CN117487005B - 靶向亨尼帕病毒融合蛋白diii区的广谱中和抗体及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种靶向亨尼帕病毒融合糖蛋白DIII区的单克隆抗体。所述抗体通过流式分选‑单细胞PCR技术筛选获得，由猴源可变区和人源恒定区组成，所述猴源可变区轻重链均具有独特的CDR区。本发明提供的抗体靶向F三聚体蛋白的同一区域，显示出优异的抗原结合能力，与亨德拉病毒和尼帕病毒F蛋白具有纳摩尔或亚纳摩尔级别的高亲和力。所述抗体能有效识别膜表面展示的天然结构F蛋白；所述抗体能够有效中和多种亨尼帕病毒的假病毒；所述代表性抗体1D6的抗原结合片段与F三聚体的高分辨率复合物结构表明所述抗体作用于F蛋白DIII结构域。本发明还公开了所述抗亨尼帕病毒融合糖蛋白F的单克隆抗体在制备亨尼帕病毒治疗药物中的应用。
Description
技术领域
本发明公开了一种单克隆抗体，属于多肽技术领域。
背景技术
尼帕病毒（NiV）和亨德拉病毒（HeV）是副黏病毒科亨尼帕病毒（HNVs）属的负链单链RNA病毒，可引起人类脑炎和呼吸道症状，致死率在50%–100%之间。亨尼帕病毒属还包括加纳病毒（GhV）、雪松病毒（CedV）及近年来在我国出现的墨江病毒（MojV）和琅琊病毒（LayV）。亨尼帕病毒的自然宿主是果蝠，也可感染猪、马等家畜。人类主要通过与被感染动物或人的体液接触而感染。
目前，NiV基因组序列分析确定了两个主要分支：M基因型和B基因型，其中M基因型包括马来西亚NiV分离株（NiVMY），B基因型包括孟加拉国NiV分离株（NiVBD）和印度NiV分离株（NiVI）。这三支毒株具有很高的同源性，NiVBD分支的感染性和致病性明显高于NiVMY分支。亨尼帕病毒宿主活动范围覆盖我国南方地区，且我国于近年来发现了两种新型亨尼帕病毒——墨江病毒和琅琊病毒，对我国生物安全产生潜在威胁。
亨尼帕病毒基因组长度约18 kb，由六个转录单位及3’和5’端的非翻译区组成，共编码6个结构蛋白，分别为核蛋白（nucleocapid protein）、磷蛋白（phosphoprotein）、膜蛋白（matrix protein）、融合糖蛋白（fusion protein）、附着糖蛋白（attachment protein）和聚合酶蛋白（large protein）。其中，P基因通过mRNA编辑、鸟嘌呤核糖核苷酸插入、可变阅读框等方式额外编码V蛋白、W蛋白和C蛋白3个非结构蛋白。对人高度致命的亨德拉病毒和尼帕病毒（HNVs）入侵细胞由膜表面的附着糖蛋白（G）和融合糖蛋白（F）共同介导。G是以四聚形式存在的II型膜蛋白，F为三聚形式的I型膜蛋白。G蛋白的头部结构域与宿主细胞表面的肝配蛋白B2/B3受体结合后，向F蛋白传递触发信号，F蛋白由融合前构象转变为融合后构象，促使病毒与宿主膜融合。形成合胞体是尼帕病毒和亨德拉病毒感染宿主细胞的典型现象。
亨尼帕病毒的高危险性决定对其活病毒相关的操作需要限制在四级生物安全实验室4（BSL-4）中，这限制了疫苗和抗体的开发。目前，针对HNVs尚无批准的人用疫苗或治疗方法。疫苗和抗体的开发策略主要靶向G蛋白和F蛋白，迄今仅有G蛋白相关的VSV载体疫苗和mRNA-1215疫苗进入临床I期试验。相关研究评估了一些广谱抗病毒小分子药物在动物体内针对亨尼帕病毒的治疗效果，均不太理想，仅有高剂量、持续给药10天以上才能实现较好保护。相比之下，抗体类药物有特异性强、安全性好的特点，在动物体内发挥了良好的保护效力，是治疗亨尼帕病毒病的理想选择。靶向G蛋白受体结合区的m102.4单抗能够有效保护雪貂、非洲绿猴，也被紧急应用于15名高风险暴露于HeV或NiV感染的个体。目前，m102.4抗体已完成I期临床。一株靶向HNVs F蛋白的鼠源抗体5B3，同样有效保护了致死剂量病毒攻击的动物。有限的抗体数量，再加上体外已分离出m102.4和5B3的逃逸突变株，强调了开发更多、更强效的广谱亨尼帕病毒候选抗体的技术需求，本发明的目的就是提供一种抗亨尼帕病毒的广谱抗体。
发明内容
基于上述目的，本发明首先提供了一种抗亨尼帕病毒融合蛋白（在本发明中也称为F蛋白或者融合糖蛋白F）DIII区的单克隆抗体，所述抗体重链可变区CDR1、CDR2和CDR3区氨基酸序列和轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3区氨基酸序列分别如下述任一序列组合所示：
SEQ ID NO:1第26-33、51-58和97-115位和SEQ ID NO:3第26-33、51-53和90-100位，或
SEQ ID NO:5第26-34、52-59、98-117位和SEQ ID NO:7第26-34、52-54、91-100位，或
SEQ ID NO:9第26-33、51-58、97-115位和SEQ ID NO:11第26-33、51-53、90-100位，或
SEQ ID NO:13第26-33、51-58、97-116位和SEQ ID NO:15第27-32、50-52、89-97位，或
SEQ ID NO:17第26-34、52-59、98-115位和SEQ ID NO:19第26-33、51-53、90-100位，或
SEQ ID NO:21第26-34、52-59、98-117位和SEQ ID NO:23第26-34、52-54、91-100位，或
SEQ ID NO:25第28-35、53-59、98-118位和SEQ ID NO:27第26-33、51-53、90-100位。
在一个优选的实施方案中，所述抗体重链可变区的氨基酸序列和抗体轻链可变区的氨基酸序列分别如下述任一序列组合所示：
SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3，在本发明中具有该重链可变区的氨基酸序列和抗体轻链可变区的氨基酸序列的一个具体技术方案的抗体被命名为“1D6”，或
SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:7，在本发明中具有该重链可变区的氨基酸序列和抗体轻链可变区的氨基酸序列的一个具体技术方案的抗体被命名为“1G8”，或
SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:11，在本发明中具有该重链可变区的氨基酸序列和抗体轻链可变区的氨基酸序列的一个具体技术方案的抗体被命名为“5D4”，或
SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:15，在本发明中具有该重链可变区的氨基酸序列和抗体轻链可变区的氨基酸序列的一个具体技术方案的抗体被命名为“5D5”，或
SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:19，在本发明中具有该重链可变区的氨基酸序列和抗体轻链可变区的氨基酸序列的一个具体技术方案的抗体被命名为“5H1”，或
SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:23，在本发明中具有该重链可变区的氨基酸序列和抗体轻链可变区的氨基酸序列的一个具体技术方案的抗体被命名为“6E4”，或
SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:27，在本发明中具有该重链可变区的氨基酸序列和抗体轻链可变区的氨基酸序列的一个具体技术方案的抗体被命名为“6H7”。
在一个更为优选的实施方案中，所述抗体重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO:29所示，所述抗体轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO:31（Kappa）或SEQ ID NO:33（lamda）所示。本发明所提供的重链恒定区和抗体轻链恒定区均为人源的恒定区。在本发明的一个具体实施方案中，所述5D5抗体的轻链恒定区为kappa链，其余6株，即，1D6、1G8、5D4、5H1、6E4、6H7均为lamda链。
其次，本发明提供了一种编码上述单克隆抗体重链和轻链的多核苷酸，编码所述抗体的重链可变区的多核苷酸序列和编码所述抗体的轻链可变区的多核苷酸序列分别如下述任一序列组合所示：
SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4，具有该重链可变区和轻链可变区编码序列的单克隆抗体为1D6，或
SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8，具有该重链可变区和轻链可变区编码序列的单克隆抗体为1G8，或
SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:12，具有该重链可变区和轻链可变区编码序列的单克隆抗体为5D4，或
SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:16，具有该重链可变区和轻链可变区编码序列的单克隆抗体为5D5，或
SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:20，具有该重链可变区和轻链可变区编码序列的单克隆抗体为5H1，或
SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:24，具有该重链可变区和轻链可变区编码序列的单克隆抗体为6E4，或
SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:28具有该重链可变区和轻链可变区编码序列的单克隆抗体为6H7。
在一个优选的实施方案中，编码所述抗体重链恒定区的多核苷酸的序列如SEQ IDNO:30所示，编码所述抗体轻链恒定区的多核苷酸的序列如SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:34所示。
第三，本发明提供了一种表达上述编码单克隆抗体重链和轻链的多核苷酸的功能元件。
在一个优选的实施方案中，所述功能元件为线性表达框或哺乳动物表达载体。
在本发明的一个具体实施方案中，通过重叠延伸PCR将启动子序列（GenBANK登记号：X03922.1）、抗体前导肽的编码序列、抗体可变区（从单细胞中扩增获得）、抗体恒定区（生工生物合成）、多聚A尾（GenBANK登记号：X03896.1）连接起来，构建了含抗体轻重链全长和轻链全长的线性表达框。
在本发明的另一个具体实施方案中，采用哺乳动物表达载体pcDNA3.4克隆了抗体轻重链全长和轻链全长编码基因。
第四，本发明提供了含有所述线性表达框或哺乳动物表达载体的宿主细胞。
在一个优选的实施方案中，所述细胞为HEK293T细胞或Expi 293F细胞。
在本发明的一个具体实施方案中，采用HEK293T细胞作为宿主细胞表达了线性表达框上的抗体轻重链全长和轻链全长基因。
在本发明的另一个具体实施方案中，采用Expi 293F细胞作为宿主细胞表达了pcDNA3.4载体上的抗体轻重链全长和轻链全长基因。
最后，本发明提供了上述的单克隆抗体在制备亨尼帕病毒病治疗药物中的应用。
本发明采用流式分选-单细胞PCR技术从恒河猴外周血中获得一组靶向亨尼帕病毒F蛋白的强效单克隆抗体，由猴源可变区和人源恒定区组成，所述猴源可变区轻重链均具有独特的CDR区。本发明提供的抗体靶向F三聚体蛋白的同一区域，显示出优异的抗原结合能力，与亨德拉病毒和尼帕病毒F蛋白具有纳摩尔或亚纳摩尔级别的高亲和力。所述抗体能有效识别膜表面展示的天然结构F蛋白；所述抗体能够有效中和多种亨尼帕病毒的假病毒；所述代表性抗体1D6的抗原结合片段与F三聚体的高分辨率复合物结构表明所述抗体作用于F蛋白DIII结构域。因此，本发明提供的抗亨尼帕病毒融合糖蛋白F的单克隆抗体可以作为应用于制备亨尼帕病毒治疗药物，为广谱疫苗设计、靶向治疗以及抗体的鸡尾酒疗法开发提供了广谱而特异的候选药物，有利于提高应对突发新发传染病的快速响应能力。
附图说明
图 1. 免疫原制备与纯度、粒径、活性检测分析图谱；
图 2. 血清结合与中和滴度检测分析图；
图 3. 流式分选NiV sF特异记忆B细胞分析图谱；
图 4. 抗体轻重链可变区配对扩增图谱；
图 5. ELISA筛选HNVs sF特异性抗体OD值分布图；
图 6. 假病毒中和实验筛选中和抗体细胞感染率分布图；
图 7. ELISA检测抗体交叉结合活性曲线图；
图 8. 抗体与膜表面展示的天然结构F蛋白结合能力检测结果图；
图 9. 假病毒中和实验检测抗体交叉中和活性曲线图；
图 10. 抗体的结合竞争性分析图；
图 11. 抗体与NiV和HeV F蛋白的亲和力曲线图；
图 12. NiVBD-sF/1D6-Fab复合物结构示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的权利要求所限定的保护范围构成任何限制。
实施例1. 抗体筛选
1. 抗原的制备
使用NiVBD和HeV F蛋白全长序列制备mRNA疫苗，用于动物初次免疫。毛细管电泳检测转录、加帽产物均一性，纯度大于80%（图1A，1B）。随后包封mRNA-HNVs F的脂质体纳米颗粒，制备的mRNA-NiV/HeV F-LNP包封率分别为91.5%和87.4%，平均粒径分别为86.1 nm和88.3 nm（图1C）。此外，构建尼帕病毒和亨德拉病毒F蛋白胞外区三聚体质粒，在Expi293系统中表达可溶性F蛋白（sF），得到纯度在90%以上的目的蛋白（图1D），使用阳性抗体5B3经ELISA验证，纯化的sF蛋白构象正确（图1E，1F）。
2. 免疫恒河猴
通过肌注的方式免疫恒河猴，初次免疫（第0天）使用mRNA-NiV F-LNP和mRNA-HeVF-LNP各100 μg，第28天和第49天分别使用NiV sF和HeV sF（100 μg sF + 0.25 mg铝佐剂+150 μg CpG）进行加强免疫。采集第0、21、28、35、42、49和56天的促凝血分离血清后进行抗体结合与中和水平检测，采集第77天的抗凝血分离外周血单核细胞进行抗体筛选。第56天血清对HNVs具有同等水平的高结合（~106，图2A）与中和（~104，图2B）滴度。
3. FITC标记F蛋白
需要通过荧光标记的抗原来分选特异的记忆B细胞，异硫氰酸荧光素（FITC）标记抗原蛋白NiV sF方法如下：
（1）FITC（SIGMA, F4274）溶于DMSO，浓度为10 mg/mL。
（2）使用截留分子量为10 kDa的0.5 mL超滤管将200 μg NiV sF蛋白置换于新鲜配制的0.1 M碳酸钠缓冲液（pH=9.0）。
（3）加入5 μL FITC染料于蛋白溶液中，混匀后置于4 ℃避光孵育8 h。
（4）加入NH4Cl至终浓度50 mM，4 ℃避光孵育2 h。
（5）使用PBS和截留分子量为10 kDa的0.5 mL超滤管多次离心换液去除蛋白溶液中多余的FITC染料，标记好的NiV sF-FITC测定浓度后置于4℃避光保存。
4. 分离恒河猴外周血单个核细胞
将前述2. 免疫恒河猴中采集的第77天血样通过Ficoll密度梯度离心法分离PBMC，过程如下：
（1）将猴淋巴细胞分离液平衡至室温，摇晃充分混匀，加等体积于采集血样的淋巴细胞分离液至干净50 mL离心管。
（2）用等体积、放至室温的PBS溶液将抗凝管中的恒河猴外周血稀释混匀。
（3）将2倍于分离液的稀释后外周血（血样：PBS：淋巴细胞分离液比例为1:1:1）缓慢平铺到分离液上方，该过程中保持两液面分界清晰。
（4）将准备好的样品以700 g离心25 min，加速减速设为3档位。
（5）离心结束后，吸弃血浆匀浆层，将单核细胞层小心转移至干净的离心管中。
（6）加入PBS至总体积40 mL，600 g离心5 min，加/减速设为9档位。
（7）弃掉上清，PBS重复清洗1次。用400 μL PBS重悬细胞，并经40 μm细胞筛过滤后计数。
（8）将细胞稀释至1×107cells/mL，单染管及裸细胞对照管每管加100 μL，剩余细胞全部加入分选管。
5. 流式分选NiV sF蛋白特异记忆B细胞
（1）各管按表1分别加入荧光抗体。
（2）将细胞置于4℃避光孵育1 h。
（3）每管加入2 mL FPBS，800 g、4℃离心5 min。
（4）重复清洗1次。
（5）弃上清，单染管及对照管用400 μL FPBS重悬，分选管加入适量FPBS，置于4℃避光待分选。
表1. 荧光抗体用量
（6）使用细胞分选仪（SONY，MA900）分选F蛋白特异的单个记忆B细胞。先上机对照管和单染管，调节补偿。然后分选细胞，设置圈门方案：通过SSC和FSC 圈出淋巴细胞，设为门1（图3A）；门1中选定的细胞通过FSC-H和FSH-A去粘连；PerCP和APC圈出CD3–CD19+的细胞，设为门2（图3B）；门2中选定的细胞通过PE-Cy7和PE圈出CD27+IgG+的细胞，设为门3（图3C）；门3中选定的细胞通过FITC圈出NiV sF+的细胞，设为门4（图3D）；门4中的细胞群（CD3–CD19+CD27+IgG+NiV sF+）为特异的记忆B细胞。
（7）将单个细胞分选至96孔PCR板内，每孔提前加入20 μL去RNA酶水和20 U RNA酶抑制剂（0.5 μL）。
（8）将96孔板迅速置于液氮冷却，然后放置于干冰，进行后续单细胞PCR实验。
结果：共分选得到564个NiV sF特异性记忆B细胞，其表面分子标记为CD3–CD19+CD27+IgG+NiV sF+（图3）。
6. 单细胞PCR扩增抗体可变区基因
（1）单细胞反转录PCR
按表2所示准备反转录PCR体系。
表2. 反转录-PCR 反应体系
反应条件：42℃，10 min；25℃，10 min；50℃，60 min；94℃，5 min。
（2）第一轮巢式PCR
以反转录 PCR 产物为模板，使用 TransStart Taq DNA 聚合酶进行第一轮巢式PCR反应，体系如表3，引物序列见表4。
表3. 第一轮巢式 PCR反应体系
反应条件：首先95℃，5 min；95℃，然后进行40个循环的30 s，57℃，30 s，72℃，45s；最后，72℃，10 min
表4. 第一轮巢式 PCR反应引物
（SEQID NO.35-71）
（3）第二轮巢式 PCR
以第一轮巢式 PCR 产物为模板，使用 TransStart Taq DNA 聚合酶进行第二轮巢式PCR反应，体系如表5，引物序列见表6。
表5. 第二轮巢式 PCR反应体系
表6. 第二轮巢式 PCR反应引物
（SEQID NO.72-110）
/>
（4）毛细管电泳
巢式PCR结束后，扩增产物用QIAxcel DNA Fast Analysis Cartridge进行毛细管电泳，挑选获得192个配对的抗体轻重链可变区序列（图4）。对阳性克隆进行测序，测序获得的抗体可变区序列用Vector NTI软件及IMGT网站进行分析。
7. 线性表达框表达抗体
通过重叠延伸PCR将启动子序列（GenBANK登记号：X03922.1）、抗体前导肽的编码序列、抗体可变区（从单细胞中扩增获得）、抗体恒定区（生工生物合成）、多聚A尾（GenBANK登记号：X03896.1）连接起来，构建含抗体轻重链全长的线性表达框。具体过程如下：
（1）扩增启动子-前导序列片段
按照表7的反应体系和条件进行PCR反应，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳后，对目的片段切胶回收。
反应条件：首先，95℃，5 min；其次，30个循环的95℃，30 s；60℃，30 s；72℃，1min；最后72℃，10 min。
表7. 扩增启动子-前导序列片段体系
（2）扩增恒定区-多聚A尾片段
按照表8中的反应体系和条件进行PCR反应， PCR完成后进行琼脂糖凝胶电泳，对目的片段切胶回收。
表8. 扩增恒定区-多聚A尾片段体系
/>
反应条件： 首先，95℃，5 min；其次，30个循环的95℃，30 s；60℃，30 s；72℃，2min；最后72℃，10 min。
（3）扩增可变区片段
以轻、重链配对成功的单细胞第二轮巢式PCR产物为模板，按照表9体系进行PCR反应。
表9. 扩增可变区片段体系
反应条件： 首先，95℃，5 min；其次，30个循环的95℃，30 s；60℃，30 s；72℃，30s；最后，72℃，10 min。
（4）扩增线性表达框
按照表10体系进行PCR反应。
表10. 扩增线性表达框体系
反应条件：首先，95℃，5 min；其次，30个循环的95℃，30s；60℃，30s；72℃，3min；最后，72℃，10min。
扩增产物通过N96 DNA产物纯化试剂盒进行回收，然后用NanoVue Plus超微量分光光度计检测DNA含量。
8. ELISA筛选抗原特异性抗体
（1）接种HEK293T细胞至96孔板，每孔3×104个细胞，200 μL培养基。细胞培养至密度达到70-90%时进行转染。
（2）使用10 μL Opti-MEM无血清培养基稀释轻重链线性表达框（各0.15 μg），加入0.6 μL Turbofect 转染试剂，混匀，室温孵育15 min。
（3）将脂质体复合物加入96孔板，细胞放入37℃孵箱培养36 h。
（4）ELISA实验前一天包被酶标板，每孔加入100 μL浓度为1 μg/mL的NiV F和HeVF抗原蛋白，4℃孵育过夜。
（5）酶标板用BioTek 405 LS 洗板机洗3次后，每孔加入100 μL 封闭液（含2% BSA的PBST），37℃培养箱孵育1 h。
（6）洗板3次。每孔加入150 μL上清，37℃培养箱孵育1 h。
（7）洗板3次。加入100 μL以1:10000稀释的山羊抗人IgG（HRP）抗体，37℃培养箱孵育1 h。
（8）洗板3次。加入100 μL TMB单组分显色液，室温显色6 min。
（9）加入50 μL终止液，在SpectraMax 190 酶标仪上读取450-630 nm波长OD值。
（10）以阴性孔平均值的2.1倍作为Cutoff值来判定阳性克隆。
结果：对192个克隆进行结合筛选，以OD450-630nm值等于0.1时为Cutoff值，鉴定出100株抗原特异性抗体（图5）。其中92株对NiV sF和HeV sF有交叉结合活性，4株抗体只与NiV sF结合，4株只与HeV sF结合。交叉反应性抗体中有56株表达良好或对NiV sF和HeV sF结合能力较强，OD450-630nm值均大于1.0。
9. 假病毒实验筛选中和抗体
（1）如前所述，线性表达框转染96孔细胞培养板，转染36–48 h后收集细胞上清。
（2）取新的96孔细胞培养板，加入90 μL转染上清和10 μL前期包装的HIV骨架的HeV或NiV假病毒，37℃孵育1 h。
（3）HEK293T细胞计数，将100 μL细胞液（含3×104个细胞）加入假病毒-细胞上清混合液中，每孔终体积为200 μL。将培养板置于 37℃、5% CO2孵箱中培养48 h。
（4）小心吸除培养基，加入50 μL的稀释好的1×细胞裂解液，室温震荡裂解10min。
（5）吸取20 μL裂解液上清，转移至96孔白色微孔板，加入50 μL荧光素酶底物（Promega，E1501），在多功能微孔板检测仪中读取发光值。
结果：对192个克隆进行中和筛选，以细胞感染率60%为判定标准，初步鉴定出25株rHIV-HNVs交叉中和抗体（图6）进行抗体制备和活性评估。
实施例2. 抗体制备
根据实施例1中的第8.和第9.结果，选择7株HNVs强交叉结合/中和抗体（编号为1D6、1G8、5D4、5D5、5H1、6E4和6H7）构建表达质粒，制备单抗。方法如下：
1. 将重链轻链线性表达框全长基因用EcoRI（NEB，R3101）和NotI（NEB，R3189）双酶切，连接至pcDNA3.4表达质粒。
2. 取抗体重链轻链质粒各15 μg，转染至30 mL Expi293体系（Life，A14524）中，125 rpm，5% CO2培养72 h。
3. 3000×g、4℃离心15 min收取表达上清，经0.22 μm针头滤器抽滤后，使用rProtein A亲和纯化。
4. 用PBS对收集的抗体进行浓缩换液，然后用BCA蛋白定量试剂盒（ThermoScientific，23225）测定抗体浓度。
实施例3. ELISA检测抗体结合活性
1. 实验前一天，96孔酶联板包被1 µg/mL的NiVBDsF和HeV sF，每孔100 µL。将包被的酶联板放入湿盒，4℃过夜。
2. 实验当天用洗板机洗3次，每孔加入100 µL封闭液，37℃孵育1 h。
3. 洗板机洗3次。首孔加入150 µL浓度为5 µg/mL的单抗，其余孔加入100 µL的稀释液。从首孔吸出50 µL加入到次孔，以此类推，按1:3梯度稀释，每孔终体积为100 µL。37℃孵育1 h。
4. 洗板机洗3次。将HPR标记的羊抗人IgG二抗（Abcam，ab97225）以1:10000稀释，每孔加入100 µL至ELISA板，37℃孵育1 h。
5. 洗板机洗3次。每孔加入100 µL的TMB单组分显色液，室温避光显色6 min。
6. 每孔加入50 µL终止液终止反应，将ELISA板加载至酶标仪检测450-630 nm处的OD值。将数据导入GraphPad软件，采用四参数拟合剂量-反应曲线，计算EC50值。
结果：七株单抗对NiVBDsF（图7A）和HeV sF（图7B）具有良好的交叉结合活性。其中，1D6、1G8、5D4、5D5、5H1、6E4和6H7，与NiV sF结合EC50值分别为3.0 ng/mL、71.0 ng/mL、17.2ng/mL、3.0 ng/mL、10.0 ng/mL、35.0 ng/mL和10.7 ng/mL；与HeV sF结合EC50值分别为3.7ng/mL、85.9 ng/mL、39.3 ng/mL、4.4 ng/mL、6.1 ng/mL、34.3 ng/mL和11.5 ng/mL。对照抗体5B3（Patent No. US15951327B2）与NiVBDsF和HeV sF的结合EC50值分别为15.1 ng/mL和21.9 ng/mL；1H8和4H3（PMID: 36932063）仅结合NiV sF，EC50值分别为28.3 ng/mL和2.2ng/mL；无关对照抗体（control mAb）为埃博拉病毒GP抗体2G1，不结合NiVBDsF或HeV sF。总体而言，5D5、6H7、1D6和5H1单抗的交叉结合能力优于现有技术已报道的3株F蛋白抗体。
实施例4. 流式细胞术检测抗体对膜表面F蛋白的结合能力
1. 将NiVBDF全长转染至HEK293细胞中，培养36 h后，用含0.03% EDTA的PBS消化细胞。
2. 将细胞移至50 mL离心管中，600×g离心5 min，小心倒掉上清，加入适量PBS重悬细胞。
3. 使用70 μm细胞筛过滤细胞，去除细胞团块，进行计数。
4. 稀释细胞，流式管每管加入5×105个细胞，100 μL体积。
5. 每管加入2 μg/mL抗体，体积100 μL，室温孵育1 h。
6. 每管加入3 mL PBS，600×g离心5 min，小心倒掉上清。
7. 使用PBS溶液稀释PE Mouse Anti-Human IgG（BD 555787）抗体（5 μL/管），每管100 μL体积，室温避光孵育1 h。
8. 每管加入3 mL PBS，600×g离心5 min，小心倒掉上清。
9. 每管加入200 μL PBS重悬细胞，在FACSCanto II flow cytometer上分析，每管计数10000个细胞。
结果：与阴性对照抗体2G1（0%，埃博拉病毒GP抗体）相比，1D6、1G8、5D4、5D5、5H1、6E4和6H7均能有效结合展示在细胞膜表面的天然结构F全长蛋白，PE阳性细胞群分别为53.4%、33.1%、45.0%、33.0%、54.1%、44.6%和53.9%（图8）。
实施例5. 假病毒中和实验检测抗体中和活性
使用前期包装的HIV骨架的NiVBD、HeV和HeV-g2假病毒，评价抗体的交叉中和活性。评价方法如下：
1. 用DMEM培养基稀释单抗，96孔细胞培养板首孔加入75 μL浓度为5 μg/mL的抗体稀释液，其余孔加入50 μL的DMEM培养基。
2. 从首孔吸取25 μL液体加入次孔，混匀，以此类推，按1:3倍比稀释，每孔终体积为50 μL。
3. 将假病毒按1:5用DMEM培养基稀释，加入至各抗体孔，每孔50 μL。混匀，37℃孵育1 h。
4. 将HEK 293T细胞计数，3×105cells/mL，每孔加入100 μL。
5. 将96孔细胞培养板放入37℃恒温箱中培养48 h。
6. 取出细胞培养板，小心吸弃培养液。各孔加入50 µL细胞裂解液，350 rpm震荡裂解10 min。
7. 吸取20 µL裂解上清转移到96孔白色微孔板，加入50 μL荧光素酶底物（Promega，E1501），在多功能微孔板检测仪中读取发光值。
8. 计算抗体对细胞的保护率，将数据导入GraphPad软件，采用四参数拟合剂量-反应曲线，计算IC50值。
结果：1D6、1G8、5D4、5D5、5H1、6E4和6H7单抗对3种HNVs假病毒具有良好的交叉中和活性（图9）。其中，七株抗体对rHIV-NiVBD的IC50值分别为16.9 ng/mL、430.7 ng/mL、62.6ng/mL、35.4 ng/mL、42.8 ng/mL、34.1 ng/mL和19.6 ng/mL；对rHIV-HeV的IC50值分别为3.4ng/mL、102.5 ng/mL、44.2 ng/mL、21.2 ng/mL、3.4 ng/mL、15.7 ng/mL和6.8 ng/mL；对rHIV-HeV-g2的IC50值分别为2.9 ng/mL、87.6 ng/mL、17.0 ng/mL、18.8 ng/mL、1.5 ng/mL、19.4 ng/mL和2.8 ng/mL。对照抗体5B3（Patent No. US15951327B2）对3种假病毒的中和IC50值分别为268.6 ng/mL、85.7 ng/mL和22.0 ng/mL；1H8和4H3（PMID: 36932063）仅中和rHIV-NiVBD，IC50值分别为3198.0 ng/mL和18.2 ng/mL。总体而言，1D6、5D4、5D5、5H1、6E4和6H7单抗对3种HNVs假病毒的交叉中和能力优于上述已报道的3株F蛋白抗体，在1 μg/mL的浓度下即可对3种HNVs假病毒实现近100%的中和。
实施例6. 抗体的竞争结合分析
通过ELISA检测七株抗体的结合竞争性，具体方法如下：
1. 实验前一天，使用EZ-Link™ Sulfo-NHS-Biotin按照 1∶20（抗体∶生物素）的摩尔比对200 μg抗体进行标记，使用0.5 mL体积、截留分子量为30 kDa 的超滤管多次离心去除游离生物素。标记好的抗体使用NanoVue测定浓度，4℃避光保存。
2. 96孔酶标板每孔包被100 μL浓度为1 μg/mL的NiVBDsF，4℃孵育过夜。
3. 实验当天，将酶标板用 BioTek 405 LS 洗板机洗3次后，每孔加入100 μL封闭液，37℃孵育1 h。
4. 洗板3次。每孔加入50 μL未标记生物素的抗体（100倍于EC50浓度），按矩阵横向加入，37℃孵育30 min。
5. 每孔加入50 μL标记生物素的抗体（EC50浓度），按矩阵纵向加入，顺序与封闭抗体相同，37℃孵育30 min。
6. 洗板3次。加入100 μL以1:10000稀释的Streptavidin-HRP抗体，37℃孵育1 h。
7. 洗板3次。加入100 μL的TMB单组分显色液，室温显色6 min。
8. 加入50 μL终止液，读取450-630nm波长OD值。竞争值=（竞争抗体存在时生物素化抗体OD值/无关抗体存在时生物素化抗体OD值）×100%。竞争值＜33.3，判定为强竞争；＞66.7，判定为不竞争；介于33.3和66.7之间为弱竞争。
结果：七株抗体和对照抗体4H3存在较强竞争（图10），提示它们的结合表位重叠或空间上接近。
实施例7. 抗体亲和力测定
通过Biacore T200仪器利用Protein A芯片检测抗体与NiV 和HeV F蛋白的亲和力，测定方法如下：
1. 将抗体稀释至1 µg/mL，以10 μL/min的流速加载120 s至Protein A芯片上。
2. 将F蛋白从100 nM浓度开始，连续2倍梯度稀释至0.40 nM，并以30 μL/min的流速加载至已捕获抗体的Protein A芯片，结合120 s，解离900 s。
3. 选取5条代表性曲线，通过仪器配置分析软件计算抗体的亲和力（KD）。
结果：七株抗体与NiV 和HeV F蛋白具有高亲和力，均在纳摩尔或亚纳摩尔级别（图11）。其中，1D6、1G8、5D4、5D5、5H1、6E4和6H7，与NiV F的亲和力分别为0.14 nM、0.16nM、0.81 nM、0.72 nM、0.46 nM、0.42 nM和2.60 pM；与HeV F的亲和力分别为91.30 pM、0.79 nM、1.87 nM、1.32 nM、26.50 pM、1.19 nM和0.16 nM。
实施例8. 1D6抗体Fab与NiV sF三聚体复合物结构解析
选择七株抗体中的代表性抗体1D6，制备Fab片段，与NiV sF孵育后，使用凝胶柱制备抗原抗体复合物，通过冷冻电镜解析获得分辨率达1.99Å的NiVBD-sF/1D6-Fab复合物结构。图12为NiVBD-sF/1D6-Fab复合物结构分析示意图。结果表明，1D6-Fab识别位于F三聚体顶端DIII区域的保守表位。鉴于七株HNVs强交叉中和抗体均靶向该区域附近，提示该区域可作为广谱疫苗和抗体的潜在靶点。
Claims (10)
1. 一种靶向亨尼帕病毒融合蛋白DIII区的单克隆抗体，其特征在于，所述抗体重链可变区CDR1、CDR2和CDR3区氨基酸序列和轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3区氨基酸序列分别如下述任一序列组合所示：
SEQ ID NO:1第26-33、51-58和97-115位和SEQ ID NO:3第26-33、51-53和90-100位，或
SEQ ID NO:5第26-34、52-59、98-117位和SEQ ID NO:7第26-34、52-54、91-100位，或
SEQ ID NO:9第26-33、51-58、97-115位和SEQ ID NO:11第26-33、51-53、90-100位，或
SEQ ID NO:13第26-33、51-58、97-116位和SEQ ID NO:15第27-32、50-52、89-97位，或
SEQ ID NO:17第26-34、52-59、98-115位和SEQ ID NO:19第26-33、51-53、90-100位，或
SEQ ID NO:21第26-34、52-59、98-117位和SEQ ID NO:23第26-34、52-54、91-100位，或
SEQ ID NO:25第28-35、53-59、98-118位和SEQ ID NO:27第26-33、51-53、90-100位。
2. 根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述抗体重链可变区的氨基酸序列和抗体轻链可变区的氨基酸序列分别如下述任一序列组合所示：
SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3，或
SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:7，或
SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:11，或
SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:15，或
SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:19，或
SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:23，或
SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:27。
3. 根据权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于，所述抗体重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO:29所示，所述抗体轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:33所示。
4. 一种编码权利要求1-3任一所述单克隆抗体重链和轻链的多核苷酸，其特征在于，编码所述抗体的重链可变区的多核苷酸序列和编码所述抗体的轻链可变区的多核苷酸序列分别如下述任一序列组合所示：
SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4，或
SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8，或
SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:12，或
SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:16，或
SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:20，或
SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:24，或
SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:28。
5. 根据权利要求4所述的多核苷酸，其特征在于，编码所述抗体重链恒定区的多核苷酸的序列如SEQ ID NO:30所示，编码所述抗体轻链恒定区的多核苷酸的序列如SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:34所示。
6.一种表达权利要求5所述编码单克隆抗体重链和轻链的多核苷酸的功能元件。
7.根据权利要求6所述的功能元件，其特征在于，所述功能元件为线性表达框或哺乳动物表达载体。
8.一种含有权利要求7所述线性表达框或哺乳动物表达载体的宿主细胞。
9.根据权利要求8所述的宿主细胞，其特征在于，所述细胞为HEK293T细胞或Expi 293F细胞。
10.权利要求1-3任一项所述的单克隆抗体在制备亨尼帕病毒病治疗药物中的应用。
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