CN115975019B - 一种抗新型冠状病毒的抗体及其用途 - Google Patents
一种抗新型冠状病毒的抗体及其用途 Download PDFInfo
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Landscapes
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Abstract
本发明涉及一种抗新型冠状病毒的抗体及其用途，该抗体包含重链可变区和轻链可变区，重链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ IDNO:1～3所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；并且轻链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4～6所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或者重链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO:7～9所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；并且轻链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO:10～12所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。本发明的抗体对多种新型冠状病毒均具有高中和活性。
Description
技术领域
本发明涉及免疫学和分子生物学领域，尤其涉及一种抗新型冠状病毒的抗体及其用途。
背景技术
新型冠状病毒(SARS-CoV-2)为单股正链RNA病毒，属于冠状病毒科家族的β属，其编码四种结构蛋白，包括刺突蛋白(spike，S)，包膜蛋白(envelope，E)，膜蛋白(membrane，M)和核衣壳(nucleocapsid，N)，16种非结构蛋白和5-8种辅助蛋白。SARS-CoV-2利用病毒表面的S蛋白与宿主细胞受体-血管紧张素转换酶II(ACE2)进入细胞。S蛋白根据蛋白结构功能又被分为两个功能单位，即S1和S2蛋白亚基。S1分为NTD(N-terminal domain，N末端结构域)和RBD(Receptor binding site，受体结合位点)，RBD区域长约240个氨基酸，主要与宿主细胞受体结合，S2介导病毒和宿主细胞膜融合。根据已有的报导，SARS-CoV-2中和抗体主要靶向RBD区域，抗体结合RBD，阻碍RBD与ACE2的结合，从而阻止病毒感染细胞。
中和抗体是有抗病毒活性的抗体，可以识别病毒表面蛋白，能够有效阻止病毒进入易感细胞，并阻断新产生子代病毒的再次感染，在对抗各类病毒性感染疾病时发挥重要作用。新冠病毒被鉴定后，全球科研人员立即启动了抗新冠病毒中和抗体的研发工作。目前，全球有数百个抗SARS-CoV-2中和抗体项目正在开展研究，已有产品获得国内外药品监管机构的紧急使用授权或应急批准上市，如：贝特洛韦单抗(Bebtelovimab)、Sotrovimab和REGN-COV等6个产品获得FDA的紧急使用授权(Emergency Use Authorization，EUA)；中国国家药品监督管理局应急批准了安巴韦单抗(Amubarvimab)与罗米司韦单抗(Romlusevimab)联合疗法的注册申请；瑞基罗纳(Regkirona)在欧盟与韩国获批上市。此外，还有仑兹鲁单抗(Lenzilumab)、Adintrevimab以及SCTA01等多个中和抗体处于II或III期临床研究阶段。
但自COVID-19爆发以来，SARS-CoV-2不断变异，使其传染性和致病性均发生了变化，多个已经获批EUA的中和抗体失效。因此分离出更多的强效广谱中和抗体作为备选，可以更有效地避免病毒发生免疫逃逸。而目前科学界尚无已报道的类似广谱抗体。
因此，需要一种对多种新型冠状病毒(包括原始株和变异株)均具有高中和活性的抗体。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的是提出一种抗新型冠状病毒的抗体及其用途，该抗体对新型冠状病毒原始株和世界范围内多个不同的新型冠状病毒代表株均具有高中和活性。
基于上述目的，本发明的第一个方面提供了一种抗新型冠状病毒的抗体，包含重链可变区和轻链可变区，其中：
所述重链可变区包含氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的HCDR1、氨基酸序列如SEQID NO：2所示的HCDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示的HCDR3；并且
所述轻链可变区包含氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示的LCDR1、氨基酸序列如SEQID NO：5所示的LCDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示的LCDR3；
或者
所述重链可变区包含氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示的HCDR1、氨基酸序列如SEQID NO：8所示的HCDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示的HCDR3；并且
所述轻链可变区包含氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示的LCDR1、氨基酸序列如SEQID NO：11所示的LCDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示的LCDR3。
在本申请中，HCDR表示重链可变区中的一个互补决定区(CDR)，例如HCDR1是指重链可变区中的CDR1；LCDR表示轻链可变区中的一个互补决定区(CDR)，例如LCDR1是指轻链可变区中的CDR1。
在本发明的优选实施方案中，所述重链可变区还包含氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示的HFR1、氨基酸序列如SEQ ID NO：14所示的HFR2、氨基酸序列如SEQ ID NO：15所示的HFR3和氨基酸序列如SEQ ID NO：16所示的HFR4；并且
所述轻可变区还包含氨基酸序列如SEQ ID NO：17所示的LFR1、氨基酸序列如SEQID NO：18所示的LFR2、氨基酸序列如SEQ ID NO：19所示的LFR3和氨基酸序列如SEQ ID NO：20所示的LFR4；
或者
所述重链可变区还包含氨基酸序列如SEQ ID NO：21所示的HFR1、氨基酸序列如SEQ ID NO：22所示的HFR2、氨基酸序列如SEQ ID NO：23所示的HFR3和氨基酸序列如SEQ IDNO：24所示的HFR4；并且
所述轻可变区还包含氨基酸序列如SEQ ID NO：25所示的LFR1、氨基酸序列如SEQID NO：26所示的LFR2、氨基酸序列如SEQ ID NO：27所示的LFR3和氨基酸序列如SEQ ID NO：28所示的LFR4。
在本申请中，HFR表示重链可变区中的一个框架区(FR)，例如HFR1是指重链可变区中的FR1；LFR表示轻链可变区中的一个框架区(FR)，例如LFR1是指轻链可变区中的FR1。
在本申请中，每个重链可变区和轻链可变区通常包含3个CDR和最多达4个FR，所述CDR和FR从氨基末端至羧基末端以例如以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在本申请抗体的重链可变区的CDR和FR从氨基末端至羧基末端以以下顺序排列：HFR1、HCDR1、HFR2、HCDR2、HFR3、HCDR3、HFR4；在本申请抗体的轻链可变区的CDR和FR从氨基末端至羧基末端以以下顺序排列：LFR1、LCDR1、LFR2、LCDR2、LFR3、LCDR3、LFR4。
在本发明的优选实施方案中，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：29，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：30所示；或者
所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：31，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：32所示。
在本发明的优选实施方案中，所述抗体为人源化单克隆抗体。
本发明的第二个方面提供了一种核酸分子，其包含编码上述抗体的核苷酸序列。
在本发明的优选实施方案中，编码所述抗体的核苷酸序列包含：
1)编码所述重链可变区的核苷酸序列，其如SEQ ID NO：33所示；和编码所述轻链可变区的核苷酸序列，其如SEQ ID NO：34所示；
或者
2)编码所述重链可变区的核苷酸序列，其如SEQ ID NO：35所示；和编码所述轻链可变区的核苷酸序列，其如SEQ ID NO：36所示。
本发明的第三个方面提供了一种载体，其包含上述核酸分子。
本发明的第四个方面提供了一种细胞，其包含上述核酸分子或上述载体。
本发明的第五个方面提供了一种药物组合物，其包含上述抗体、上述核酸分子、上述载体或上述细胞，以及可药用载体。
本发明的第六个方面提供了上述抗体、上述核酸分子、上述载体、上述细胞或上述药物组合物在制备预防和/或治疗新型冠状病毒药物或制备新型冠状病毒检测试剂中的用途。
本发明的有益效果为：
本发明抗新型冠状病毒的抗体具有独特的CDR区，可以有效中和新型冠状病毒原始株和目前全球范围内流行的多种新型冠状病毒突变株，其IC50均在0.01μg/mL～0.1μg/mL，具有显著的广谱中和能力。因此，本发明的抗体可用于制备预防和/或治疗新型冠状病毒药物。此外，本发明的抗体可用以制备新型冠状病毒检测试剂，从而用于检测病毒抗原以及用于发现有效中和抗原表位。
附图说明
图1：流式细胞分选示意图。
图2：(1)抗体与刺突ECD蛋白(Spike ECD蛋白)结合ELISA结果；(2)抗体与刺突RBD蛋白(Spike RBD蛋白)结合ELISA结果。
图3：(1)抗体A46与ACE2蛋白-RBD蛋白竞争ELISA结果；(2)抗体A70与ACE2蛋白-RBD蛋白竞争ELISA结果。
图4：(1)抗体A46中和SARS-CoV-2原始株假病毒结果；(2)抗体A70中和SARS-CoV-2原始株假病毒结果。图1：流式细胞分选示意图。
具体实施方式
需要说明的是，除非另外定义，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为所属领域的技术人员所理解的通常意义。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。
当用于本文和所附权利要求书中时，单数形式“一”、“一种”、“另一”和“所述”包括复数指代对象，除非上下文明确地另有指示。
在本申请中，术语“包含”通常是指包括明确指定的特征，但不排除其他要素。
在本申请中，术语“抗体”具有本领域常规的含义，是指由四条多肽链组成的免疫球蛋白分子，四条多肽链指通过二硫键互相连接的两条重(H)链和两条轻(L)链。通过分析不同抗体重链和轻链的氨基酸序列发现，重链和轻链靠近N端的氨基酸序列变化很大，其他部分氨基酸序列相对恒定。因此，将抗体轻链和重链中靠近N端氨基酸序列变化较大的区域称为可变区(variable region，V)，将靠近C端的氨基酸序列相对稳定的区域，称为恒定区(constant region，C)，重链和轻链的V区分别简称为VH和VL，重链和轻链的C区分别简称为CH和CL。在抗体可变区内有一小部分氨基酸残基变化特别强烈，这些氨基酸的残基组成和排列顺序更易发生变异区域称高变区(hypervariable regions，HVR)；在L链、H链的V区中各有三个高变区，该部位因在空间结构上可与抗原决定簇形成精密的互补，故高变区又称互补性决定区(complementarity determining region，CDR)。抗体中，常见的划分CDR规则有Kabat、AbM、Chothia、Contact、IMGT，这些规则为本领域技术人员熟知的，当应用执行这些规则的网站时，只要将VH和VL序列输入并选择相应规则，即可得到依据不同规则的CDR序列。本领域技术人员应当理解，本申请的保护范围涵盖了通过采用不同规则分析获得的CDR序列的组合。抗体的6个CDR区共同决定了抗体对相应抗原的识别能力和特异性。本领域技术人员应当理解，当本申请限定了6个CDR区的氨基酸序列时，抗体对相应抗原的识别能力和特异性是可预期的。
在本申请中，术语“可变区”指抗体重链或轻链中涉及抗体结合抗原的域。天然抗体的重链和轻链的可变区(分别为VH和VL)一般具有类似的结构，可进一步细分为穿插在更保守的区域(称为框架区(FR))中的高变区(称为互补决定区(CDR))。
在本申请中，术语“互补决定区”(CDR，例如CDR1、CDR2和CDR3)是指抗体可变区的这样一些氨基酸残基，其存在对于抗原结合来说是必需的。每个可变区通常具有3个被鉴别为CDR1、CDR2和CDR3的CDR区域。每个互补决定区可包含来自如Kabat所定义的“互补决定区”的氨基酸残基(Kabat et al.，Sequences of Proteins of Immulological Interest，5th Ed.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD.1991))和/或来自“高变环”的那些残基(Chothia and Lesk；J Mol Biol 196：901-917(1987))。
在本申请中，给定抗体的互补性决定区(CDR)和框架区(FR)可以使用Kabat体系标识(Kabat等：Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，美国卫生和公众服务部，PHS，NIH，NIH出版编号91-3242，1991)。
在本申请中，术语“全人源化抗体”是指将人类抗体基因通过转基因或转染色体技术，将人类编码抗体的基因全部转移至基因工程改造的抗体基因缺失动物中，使动物表达人类抗体，达到抗体全人源化的目的。“全人源化”的目的是消除非人来源抗体在人体内的免疫原性，而同时最大可能地保留亲和力。选择与非人来源抗体构架序列最相似的人构架序列为模板进行人源化改造是有利的。在某些情况下，可能需要用非人构架中相应的残基替换人类构架序列中的一个或多个氨基酸，以避免亲和性的丧失。
在本申请中，“单克隆抗体”是指获自基本上同质的抗体群体的抗体，即，所述包含单一抗体的群体除了可能以极少量存在的可能突变(例如天然突变)之外是相同的。因此，所述术语“单克隆”表明所述抗体的性质，即不是不相关抗体的混合物。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂的每个单克隆抗体均针对抗原上的单独一个决定簇。除了其特异性之外，单克隆抗体制剂的优点在于它们通常不会被其他抗体污染。所述术语“单克隆”不应被理解为需要通过任何特定的方法产生所述抗体。所述术语单克隆抗体具体地包括嵌合抗体、人源化抗体和人抗体。
在本申请中，术语“假病毒”和“类病毒”二者具有相同的含义，可互换使用；其是指，由病毒蛋白自组装形成的一种类似于病毒的颗粒，其不包裹核酸或者包裹了其他核酸，从而，所述假病毒或类病毒虽然能够感染宿主细胞，但不具有自主复制能力。因此，与真正的病毒相比，其生物安全性高。假病毒的包装系统一般由两部分组成，即包装组分和表达组分。包装组分由病毒(例如，HIV-1)基因组去除了包装、逆转录和整合所需的遗传信息而构建，提供假病毒颗粒所必须的蛋白；表达组分则与包装组分互补，含有包装、逆转录和整合所需的遗传信息，同时含有外源目的基因。将包装组分与载体组分共同转染宿主细胞，即可在细胞上清中收获假病毒颗粒。
在本申请中，术语“中和抗体”是指具有中和活性的抗体。术语“中和活性”是指抗体或抗体片段具有与病毒上的抗原蛋白相结合，从而阻止病毒感染细胞和/或病毒子代的成熟和/或病毒子代的释放的功能活性，具有中和活性的抗体或抗体片段可以阻止病毒的扩增，从而抑制或消除病毒的感染。
在本申请，抗体与抗原的结合力可通过本领域常用的方法测定，例如ELISA法，通常用EC50和IC50表示。EC50是指半数效应浓度，能达到50％最大生物效应对应的抗体的浓度；IC50是指半数抑制浓度，对特定的生物过程(例如ACE2结合RBD蛋白)抑制一半时所需的抗体的浓度。EC50和IC50的值越小，抗体与抗原的结合能力越强。
在本申请中，术语“载体”通常指可将编码某蛋白的多聚核苷酸插入其中并使蛋白获得表达的一种核酸运载工具。载体可通过转化、转导或转染宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞内得以表达。举例来说，载体包括：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。一种载体可能含有多种控制表达的元件，包括启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。载体还有可能包括有协助其进入细胞的成分，如病毒颗粒、脂质体或蛋白外壳，但不仅仅只有这些物质。
在本申请中，术语“药物组合物”通常指适合施用于患者的药物组合物，其可以包含本申请所述的抗体、核酸分子、载体或细胞，还可以包含一种或多种药学上可接受的辅料，如：载剂、保护剂、稳定剂、赋形剂、稀释剂、增溶剂、表面活性剂、乳化剂、防腐剂中的一种或多种。
如背景技术部分所述，本发明所要解决的技术问题是提供一种对多种新型冠状病毒(包括原始株和变异株)均具有高中和活性的抗体。为了解决该技术问题，本发明通过单个B细胞流式分选-抗体基因扩增配对表达技术筛选获得两种人源化抗新型冠状病毒的单克隆抗体A46和A70。
本发明筛选得到的抗体A46和A70均属于中和抗体，中和抗体是B淋巴细胞产生的一些抗体，可以与病原微生物表面的抗原结合，从而防止病原微生物黏附至靶细胞受体并侵袭宿主细胞。在COVID-19治疗中，中和抗体被认为是可以识别病毒表面S蛋白并阻止其与宿主细胞受体结合的抗体，它可以与细胞竞争结合病毒S蛋白上的RBD。新型冠状病毒的刺突蛋白(S蛋白)组合成一个三聚体，约含有1300个氨基酸。S蛋白决定了病毒的宿主范围和特异性，也是宿主中和抗体的重要作用位点。
另外，本发明筛选得到的抗体A46和A70为全人源化抗体，人源性抗体能够消除非人来源抗体在人体内的免疫原性，而同时最大可能地保留亲和力。
本发明的实施例2-4证明了：
(1)A46抗体与刺突ECD蛋白结合EC50为26.10ng/mL，与RBD蛋白结合EC50为35.47ng/mL；A70抗体与刺突ECD蛋白结合EC50为35.14ng/mL，与RBD蛋白结合EC50为51.12ng/mL。
(2)A46抗体抑制ACE2结合RBD蛋白IC50为702.9ng/mL；A70抗体抑制ACE2结合RBD蛋白IC50为515.3ng/mL。
(3)A46抗体中和原始株假病毒IC50为0.1108μg/mL，A70抗体中和原始株假病毒IC50为0.0922μg/mL。A46和A70抗体对新冠病毒原型株具有较强的中和作用。A46和A70抗体对新冠病毒Alpha、Beta、Gamma、Lota、Epsilon、Delta、Lambda、Kappa、Omicron BA.1、BA.1.1、BA.2、BA.2.12.1和BA.4/5均具有较强的中和能力。
由此可以看出，这两种抗体具有独特的CDR区，能与SARS-COV-2特异性结合并且可以有效中和原始株和目前全球范围内流行的多种新冠病毒突变株，其IC50均在0.01μg/mL～0.1μg/mL，具有显著的广谱中和能力。
总之，本发明筛选得到的抗体A46和A70是全人源化和有显著的广谱中和能够力的单克隆抗体。
1.A46抗体
A46抗体包含重链可变区和轻链可变区。
1.1
A46抗体的重链可变区
A46抗体的重链可变区包含3个互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3；以及4个框架区HFR1、HFR2、HFR3和HFR4，分别如下所示：
HFR1：EVQLLESGGGLIQPGGSLRLSCAVS(SEQ ID NO：13)
HCDR1：EFIVSRNY(SEQ ID NO：1)
HFR2：MSWVRQAPGKGLEWVSVL(SEQ ID NO：14)
HCDR2：YPGGST(SEQ ID NO：2)
HFR3：FYADSVKGRFTISRDESTNTLFLQMNTLRVEDTAVYYC(SEQ ID NO：15)
HCDR3：ARDFGDFYFDF(SEQ ID NO：3)
HFR4：WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：16)
重链可变区的氨基酸序列为：
EVQLLESGGGLIQPGGSLRLSCAVSEFIVSRNYMSWVRQAPGKGLEWVSVLYPGGSTFYADSVKGRFTISRDESTNTLFLQMNTLRVEDTAVYYCARDFGDFYFDFWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：29)
编码重链可变区的核苷酸序列为：
GAGGTGCAACTACTGGAGTCTGGAGGAGGCTTGATCCAGCCGGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGTGTCTGAGTTCATCGTCAGTAGGAACTACATGAGTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCTGTTCTTTATCCCGGTGGTTCCACATTCTACGCAGACTCCGTCAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACGAGTCCACGAACACCCTGTTTCTTCAAATGAACACCTTGAGAGTCGAAGACACGGCCGTGTATTATTGTGCGAGAGACTTCGGTGACTTCTACTTTGACTTCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCCG(SEQ ID NO：33)
1.2
A46抗体的轻链可变区
A46抗体的轻链可变区包含3个互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3；以及4个框架区LFR1、LFR2、LFR3和LFR4，分别如下所示：
LFR1：EIVLTQSPGTLSLSPGQRAALSCRAS(SEQ ID NO：17)
LCDR1：QSVSTY(SEQ ID NO：4)
LFR2：LAWYQQKPGQAPRLLIH(SEQ ID NO：18)
LCDR2：DAS(SEQ ID NO：5)
LFR3：SRASGVPDRFSGTGSGTDFTLTITRLEPEDFAVYYC(SEQ ID NO：19)
LCDR3：QQYGTSPRT(SEQ ID NO：6)
LFR4：FGQGTKLEIK(SEQ ID NO：20)
轻链可变区的氨基酸序列为：
EIVLTQSPGTLSLSPGQRAALSCRASQSVSTYLAWYQQKPGQAPRLLIHDASSRASGVPDRFSGTGSGTDFTLTITRLEPEDFAVYYCQQYGTSPRTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO：30)
编码轻链可变区的核苷酸序列为：
GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTCTGTCTCCAGGGCAAAGAGCCGCCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCACTTATTTAGCCTGGTACCAGCAGAAGCCTGGCCAGGCTCCTAGACTCCTCATCCATGATGCATCCAGCAGGGCCTCTGGCGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCACTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCACCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTATGGGACCTCACCTAGAACCTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAAC(SEQ ID NO：34)
2.A70抗体
A70抗体包含重链可变区和轻链可变区。
2.1
A70抗体的重链可变区
A70抗体的重链可变区包含3个互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3；以及4个框架区HFR1、HFR2、HFR3和HFR4，分别如下所示：
HFR1：QITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSG(SEQ ID NO：21)
HCDR1：FSLDTPGVA(SEQ ID NO：7)
HFR2：IGWIRQPPGRALEWLGLI(SEQ ID NO：22)
HCDR2：YWDGDE(SEQ ID NO：8)
HFR3：RYNPSLTSRVTLTKDTSKNQVVLTMTNVDSVDTGTYFC(SEQ ID NO：23)
HCDR3：GHKTIPTIFGV(SEQ ID NO：9)
HFR4：WGQGAPVTVSS(SEQ ID NO：24)
重链可变区的氨基酸序列为：
QITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLDTPGVAIGWIRQPPGRALEWLGLIYWDGDERYNPSLTSRVTLTKDTSKNQVVLTMTNVDSVDTGTYFCGHKTIPTIFGVWGQGAPVTVSS(SEQ ID NO：31)
编码重链可变区的核苷酸序列为：
CAGATCACCTTGAAGGAGTCTGGTCCTACGCTGGTGAAACCCACACAGACCCTCACGCTGACTTGCACCTTCTCGGGCTTCTCACTCGATACGCCTGGAGTGGCTATTGGCTGGATCCGCCAGCCCCCAGGGAGGGCCCTGGAGTGGCTAGGCCTCATTTATTGGGATGGTGATGAGCGGTACAACCCGTCTCTGACCAGCAGGGTCACCCTCACCAAGGACACCTCCAAAAACCAGGTCGTCCTGACAATGACCAACGTGGATTCTGTGGACACAGGCACATATTTCTGTGGACATAAGACAATACCGACCATCTTTGGAGTCTGGGGCCAGGGAGCCCCGGTCACCGTCTCCTCAG(SEQ ID NO：35)
2.2 A70抗体的轻链可变区
LFR1：QSALTQPASVSGSPGQSITISCAAT(SEQ ID NO：25)
LCDR1：SGDFGVFNY(SEQ ID NO：10)
LFR2：VSWYQQHPGKAPKLIIF(SEQ ID NO：26)
LCDR2：EVS(SEQ ID NO：11)
LFR3：SRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTVSGLQAEDEAVYHC(SEQ ID NO：27)
LCDR3：SSYSTSSVV(SEQ ID NO：12)
LFR4：FGGGTKLTVL(SEQ ID NO：28)
轻链可变区的氨基酸序列为：
QSALTQPASVSGSPGQSITISCAATSGDFGVFNYVSWYQQHPGKAPKLIIFEVSSRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTVSGLQAEDEAVYHCSSYSTSSVVFGGGTKLTVL(SEQ ID NO：32)
编码轻链可变区的核苷酸序列：
CAGTCTGCCCTGACTCAACCTGCCTCCGTGTCTGGGTCTCCTGGACAGTCGATCACCATCTCCTGCGCTGCAACCAGCGGTGACTTTGGTGTTTTTAACTATGTCTCATGGTATCAACAACATCCAGGCAAAGCCCCCAAACTCATTATTTTTGAGGTCTCTAGTCGGCCCTCAGGCGTTTCTAATCGCTTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCAACACGGCCTCCCTGACCGTCTCTGGACTCCAGGCTGAGGACGAGGCTGTTTATCACTGCAGCTCATATTCAACCAGCAGCGTGGTCTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTGG(SEQ ID NO：36)
本发明还涉及包含编码本发明抗体的核苷酸序列的核酸分子。编码所述抗体的核苷酸序列包含：
1)编码所述重链可变区的核苷酸序列，其如SEQ ID NO：33所示；和编码所述轻链可变区的核苷酸序列，其如SEQ ID NO：34所示；
或者
2)编码所述重链可变区的核苷酸序列，其如SEQ ID NO：35所示；和编码所述轻链可变区的核苷酸序列，其如SEQ ID NO：36所示。
本发明还提供了包含本发明的一个或多个核酸分子的载体，所述载体例如质粒、噬粒、噬菌体或病毒载体，编码本发明的抗体的核酸分子被插入所述载体中。
本文提供的抗体可通过在细胞(例如宿主细胞)中重组表达编码轻链和重链或其部分的核苷酸序列来制备。为了以重组方法表达抗体，可用携带编码轻链和/或重链或其部分的核苷酸序列的一个或多个重组表达载体转染宿主细胞，以使得所述轻链和重链在所述宿主细胞中表达。标准重组DNA方法学被用于制备和/或获得编码重链和轻链的核酸、将这些核酸纳入重组表达载体中并且将所述载体引入至宿主细胞中，例如Sambrook，Fritschand Maniatis(eds.)，Molecular Cloning；A Laboratory Manual，Second Edition，ColdSpring Harbor，N.Y.，(1989)、Ausubel，F.M.et al.(eds.)Current Protocols inMolecular Biology，Greene Publishing Associates，(1989)和Boss et al.的美国专利No.4,816,397中记载的那些。
此外，可将编码所述重链和/或轻链的可变区的核苷酸序列转化为例如编码全长抗体链、Fab片段或ScFv的核苷酸序列：例如可以将编码轻链可变区或重链可变区的DNA片段可操作地连接(以使得所述两个DNA片段编码的氨基酸序列都在框架中)至编码例如抗体恒定区或柔性接头的另一DNA片段。人重链和轻链恒定区的序列是本领域中已知的(参见，例如Kabat，E.A.，el al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，Fifth Edition，U.S.Department of Health and Human Services，NIH PublicationNo.91-3242)，包括这些区域的DNA片段可通过标准PCR扩增来获得。
因此，本发明的实施方案还为包含所述载体或核酸分子的宿主细胞，其中所述宿主细胞可为高等真核宿主细胞例如哺乳动物细胞、低等真核宿主细胞例如酵母细胞，并可为原核细胞例如细菌细胞。
可将本发明的抗体与至少一种其他试剂(例如稳定化合物)制备成药物组合物，其包括本发明的抗体和一种或多种药物可接受载体、稀释剂或赋形剂。
本发明提供的抗体可以用于制备COVID-19紧急预防和/或治疗药物，具有全人源化、高表达、稳定性好的特点，适合产业化。此外，该抗体还可用于制备SARS-COV-2病毒检测试剂，用于检测病毒抗原以及用于发现有效中和抗原表位。
下面结合具体的实施例对本发明提供的技术方案做进一步的描述。下述实施例仅用于对本发明进行说明，并不会对本发明的保护范围进行限制。
实施例1抗SARS-CoV-2全人源单克隆抗体的筛选
1.1样本准备
(1)新冠肺炎康复患者PBMC细胞(外周血单个核细胞)复苏：将冻存细胞取出后，置于37℃水浴中，待融化后，转移至含有1640培养基(含10％胎牛血清)中的离心管中，于300g，离心5分钟，弃去上清，以含2mM EDTA及0.5％牛血清白蛋白(BSA)的PBS溶液(下文用LB溶液表示)，调整细胞浓度为1×108个/mL，每管100μL。
(2)分离Pan B细胞：使用MojoSortTM Human Pan B Cell Isolation Kit试剂盒，向每管加入3μL生物素化的抗体混合物，充分混匀，置于4℃孵育15分钟。每管加入5μL链霉亲和素纳米磁珠，充分混匀，置于4℃孵育15分钟。加入LB溶液至500μL，转移至MiltenyiTMMS Columns，收集过滤液，以500μL LB溶液冲洗磁力柱一次，合并两次细胞滤液，置于离心管中，调整细胞数为5×105个/管
(3)对分离的细胞进行活性染色：将B细胞于4℃、300g离心5分钟，弃去上清。配制Zombie NIRTM Fixable Viability工作液：用PBS对Zombie NIRTM Fixable Viability储存液进行1：200稀释获得细胞活性染色工作液，离心管每管加入100μL细胞活性染色工作液，于室温避光孵育10分钟后，每管加入1mL PBS溶液终止反应，于4℃、300g离心5分钟，弃去上清。
(4)制备PE标记Spike蛋白及FITC标记RBD：取1.5mL离心管，加入89μL PBS溶液，加入1μL BioLegendTMPE-Streptavidin，加入2μg ACROBiosystemsTM Biotinylated SARS-CoV-2 Spike蛋白，置于冰上保存40分钟，得到PE标记Spike蛋白；取1.5mL离心管，加入94.5μL PBS溶液，加入2μL BioLegendTM FITC-Streptavidin，加入0.5μg ACROBiosystemsTMBiotinylated SARS-CoV-2 RBD蛋白，置于冰上保存40分钟，得到FITC标记RBD蛋白。
(5)对分离的细胞进行表面染色：加入100μL荧光标记流式抗体混合液(含5μLBioLegendTM抗人CD19-APC，5μL BioLegendTM抗人CD27-BV510，5μL BioLegendTM抗人IgD-BV421，5μL BioLegendTM抗人IgG-PerCP/Cy5.5，5μL Spike-PE(步骤(4)制备)，5μl RBD-FITC(步骤(4)制备))，混匀后，至冰上避光孵育40分钟。每管加入1mL LB，于4℃、300g离心5分钟，弃去上清，重复上述操作一次，以200μL LB溶液重悬细胞，准备进行流式分选。
1.2单个B细胞流式分选
选择Live+/CD19+/CD27+/IgG+/IgD-/Spike+/RBD+的细胞进行分选，圈门策略如下：首选圈定出单个淋巴细胞群，再圈定出Live+的活细胞，再圈出CD19+的B细胞，再圈定出CD27+的记忆B细胞，再圈出IgG+/IgD-的B细胞，最后圈出与探针Spike及探针RBD结合的记忆性B细胞。将B细胞以每孔1个分选入含有PBS的96孔板中。流式分选的结果如图1所示。分选结束后，立刻用封口膜封好96孔板并置于干冰上凝固，再转移入-80℃冰箱，次日进行RT-PCR操作。
1.3单个B细胞VDJ RT-PCR及BCR重链和轻链的克隆
单个B细胞VDJ RT-PCR根据参考文献【Gieselmann L，Kreer C，Ercanoglu MS，etal.Effective high-throughput isolation of fully human antibodies targetinginfectious pathogens.Nat Protoc.2021；16(7)：3639-3671.】提供的方法进行操作，扩增BCR重链和轻链可变区序列，并通过IMGT比对VDJ序列。比对正确的BCR重链和轻链可变区序列按照分子克隆常规方法分别克隆到重链表达载体IgGvec-Hb和轻链表达载体IgGvec-L。
1.4抗体表达和纯化
将293F细胞浓度调整为5×105个/mL，置于细胞培养摇瓶培养过夜，于次日进行转染。具体如下，配置A溶液：在12mL的GibcoTM Opti-MEM中加入90μg抗体重链质粒和180μg抗体轻链质粒，B溶液：在12mL的Opti-MEM中加入750μL的PEI转染试剂，震荡混匀。将溶液A和B混合，于室温静置20分钟，逐滴加入300mL的293F细胞中，置于8％CO2，37℃下，120rpm培养5天。
收集的细胞上清利用Protein A亲和磁珠纯化得到抗体，利用NanoDrop2000微量分光光度计测定抗体浓度，操作方法按照厂商提供的说明书进行。
1.5筛选结合SARS-CoV-2RBD蛋白抗体
使用包被缓冲液稀释SinobiologicalTM刺突RBD蛋白，加入96孔ELISA板中，使每孔刺突RBD蛋白为50ng，置于4℃过夜。次日弃去上清，每孔加入300μL 5％BSA封闭液，置于37℃孵育2小时，弃去封闭液，使用PBS-T溶液洗涤一遍。使用含有0.5％BSA的PBS溶液梯度稀释待测抗体为10μg/mL，加入封闭完成的ELISA板中，置于37℃孵育1小时，弃去溶液，使用PBS-T溶液洗涤3遍，于吸水纸上拍干。加入Sigma-AldrichTM HRP偶联抗人IgG-Fc抗体(1∶10000，含有0.5％BSA的PBS溶液稀释)，每孔100μL，置于37℃，孵育1小时，弃去溶液，使用PBS-T溶液洗涤3遍，于吸水纸上拍干。每孔加入100μL TMB显色液，置于室温静置反应10分钟，每孔加入50μL终止液。于酶标仪中以450nm波长读取吸光度值。从75个测试抗体中，我们筛选出2株对SARS-CoV-2 RBD蛋白具备较强结合能力抗体。结果见表1。
本发明筛选得到2株全人源新型冠状病毒单克隆抗体，对其重链和轻链的基因扩增产物进行测序，获得抗体的重链和轻链的基因编码序列和氨基酸序列如下：
A46抗体的重链可变区核苷酸序列如SEQ ID NO：33所示，氨基酸序列如SEQ IDNO：29所示，重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列如SEQ ID NO：29的第26-33、52-57和96-106位氨基酸所示，分别如SEQ ID NO：1～3所示；轻链可变区的核苷酸序列如SEQ IDNO：34所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：30所示，轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：30的第27-32、50-52和89-97位氨基酸所示，分别如SEQ ID NO：4～6所示。
A70抗体的重链可变区核苷酸序列如SEQ ID NO：35所示，氨基酸序列如SEQ IDNO：31所示，重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列如SEQ ID NO：31的第27-35、54-59和98-108位氨基酸所示，分别如SEQ ID NO：7～9所示；轻链可变区的核苷酸序列如SEQ IDNO：36所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：32所示，轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：32的第26-34、52-54和91-99位氨基酸所示，分别如SEQ ID NO：10～12所示。
实施例2抗体对SARS-CoV-2刺突蛋白及RBD蛋白结合能力测定
2.1 ELISA板包被：
使用包被缓冲液稀释SinobiologicalTM刺突ECD蛋白或刺突RBD蛋白，加入96孔ELISA板中，使每孔刺突ECD蛋白或RBD蛋白为50ng，置于4℃过夜。次日弃去上清，每孔加入300μL 5％BSA封闭液，置于37℃孵育2小时，弃去封闭液，使用PBS-T溶液洗涤一遍。
2.2 ELISA检测：
使用含有0.5％BSA的PBS溶液梯度稀释待测抗体(A46抗体和A70抗体)，加入封闭完成的ELISA板中，置于37℃孵育1小时，弃去溶液，使用PBS-T溶液洗涤3遍，于吸水纸上拍干。加入Sigma-AldrichTM HRP偶联抗人IgG-Fc抗体(1∶10000，含有0.5％BSA的PBS溶液稀释)，每孔100μL，置于37℃，孵育1小时，弃去溶液，使用PBS-T溶液洗涤3遍，于吸水纸上拍干。每孔加入100μL TMB显色液，置于室温静置反应10分钟，每孔加入50μL终止液。于酶标仪中以450nm波长读取吸光度值，结果见图2。如结果所示，ELISA测定A46抗体与Spike ECD蛋白结合EC50为26.10ng/mL，与RBD蛋白结合EC50为35.47ng/mL；A70抗体与Spike ECD蛋白结合EC50为35.14ng/mL，与RBD蛋白结合EC50为51.12ng/mL。
实施例3抗体竞争人源ACE2蛋白与SARS-CoV-2 RBD蛋白结合能力测定
3.1 ELISA板包被：
使用包被缓冲液稀释RBD蛋白，加入96孔ELISA板中，使每孔RBD蛋白为50ng，置于4℃过夜。弃去上清，每孔加入300μL 5％BSA封闭液，置于37℃孵育2小时，弃去溶液，使用PBS-T溶液洗涤一遍。
3.2竞争ELISA检测：
使用含有0.5％BSA的PBS溶液梯度稀释待测抗体(A46抗体和A70抗体)，加入封闭完成的ELISA板中，置于37℃孵育1小时，弃去溶液，使用PBS-T溶液洗涤3遍，于吸水纸上拍干。加入ACROBiosystemsTMBiotinylated ACE2蛋白(2μg/mL，含有0.5％BSA的PBS溶液稀释)，每孔100μL，置于37℃，孵育1小时，弃去溶液，使用PBS-T溶液洗涤3遍，于吸水纸上拍干。加入SangonTM HRP偶联链霉亲和素(1∶2000，含有0.5％BSA的PBS溶液稀释)，每孔100μL，置于37℃，孵育1小时，弃去溶液，使用PBS-T溶液洗涤3遍，于吸水纸上拍干。每孔加入100μLTMB显色液，置于室温静置反应10分钟，每孔加入50μL终止液。于酶标仪中以450nm波长读取吸光度值，结果见图3。如结果所示，竞争ELISA测定A46抗体抑制ACE2结合RBD蛋白IC50为702.9ng/mL；A70抗体抑制ACE2结合RBD蛋白IC50为515.3ng/mL。
实施例4抗体对SARS-CoV-2假病毒的中和活性测定
4.1假病毒的包装：
使用pCAGGS质粒作为骨架，将经过人源基因密码子优化后的S蛋白序列(参考序列为GenBank：MN908947)以EcoRI-XhoI双酶切位点，连接至质粒，获得pCAGGS-S-Δ19表达载体。突变株假病毒名称如表1所示
将5×106个293T细胞接种于10cm细胞培养皿中，置于5％CO2，37℃，培养过夜，使用PEI进行转染：将5μg pCAGGS-S-Δ19质粒及3μgpsPAVX2质粒以及4μg pLenti-Luc/GFP质粒转染至细胞培养皿中，6小时后更换培养基。转染48小时后，收集培养上清并过滤获得SARS-CoV-2假病毒，分装后置于-80℃冷冻保存。
4.2中和试验：
在96孔细胞培养板中每孔加入50μL梯度稀释的待测抗体(A46抗体和A70抗体)，然后加入50μL SARS-CoV-2假病毒，充分震荡混匀，置于37℃孵育1小时。使用胰酶消化重悬293T-ACE2细胞，调整细胞浓度为3×105个/mL。向抗体-假病毒混合物中加入100μL细胞悬液，震荡混匀。将96孔细胞培养板置于细胞培养箱中，于37℃、5％CO2培养48小时。弃去细胞上清，加入100μL荧光素酶检测底物试剂，充分震荡混匀。于多功能酶标仪中读取发光值。计算中和抑制率，并根据中和抑制率结果，计算抗体对于假病毒的IC50。对于原始株假病毒中和能力如图4所示。如结果所示，A46抗体中和原始株假病毒IC50为0.1108μg/mL，A70抗体中和原始株假病毒IC50为0.0922μg/mL。结果提示，A46和A70抗体对新冠病毒原始株具有较强的中和作用。
进一步利用假病毒中和试验对新冠病毒其它突变株进行中和抗体分析，对于其他突变株假病毒中和能力如表2所示。这些结果提示，A46和A70抗体对新冠病毒Alpha、Beta、Gamma、Lota、Epsilon、Delta、Lambda、kappa、Omicron BA.1、BA.1.1、BA.2、BA.2.12.1和BA.4/5均具有较强的中和能力。
Claims (10)
1.一种抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的抗体，包含重链可变区和轻链可变区，其中：
所述重链可变区包含氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的HCDR1、氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示的HCDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的HCDR3；并且
所述轻链可变区包含氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的LCDR1、氨基酸序列如SEQ IDNO:5所示的LCDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示的LCDR3；
或者
所述重链可变区包含氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示的HCDR1、氨基酸序列如SEQ IDNO:8所示的HCDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示的HCDR3；并且
所述轻链可变区包含氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示的LCDR1、氨基酸序列如SEQ IDNO:11所示的LCDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示的LCDR3。
2.根据权利要求1所述的抗体，其中：
所述重链可变区还包含氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示的HFR1、氨基酸序列如SEQ IDNO:14所示的HFR2、氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示的HFR3和氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示的HFR4；并且
所述轻可变区还包含氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示的LFR1、氨基酸序列如SEQ IDNO:18所示的LFR2、氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示的LFR3和氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示的LFR4；
或者
所述重链可变区还包含氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示的HFR1、氨基酸序列如SEQ IDNO:22所示的HFR2、氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示的HFR3和氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示的HFR4；并且
所述轻可变区还包含氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示的LFR1、氨基酸序列如SEQ IDNO:26所示的LFR2、氨基酸序列如SEQ ID NO:27所示的LFR3和氨基酸序列如SEQ ID NO:28所示的LFR4。
3.根据权利要求1或2所述的抗体，其中：
所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:29，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:30所示；或者
所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:31，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示。
4.根据权利要求1或2所述的抗体，其中，所述抗体为人源化单克隆抗体。
5.一种核酸分子，其包含编码权利要求1-4中任一项所述的抗体的核苷酸序列。
6.根据权利要求5所述的核酸分子，其中，编码所述抗体的核苷酸序列包含：
1)编码所述重链可变区的核苷酸序列，其如SEQ ID NO:33所示；和编码所述轻链可变区的核苷酸序列，其如SEQ ID NO:34所示；或者
2)编码所述重链可变区的核苷酸序列，其如SEQ ID NO:35所示；和编码所述轻链可变区的核苷酸序列，其如SEQ ID NO:36所示。
7.一种载体，其包含权利要求5或6所述的核酸分子。
8.一种细胞，其包含权利要求5或6所述的核酸分子或权利要求7所述的载体。
9.一种药物组合物，其包含权利要求1-4中任一项所述的抗体、权利要求5或6所述的核酸分子、权利要求7所述的载体或权利要求8所述的细胞，以及可药用载体。
10.权利要求1-4中任一项所述的抗体、权利要求5或6所述的核酸分子、权利要求7所述的载体、权利要求8所述的细胞或权利要求9所述的药物组合物在制备治疗新型冠状病毒SARS-CoV-2药物或制备新型冠状病毒SARS-CoV-2检测试剂中的用途。
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