota疫苗株的核蛋白(NP)的cDNA序列的辅助质粒pBSNP、编码所述新城疫LaSota疫苗株的磷蛋白(P)的cDNA序列的辅助质粒pBSP、和编码所述新城疫LaSota疫苗株的大聚合酶蛋白(L)的cDNA序列的辅助质粒pBSL；

(3)将步骤(1)的所述重组转录质粒pBRN-NiVF和步骤(2)的转录辅助质粒pBSNP、pBSP、pBSL共转染所述新城疫LaSota疫苗株复制许可的宿主细胞，培养转染后的宿主细胞；和

(4)收获上清液，过滤后接种鸡胚尿囊腔拯救重组病毒株。

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