CN113354730B - 一种抗新型冠状病毒的单克隆抗体及其应用 - Google Patents
一种抗新型冠状病毒的单克隆抗体及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及免疫学领域和分子病毒学领域,特别是新型冠状病毒的诊断、预防和治疗领域。具体而言,本发明涉及抗新型冠状病毒的单克隆抗体,以及包含所述抗体的组合物(例如,诊断剂和治疗剂)。此外,本发明还涉及所述抗体的用途。本发明的抗体可用于诊断、预防和/或治疗新型冠状病毒的感染和/或由所述感染引起的疾病(例如,新型冠状病毒肺炎)。
Description
技术领域
本发明涉及免疫学领域和分子病毒学领域,特别是新型冠状病毒的 诊断、预防和治疗领域。具体而言,本发明涉及抗新型冠状病毒的单克隆 抗体,以及包含所述抗体的组合物(例如,诊断剂和治疗剂)。此外,本发 明还涉及所述抗体的用途。本发明的抗体可用于诊断、预防和/或治疗新 型冠状病毒的感染和/或由所述感染引起的疾病(例如,新型冠状病毒肺 炎)。
背景技术
由新型冠状病毒2019-nCoV导致的肺炎已经在全国及世界范围内广 泛传播。截止到2020年3月3日,全国确诊病例为80303例,累计死亡 病例2947例,在中国以外国家(泰国、美国、德国、澳大利亚、伊朗等 54个国家)累计确诊病例9742例,累计死亡171例,对公众的生命和健 康造成重大威胁。目前对于新型冠状病毒的治疗仍未有特效药物。
新型冠状病毒2019-nCoV是导致新型冠状病毒肺炎(COVID-19)的 病原体,是一种单链RNA病毒,它与2002-2003年引发疫情的重症急性 呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)以及2012年引发疫情的中东呼吸综合 征冠状病毒(MERS-CoV)同属冠状病毒科。该病毒表面的刺突蛋白(Spike, S蛋白)在感染宿主的过程中结合宿主细胞受体血管紧张素转换酶2(ACE2)分子,从而启动病毒膜与宿主细胞膜发生融合,导致宿主细胞感 染病毒。S蛋白分为S1和S2两部分,已有研究证实S1的C端(CTD)的 受体结合结构域(RBD)与ACE2结合,介导膜融合过程。
迄今为止,中和抗体已被证明是治疗病毒性疾病的有效方法。目前 已经上市的治疗和预防病毒感染的药物有预防小儿呼吸道合胞病毒(RSV) 感染的帕利珠单抗(Synagis),治疗HIV感染的艾巴利珠单抗(Trogarzo), 以及用于狂犬病毒暴露后预防的Rabishield。此外,还有多种针对不同 病毒的单抗处于临床研究的不同阶段(https://clinicaltrials.gov/)。 抗体主要通过两方面起作用。一方面,具有中和活性的抗体可通过结合 病毒囊膜蛋白,阻断病毒与细胞受体的结合,从而阻断病毒感染。另一方 面,抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)和补体依赖的细胞毒性 作用(CDC)可募集巨噬细胞或是补体等免疫细胞和免疫分子,从而清除 游离的病毒以及被感染的细胞。
因此,需要开发能够抗新型冠状病毒2019-nCoV的中和抗体,以提 供有效预防和治疗新型冠状病毒感染的手段。
发明内容
在本发明中,除非另有说明,否则本文中使用的科学和技术名词具 有本领域技术人员所通常理解的含义。并且,本文中所用的细胞培养、分 子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用 的常规步骤。同时,为了更好地理解本发明,下面提供相关术语的定义和 解释。
如本文中所使用的,术语“抗体”是指,通常由两对多肽链(每对具 有一条“轻”(L)链和一条“重”(H)链)组成的免疫球蛋白分子。抗体轻 链可分类为κ和λ轻链。重链可分类为μ、δ、γ、α或ε,并且分别将 抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内,可 变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“J”区连接,重链还包含 大约3个或更多个氨基酸的“D”区。各重链由重链可变区(VH)和重链恒 定区(CH)组成。重链恒定区由3个结构域(CH1、CH2和CH3)组成。各轻 链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。轻链恒定区由一个结构域 CL组成。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子,包括免疫 系统的各种细胞(例如,效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)的结 合。VH和VL区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(CDR)), 其间散布有较保守的称为构架区(FR)的区域。各VH和VL由按下列顺序:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4从氨基末端至羧基末端排列的 3个CDR和4个FR组成。各重链/轻链对的可变区(VH和VL)分别形成抗 体结合部位。氨基酸至各区域或结构域的分配遵循Kabat Sequences of Proteins ofImmunological Interest(National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1987 and1991)),或Chothia&Lesk(1987) J.Mol.Biol.196:901-917;Chothia等人(1989)Nature342:878- 883的定义。术语“抗体”不受任何特定的产生抗体的方法限制。例如, 其包括,重组抗体、单克隆抗体和多克隆抗体。抗体可以是不同同种型的 抗体,例如,IgG(例如,IgG1,IgG2,IgG3或IgG4亚型),IgA1,IgA2, IgD,IgE或IgM抗体。
如本文中所使用的,术语抗体的“抗原结合片段”是指包含全长抗体 的片段的多肽,其保持特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力, 和/或与全长抗体竞争对抗原的特异性结合,其也被称为“抗原结合部分”。 通常参见,Fundamental Immunology,Ch.7(Paul,W.,ed.,第2版, Raven Press,N.Y.(1989),其以其全文通过引用合并入本文,用于所 有目的。可通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学断裂产生抗 体的抗原结合片段。在一些情况下,抗原结合片段包括Fab、Fab'、F(ab')2、 Fd、Fv、dAb和互补决定区(CDR)片段、单链抗体(例如,scFv)、嵌合抗 体、双抗体(diabody)和这样的多肽,其包含足以赋予多肽特异性抗原结 合能力的抗体的至少一部分。
在一些情况下,抗体的抗原结合片段是单链抗体(例如,scFv),其 中VL和VH结构域通过使其能够产生为单个多肽链的连接体配对形成单 价分子(参见,例如,Bird等人,Science 242:423 426(1988)和Huston 等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879 5883(1988))。此类scFv 分子可具有一般结构:NH2-VL-接头-VH-COOH或NH2-VH-接头-VL-COOH。合适的现有技术接头由重复的GGGGS氨基酸序列或其变体组成。例如, 可使用具有氨基酸序列(GGGGS)4的接头,但也可使用其变体(Holliger 等人(1993),Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448)。可用于本 发明的其他接头由Alfthan等人(1995),Protein Eng.8:725-731,Choi 等人(2001),Eur.J.Immunol.31:94-106,Hu等人(1996),Cancer Res.56:3055-3061,Kipriyanov等人(1999),J.Mol.Biol.293:41- 56和Roovers等人(2001),Cancer Immunol.描述。
在一些情况下,抗体的抗原结合片段是双抗体,即,双价抗体,其中 VH和VL结构域在单个多肽链上表达,但使用太短的连接体以致不允许 在相同链的两个结构域之间配对,从而迫使结构域与另一条链的互补结 构域配对并且产生两个抗原结合部位(参见,例如,Holliger P.等人, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444 6448(1993),和Poljak R.J. 等人,Structure 2:1121 1123(1994))。
可使用本领域技术人员已知的常规技术(例如,重组DNA技术或酶促 或化学断裂法)从给定的抗体(例如本发明提供的单克隆抗体B38)获得抗 体的抗原结合片段(例如,上述抗体片段),并且以与用于完整抗体的方 式相同的方式就特异性筛选抗体的抗原结合片段。
在本文中,除非上下文明确指出,否则当提及术语“抗体”时,其不 仅包括完整抗体,而且包括抗体的抗原结合片段。
如本文中所使用的,术语“单克隆抗体”是指,来自一群高度同源的 抗体分子中的一个抗体或抗体的一个片段,也即,除可能自发出现的自 然突变外,一群完全相同的抗体分子。单抗对抗原上的单一表位具有高 特异性。多克隆抗体是相对于单克隆抗体而言的,其通常包含至少2种 或更多种的不同抗体,这些不同的抗体通常识别抗原上的不同表位。单 克隆抗体通常可采用Kohler等首次报道的杂交瘤技术获得(Nature, 256:495,1975),但也可采用重组DNA技术获得(如参见Journal of virological methods,2009,158(1-2):171-179)。
如本文中所使用的,“中和抗体”是指,能清除或显著降低目标病毒 的毒力(例如,感染细胞的能力)的抗体或抗体片段。
如本文中所使用的,术语“大肠杆菌表达系统”是指由大肠杆菌(菌 株)与载体组成的表达系统,其中大肠杆菌(菌株)来源于市场上可得到的 菌株,例如但不限于:GI698,ER2566,BL21(DE3),B834(DE3),BLR(DE3)。
如本文中所使用的,术语“载体(vector)”是指,可将多聚核苷酸插 入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获 得表达时,载体称为表达载体。载体可以通过转化,转导或者转染导入宿 主细胞,使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领 域技术人员公知的,包括但不限于:质粒;噬菌粒;人工染色体,例如酵 母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体 (PAC);噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动 物病毒包括但不限于,逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病 毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头 多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件,包括 但不限于,启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基 因。另外,载体还可含有复制起始位点。
如本文中所使用的,术语“宿主细胞”是指,可用于导入载体的细 胞,其包括但不限于,如大肠杆菌或枯草芽孢杆菌等的原核细胞,如酵母 细胞或曲霉菌等的真菌细胞,如S2果蝇细胞或Sf9等的昆虫细胞,或者 如纤维原细胞,CHO细胞,COS细胞,NSO细胞,HeLa细胞,BHK细胞, HEK293细胞或人细胞等的动物细胞。
如本文中使用的,术语“特异性结合”是指,两分子间的非随机的结 合反应,如抗体和其所针对的抗原之间的反应。在某些实施方式中,特异 性结合某抗原的抗体(或对某抗原具有特异性的抗体)是指,抗体以小于 大约10-5M,例如小于大约10-6M、10-7M、10-8M、10-9M或10-10M或更 小的亲和力(KD)结合该抗原。
如本文中所使用的,术语“KD”是指特定抗体-抗原相互作用的解离 平衡常数,其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。平衡解离常数越 小,抗体-抗原结合越紧密,抗体与抗原之间的亲和力越高。通常,抗体 (例如,本发明的单克隆抗体B38)以小于大约10-5M,例如小于大约10-6 M、10-7M、10-8M、10-9M或10-10M或更小的解离平衡常数(KD)结合抗原 (例如,新型冠状病毒S蛋白的RBD),例如,如使用表面等离子体共振术 (SPR)在BIACORE仪中测定的。
在本发明中,氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表 示。例如,丙氨酸可用A或Ala表示。
如本文中所使用的,术语“中和活性”是指抗体或抗体片段具有与病 毒上的抗原蛋白相结合,从而阻止病毒感染细胞和/或病毒子代的成熟和 /或病毒子代的释放的功能活性,具有中和活性的抗体或抗体片段可以阻 止病毒的扩增,从而抑制或消除病毒的感染。
如本文中所使用的,术语“新型冠状病毒”和“2019-nCoV”是指, 2019年底发现的一类冠状病毒,二者具有相同的含义,可互换使用。
如本文中所使用的,术语“新型冠状病毒肺炎”和“COVID-19”是指, 因新型冠状病毒感染而导致的肺炎,二者具有相同的含义,可互换使用。
本申请发明人经过大量的实验研究后发现了一种抗体,其能够特异 性识别和靶向新型冠状病毒的S蛋白,特别是S蛋白的受体结合结构域 (RBD),并且能够阻断S蛋白的RBD与细胞受体血管紧张素转换酶2 (ACE2)的结合,显示出了高效的中和病毒的能力。因此,本发明的抗体 特别适合用于诊断、预防和治疗新型冠状病毒感染或与新型冠状病毒感染相关的疾病(例如新型冠状病毒肺炎)。
在本申请的第一个方面,提供了一种单克隆抗体或其抗原结合片段, 其包含,氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1-3所示的重链可变区(VH)互补 决定区1-3(CDR1-3);和/或,氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4-6所示 的轻链可变区(VL)互补决定区1-3(CDR1-3)。
在某些优选的实施方案中,所述的单克隆抗体包括如SEQ ID NO:7 所示的重链可变区(VH)。
在某些优选的实施方案中,所述的单克隆抗体包括如SEQ ID NO:8 所示的轻链可变区(VL)。
在某些优选的实施方案中,所述的单克隆抗体包含:氨基酸序列分 别如SEQ IDNO:1-3所示的VH CDR1-3,和氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4-6所示的VL CDR1-3。
在某些优选的实施方案中,所述的单克隆抗体包括:如SEQ ID NO:7 所示的VH和如SEQ ID NO:8所示的VL。
在某些优选的实施方案中,所述单克隆抗体在重链可变区的N端还 具有前导序列。在某些优选的实施方案中,所述前导序列具有如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。
在某些优选的实施方案中,所述单克隆抗体在轻链可变区的N端还 具有前导序列。在某些优选的实施方案中,所述前导序列具有如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。
在某些优选的实施方案中,所述单克隆抗体或其抗原结合片段选自 Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、dAb、互补决定区片段、单链抗体(例如, scFv)、人抗体、嵌合抗体或双特异或多特异抗体。
在某些优选的实施方案中,所述的单克隆抗体还包括重链恒定区。 在某些优选的实施方案中,所述重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO: 9所示。
在某些优选的实施方案中,所述的单克隆抗体还包括轻链恒定区。 在某些优选的实施方案中,轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO:10 所示。
在某些优选的实施方案中,所述的单克隆抗体的轻链为κ型。
在某些优选的实施方案中,所述单克隆抗体或其抗原结合片段能够 特异性结合新型冠状病毒的刺突蛋白(S蛋白)。在某些优选的实施方案 中,所述单克隆抗体或其抗原结合片段能够靶向新型冠状病毒的刺突蛋 白(S蛋白)的受体结合域(RBD)。在某些优选的实施方案中,所述单克 隆抗体或其抗原结合片段能够抑制S蛋白的受体结合域(RBD)介导的受 体结合和/或膜融合过程,抑制病毒对细胞的感染。
在某些优选的实施方案中,所述单克隆抗体或其抗原结合片段具有 中和能力(例如,能够中和新型冠状病毒)。在某些优选的实施方案中, 所述单克隆抗体或其抗原结合片段能够抑制新型冠状病毒感染或进入宿 主细胞。由此,所述单克隆抗体或其抗原结合片段能够中和新型冠状病 毒,并由此预防和治疗新型冠状病毒的感染。
本申请还提供了分离的核酸分子,其编码本发明的单克隆抗体或其 抗原结合片段。此类核酸分子不受限于其产生的方法,并且可以利用基 因工程重组技术或化学合成方法获得。
因此,在另一个方面,本发明提供了分离的核酸分子,其包含能够编 码抗体重链可变区的核苷酸序列,其中所述抗体重链可变区包含:氨基 酸序列为SEQ ID NO:1-3的VHCDR1-3。
在某些优选的实施方案中,所述抗体重链可变区具有如SEQ ID NO: 7所示的氨基酸序列。
在某些优选的实施方案中,所述核酸分子具有如SEQ ID NO:12所 示的核苷酸序列。
在另一个方面,本发明提供了分离的核酸分子,其包含能够编码抗 体轻链可变区的核苷酸序列,其中所述抗体轻链可变区包含:氨基酸序 列为SEQ ID NO:4-6的VL CDR1-3。
在某些优选的实施方案中,所述抗体轻链可变区具有如SEQ ID NO: 8所示的氨基酸序列。
在某些优选的实施方案中,所述核酸分子具有如SEQ ID NO:13所 示的核苷酸序列。
在另一个方面,本发明提供了分离的核酸分子,其包含如上文所定 义的能够编码抗体重链可变区的核苷酸序列,以及如上文所定义的能够 编码抗体轻链可变区的核苷酸序列。
在某些优选的实施方案中,所述抗体重链可变区具有如SEQ ID NO:7 所示的氨基酸序列。在某些优选的实施方案中,所述能够编码抗体重链 可变区的核苷酸序列具有如SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列。
在某些优选的实施方案中,所述核酸分子还包含编码前导序列的核 苷酸序列,其位于所述能够编码抗体重链可变区的核苷酸序列的5’端。 在某些优选的实施方案中,所述前导序列具有如SEQ ID NO:11所示的 氨基酸序列。在某些优选的实施方案中,所述编码前导序列的核苷酸序 列具有如SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列。
在某些优选的实施方案中,所述抗体轻链可变区包括如SEQ ID NO:8 所示的氨基酸序列。在某些优选的实施方案中,所述能够编码抗体轻链 可变区的核苷酸序列具有如SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列。
在某些优选的实施方案中,所述核酸分子还包含编码前导序列的核 苷酸序列,其位于所述能够编码抗体轻链可变区的核苷酸序列的5’端。 在某些优选的实施方案中,所述前导序列具有如SEQ ID NO:11所示的 氨基酸序列。在某些优选的实施方案中,所述编码前导序列的核苷酸序 列具有如SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列。
在某些优选的实施方案中,所述分离的核酸分子包含如SEQ ID NO: 12所示的核苷酸序列和如SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列。
在某些优选的实施方案中,所述分离的核酸分子包含第一多核苷酸, 其包含编码前导序列的核苷酸序列和能够编码抗体重链可变区的核苷酸 序列;以及,第二多核苷酸,其包含编码前导序列的核苷酸序列和能够编 码抗体轻链可变区的核苷酸序列。
在某些优选的实施方案中,所述分离的核酸分子包含第一多核苷酸, 其包含如SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列和如SEQ ID NO:12所示的 核苷酸序列;以及,第二多核苷酸,其包含如SEQ ID NO:16所示的核 苷酸序列和如SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列。
在某些优选的实施方案中,所述分离的核酸分子还包含,能够编码 抗体重链恒定区的核苷酸序列。在某些优选的实施方案中,所述重链恒 定区具有如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。在某些优选的实施方案中, 所述能够编码抗体重链恒定区的核苷酸序列具有如SEQ ID NO:14所示 的核苷酸序列。
在某些优选的实施方案中,所述分离的核酸分子还包含,能够编码 抗体轻链恒定区的核苷酸序列。在某些优选的实施方案中,所述轻链恒 定区具有如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。在某些优选的实施方案 中,所述能够编码抗体轻链恒定区的核苷酸序列具有如SEQ ID NO:15 所示的核苷酸序列。
在某些优选的实施方案中,所述分离的核酸分子包含第一多核苷酸, 其包含编码前导序列的核苷酸序列、能够编码抗体重链可变区的核苷酸 序列和能够编码抗体重链恒定区的核苷酸序列;以及,第二多核苷酸,其 包含编码前导序列的核苷酸序列、能够编码抗体轻链可变区的核苷酸序 列和能够编码抗体轻链恒定区的核苷酸序列。
在某些优选的实施方案中,所述分离的核酸分子包含第一多核苷酸, 其包含如SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:14所示的核苷 酸序列;以及,第二多核苷酸,其包含如SEQ ID NO:16、SEQ ID NO: 13和SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列。
在另一个方面,本发明提供了分离的核酸分子,其编码如上文所定 义的本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段。
在另一个方面,本发明提供了一种载体,其包含如上文所定义的分 离的核酸分子。本发明的载体可以是克隆载体,也可以是表达载体。在某 些优选的实施方案中,本发明的载体是例如质粒,粘粒,噬菌体等等。
在另一个方面,还提供了包含本发明的分离的核酸分子或载体的宿 主细胞。此类宿主细胞包括但不限于,原核细胞例如大肠杆菌细胞,以及 真核细胞例如酵母细胞,昆虫细胞,植物细胞和动物细胞(如哺乳动物细 胞,例如小鼠细胞、人细胞等)。本发明的细胞还可以是细胞系,例如293T 细胞。
在另一个方面,还提供了制备本发明的单克隆抗体或其抗原结合片 段的方法,其包括,在合适的条件下培养本发明的宿主细胞,和从细胞培 养物中回收本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段。
在另一个方面,本发明提供了一种组合物,其包含如上文所描述的 单克隆抗体或其抗原结合片段、分离的核酸分子、载体或宿主细胞。
在另一个方面,本发明提供了一种试剂盒,其包括本发明的单克隆 抗体或其抗原结合片段。在某些优选的实施方案中,本发明的单克隆抗 体或其抗原结合片段还包括可检测的标记。在某些优选的实施方案中, 所述试剂盒还包括第二抗体,其特异性识别本发明的单克隆抗体或其抗 原结合片段。优选地,所述第二抗体还包括可检测的标记。此类可检测的 标记是本领域技术人员熟知的,包括但不限于,放射性同位素,荧光物 质,发光物质,有色物质和酶(例如辣根过氧化物酶)等。
在另一个方面,本发明提供了检测新型冠状病毒或其S蛋白或S蛋 白的RBD在样品中的存在或其水平的方法,其包括,使用本发明的单克 隆抗体或其抗原结合片段。在某些优选的实施方案中,本发明的单克隆 抗体或其抗原结合片段还包括可检测的标记。在另一个优选的实施方案 中,所述方法还包括,使用携带可检测的标记的第二抗体来检测本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段。所述方法可以用于诊断目的(例如,所 述样品是来自患者的样品),或者非诊断目的(例如,所述样品是细胞样 品,而非来自患者的样品)。
在另一个方面,本发明提供了诊断受试者是否感染了新型冠状病毒 的方法,其包括:使用本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段检测新型 冠状病毒或其S蛋白或S蛋白的RBD在来自所述受试者的样品中的存在。 在某些优选的实施方案中,本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段还包 括可检测的标记。在另一个优选的实施方案中,所述方法还包括,使用携 带可检测的标记的第二抗体来检测本发明的单克隆抗体或其抗原结合片 段或者抗独特型抗体。
在另一个方面,提供了本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段或者 抗独特型抗体在制备试剂盒中的用途,所述试剂盒用于检测新型冠状病 毒或其S蛋白或S蛋白的RBD在样品中的存在或其水平,或用于诊断受 试者是否感染了新型冠状病毒。
在某些优选的实施方案中,所述样品包括但不限于来自受试者(例如 哺乳动物,优选人)的排泄物、口腔或鼻腔分泌物、肺泡灌洗液等。
在某些优选的实施方案中,所述单克隆抗体是这样的抗体,其包括: 氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1-3所示的VH CDR1-3,和/或氨基酸序 列分别如SEQ ID NO:4-6所示的VL CDR1-3;优选地,其包括:如SEQ ID NO:7所示的VH和/或如SEQ ID NO:8所示的VL。
使用抗体或其抗原结合片段来检测目标病毒或抗原(例如,新型冠状 病毒或其S蛋白或S蛋白的RBD)在样品中的存在或其水平的一般方法是 本领域技术人员所熟知的。在某些优选的实施方案中,所述检测方法可 以使用酶联免疫吸附(ELISA)、酶免疫检测、化学发光免疫检测、放射免 疫检测、荧光免疫检测、免疫色谱法、竞争法及类似检测方法。
在另一个方面,本发明提供了一种药物组合物,其包含本发明的单 克隆抗体或其抗原结合片段,以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。在 某些优选的实施方案中,所述单克隆抗体包括:氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1-3所示的VH CDR1-3,和/或氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4- 6所示的VL CDR1-3;优选地,所述单克隆抗体包括:如SEQ ID NO:7 所示的VH和/或如SEQ ID NO:8所示的VL。
在另一个方面,本发明提供了用于中和样品中新型冠状病毒的毒力 的方法,其包括,将包含新型冠状病毒的样品与本发明的单克隆抗体或 其抗原结合片段接触。此类方法可以用于治疗目的,或非治疗目的(例如 所述样品是细胞样品,而不是患者或来自患者的样品)。
在另一个方面,提供了本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段用于 制备药物的用途,所述药物用于中和样品中新型冠状病毒的毒力。在另 一个方面,本发明提供了如上文所描述的单克隆抗体或其抗原结合片段, 其用于中和样品中新型冠状病毒的毒力。
在另一个方面,提供了本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段或者 抗独特型抗体在制备药物组合物中的用途,所述药物组合物用于预防或 治疗受试者的新型冠状病毒感染或与新型冠状病毒感染相关的疾病(例 如新型冠状病毒肺炎)。在另一个方面,本发明提供了如上文所描述的单 克隆抗体或其抗原结合片段,其用于预防或治疗受试者的新型冠状病毒 感染或与新型冠状病毒感染相关的疾病(例如新型冠状病毒肺炎)。
在另一个方面,本发明提供了用于预防或治疗受试者的新型冠状病 毒感染或新型冠状病毒感染相关的疾病(例如新型冠状病毒肺炎)的方法, 其包括,给有此需要的受试者施用预防或治疗有效量的本发明的单克隆 抗体或其抗原结合片段,或者本发明的药物组合物。
在某些优选的实施方案中,所述受试者是哺乳动物,例如人。
可通过任何适当的施用途径来将本发明的单克隆抗体或其抗原结合 片段或者本发明的药物组合物施用给受试者。此类施用途径包括但不限 于,口服、口腔、舌下、局部、肠胃外、直肠、叶鞘内、或鼻腔途径。
在某些优选的实施方案中,所述单克隆抗体是这样的抗体,其包括: 氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1-3所示的VH CDR1-3,和/或氨基酸序 列分别如SEQ ID NO:4-6所示的VL CDR1-3;优选地,其包括:如SEQ ID NO:7所示的VH和/或如SEQ ID NO:8所示的VL。
本发明所提供的药物和药物组合物可以单独使用或联合使用,也可 以与其他药学活性剂(例如抗病毒药物,如法匹拉韦、瑞德西韦和干扰素 等)联合使用。在某些优选的实施方案中,所述药物组合物还含药学上可 接受的载体和/或赋形剂。
序列信息
本申请所涉及的部分序列的信息如下面的表1所示。
表1.部分序列的信息
有益效果
本申请的单克隆抗体(例如B38抗体)能够以高亲和力与新型冠状 病毒S蛋白RBD结合,并且对新型冠状病毒具有很强的中和活性。例如, 本发明B38抗体对RBD的亲和力为70.1nM,对新型冠状病毒的中和滴度 (半抑制浓度,IC50)为0.177μg/mL。因此,本申请的单克隆抗体(例 如B38抗体)具有预防和治疗新型冠状病毒感染的临床应用价值。
附图说明
图1显示了新型冠状病毒S蛋白RBD的分子筛层析结果与SDS-PAGE 检测结果。
图2显示了重组表达的B38抗体的分子筛层析结果与SDS-PAGE检测 结果,其中,凝胶图上的“-”表示没有添加DTT(非还原性SDS-PAGE); “+”表示添加了DTT(还原性SDS-PAGE)。
图3显示了B38抗体结合RBD蛋白的动力学曲线结果。
图4显示了实施例6中用BD FACSCanto检测的细胞表面荧光情况。
图5显示了不同浓度的B38抗体抗2019-nCoV活病毒的中和活性。
具体实施方式
现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述 本发明。
除非特别指明,本发明中所使用的分子生物学实验方法和免疫检测 法,基本上参照J.Sambrook等人,分子克隆:实验室手册,第2版, 冷泉港实验室出版社,1989,以及F.M.Ausubel等人,精编分子生物 学实验指南,第3版,John Wiley&Sons,Inc.,1995中所述的方法 进行;限制性内切酶的使用依照产品制造商推荐的条件。实施例中未注 明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪 器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品。本领域技术 人员知晓,实施例以举例方式描述本发明,且不意欲限制本发明所要求 保护的范围。
为了获得具有保护效果的中和抗体,本申请发明人首先以大肠杆菌 表达的2019-nCoV的S蛋白RBD作为抗原,通过流式分选术,从感染了 2019-nCoV且痊愈出院的人员的外周血单核细胞(PBMCs)中筛选到能够 特异性结合S蛋白RBD的记忆B细胞,然后,对筛选获得的单一B细胞 进行RT-PCR,获得编码抗体可变区的序列。进一步,将编码抗体可变区 的序列与恒定区基因连接至表达载体中,并在哺乳动物细胞中进行表达 和纯化,从而获得抗体B38。对抗体B38进行一系列的功能检测,结果显 示,抗体B38能够特异性结合S蛋白RBD,阻断S蛋白RBD与ACE2的结 合,抑制2019-nCoV对人细胞的感染,具有抗2019-nCoV感染的中和活 性。
实施例1:2019-nCoV病毒S蛋白RBD的表达与纯化
使用NdeI和XhoI酶,将编码2019-nCoV/2019毒株刺突蛋白S蛋白 RBD(其氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示)的DNA片段连接到pET21a 载体上,所述DNA片段在编码区的3'端还连接有编码6*组氨酸标签 (6*His标签)的核苷酸序列及终止密码子。将连接产物转化到BL21大肠 杆菌感受态细胞中。然后,挑取单克隆,接种到40mL LB培养基中,培 养6-8小时;然后再转接种到4L的LB培养基中,并在37摄氏度培养至 OD600=0.4-0.6。随后,向培养物中加入IPTG至终浓度1mM,并在37摄 氏度继续培养4-6小时。培养结束后,收获包涵体,并进行复性。将复 性后的蛋白溶液浓缩,并透析至20mM Tris,150mM NaCl,pH9.0缓冲 液中。随后,通过分子筛层析法纯化溶液中的蛋白,其中,使用AKTA- purifier(GE)和superdex200Hiload 16/60柱子(GE)以及缓冲液A(20 mM Tris,150mM NaCl,pH9.0),并且在纯化过程中,同时监测280nm 处的紫外吸收值,收取含有目的蛋白的级分。纯化结束后,通过SDS-PAGE 鉴定目的蛋白(S蛋白的RBD)的纯度。结果如图1所示。图1的结果显 示,获得了高纯度的RBD蛋白,其大小为32kDa。
实施例2:特异性识别RBD蛋白的记忆B细胞的分离
在感染2019-nCoV病毒且痊愈出院的人员的知情同意下,采集10mL 的血液,分离PBMCs。将分离的PBMCs以107/mL的密度与终浓度为400nM 的RBD蛋白(如实施例1制备的)在冰上孵育结合半小时;然后用PBS 洗2次,再与下列抗体(均购自BD)孵育:anti-human CD3/PE-Cy5, anti-human CD16/PE-Cy5,anti-human CD235a/PE-Cy5,anti-human CD19/APC-Cy7,anti-human CD27/Pacific Blue,anti-human CD38/APC,anti-human IgG/FITC,以及anti-His/PE。在冰上孵育半小时后,用PBS 洗PBMCs 2次。随后,用FACSAria III分选PBMCs,收集PE-Cy5- APC- APC-Cy7+ Pacific Blue+ FITC+ PE+的细胞(即B细胞),直接将其收集到 96孔板内,1细胞/孔。
实施例3:B38抗体的分离和鉴定以及重组表达载体的构建
使用Superscript III reverse transcriptase(Invitrogen)对 实施例2获得的B细胞进行逆转录(在55℃,进行60分钟),其中,所 使用的逆转录引物如表2所示。
表2.所使用的逆转录引物的序列信息
以逆转录产物作为模板,用HotStar Tap Plus酶(QIAgen)进行第 一轮PCR(PCRa),扩增抗体可变区的序列;其中,所使用的引物如表3 所示;所使用的反应条件如下:95℃,5min;35个循环的(95℃30s, 55℃(重链/κ链)30s,72℃90s);72℃,7min。随后,以该扩增产物 作为模板再进行第二轮PCR(PCRb);其中,所使用的引物如表4所示; 所使用的反应条件如下:95℃,5min;35个循环的(95℃30s,58℃(重 链)/60℃(κ链)/64℃(λ链)30s,72℃90s);72℃,7min。
通过1%的琼脂糖凝胶电泳,分离PCR产物。回收条带大小在400- 500bp的PCR产物,并送测序公司测序。测序结果用NCBI在线软件进行 分析。
通过序列测定,获得一株抗体的序列,命名为B38。B38抗体的重链 可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示(编码基因如SEQ ID NO:12 所示),轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示(编码基因如SEQ ID NO:13所示)。B38抗体与胚系基因的序列一致性如下面的表5-6所 示。
表3.第一轮PCR(PCRa)所使用的引物
表4.第二轮PCR(PCRb)所使用的引物
表5.B38抗体重链与胚系基因的比较
将分析得到的编码重链/轻链可变区的核苷酸序列分别与相应的编 码重链/κ链的恒定区的核苷酸序列通过搭桥PCR进行连接,然后分别克 隆至表达载体pCAGGS(购自Addgene)中,从而得到分别编码抗体重链和 轻链的重组表达载体。表达重链和轻链的构建体的构建方案如下:
重链编码序列(5’-3’):CMV启动子-EcoR I酶切位点-前导序列基因 -VH基因-CH基因-Xho I酶切位点;
轻链(κ)编码序列(5’-3’):CMV启动子-Sac I酶切位点-前导序 列基因-VL基因-CL(κ)基因-Xho I酶切位点;
其中,前导序列的氨基酸序列如SED ID NO:11所示(编码基因如 SEQ ID NO:16所示),CH的氨基酸序列如SED ID NO:9所示(编码基 因如SEQ ID NO:14所示),CL的氨基酸序列如SED ID NO:10所示(编 码基因如SEQ ID NO:15所示)。
实施例4:B38抗体的表达
在含10%FBS的DMEM中培养293T细胞。用实施例3得到的分别编 码抗体重链和轻链的重组表达载体共转染293T细胞。转染4-6小时后, 将细胞培养液更换成无血清的DMEM,并且继续培养3天。收集上清,然 后补加DMEM,继续培养4天,然后再次收集上清。
将收集的上清以5000rpm离心30min,然后与含有20mM磷酸钠(pH 7.0)的缓冲液等体积混合,随后用0.22μm滤膜进行过滤,然后装载至 与protein A预装柱(5mL,GEHealthcare)。以10mM甘氨酸(pH 3.0) 洗脱结合至预装柱的蛋白。将洗脱级分浓缩,然后通过分子筛层析法进 行纯化。随后,通过SDS-PAGE(还原性和非还原性)检测所纯化的目的蛋白。结果如图2所示。图2的结果显示,获得了经纯化的B38抗体。
实施例5:B38抗体与S蛋白RBD的结合能力的评估
在本实施例中,利用Biacore 8K(Biacore Inc.)进行表面等离子 共振分析。具体步骤如下:
首先,将anti-human IgG的抗体以氨基偶联的方式固定在CM5芯片 的通道(flowcell,Fc)。固定量控制在8,000响应值(response units, RU)左右。然后,以抗体捕获的方式,结合纯化的B38抗体。另外,以 20mM HEPES,150mM NaCl,pH 7.4溶液连续倍比稀释RBD蛋白。然后, 将连续稀释的RBD蛋白依次通过各通道(从低浓度开始逐一上样)。记录 B38抗体结合RBD蛋白的动力学曲线(图3),并利用BIAevaluation software 8K(Biacore,Inc.)软件计算动力学常数(如表4所示)。图 3和表4的结果显示,B38抗体能够以较高的亲和力结合2019-nCoV的S 蛋白的RBD。
表4.抗体与RBD蛋白的结合动力学常数
ka(1/Ms) | kd(1/s) | KD(M) | |
B38 | 3.73E+04 | 3.25E-02 | 7.01E-08 |
实施例6:B38阻断RBD与ACE2结合的能力的评估
利用XhoI和BamHI,将编码hACE2蛋白的基因(Genbank登录号: NP_068576.1)克隆入pEGFP-N1载体(购自Addgene)中,且所述基因能够 与编码GFP的基因融合表达,从而构建获得质粒pEGFP-hACE2。将质粒 pEGFP-hACE2转染入HEK293T细胞。24h后,可在荧光显微镜下观察到 GFP的表达。收集HEK293T-hACE2细胞。将无关抗体按10:1的摩尔比与200ng/mL的RBD蛋白在室温下孵育1h。然后,将HEK293T-hACE2细胞 (2x105/反应)与同无关抗体孵育后的RBD蛋白(200ng/ml,携带6*His 标签)在室温条件下孵育30min。500xg离心5min后,去掉上清,细胞 用PBS洗2次。随后,将细胞与anti-His/APC(美天旎,130-119-820) 在室温下孵育30min,然后用PBS洗2次,然后用BD FACSCanto检测细 胞表面的荧光情况。
为了检测B38抗体的阻断效果,将实施例4纯化的B38抗体按10:1 的摩尔比与200ng/mL的RBD蛋白在室温下孵育1h,再与HEK293T-hACE2 细胞孵育。然后,如上所述,用anti-His/APC检测RBD蛋白与细胞的结 合情况。结果如图4所示。图4显示了用BDFACSCanto检测的细胞表面 荧光情况。结果显示,右侧图框中hACE2阳性且RBD阳性的细胞(即, 携带双荧光的细胞)的数目显著少于左侧图框;这表明,B38抗体能有效 阻断2019-nCoV的S蛋白RBD与HEK293T-hACE2细胞的结合。
实施例7:B38抗体中和2019-nCoV活病毒的能力的评估
将实施例4纯化的B38抗体从200μg/mL开始倍比稀释至第12个梯 度(0.098μg/mL),然后分别与半数组织培养感染剂量(TCID50)的 BetaCoV/Shenzhen/SZTH-003/2020病毒(获自深圳市第三人民医院, GISAID号:EPI_ISL_406594)在37摄氏度混合孵育2小时。孵育后,将 病毒加入到预先接种了Vero细胞的96孔板中,并于37摄氏度,5%CO2培养箱中培养4天,观察致细胞病变效应(CPE),并计算B38抗体的中 和滴度。结果如图5所示。图5显示了不同浓度的B38抗体抗2019-nCoV 活病毒的中和活性。结果显示,B38抗体对2019-nCoV活病毒的中和滴度 (半抑制浓度,IC50)为0.177μg/mL,具有优良的中和活性。
Claims (40)
1.一种单克隆抗体或其抗原结合片段,所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含,氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1-3所示的重链可变区(VH)互补决定区1-3(CDR1-3);和氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4-6所示的轻链可变区(VL)互补决定区1-3(CDR1-3)。
2.权利要求1的单克隆抗体或其抗原结合片段,其中,所述的单克隆抗体包括,如SEQID NO:7所示的重链可变区(VH),和/或,如SEQ ID NO:8所示的轻链可变区(VL)。
3.权利要求1或2的单克隆抗体或其抗原结合片段,其中,所述单克隆抗体在重链可变区的N端还具有前导序列,和/或,所述单克隆抗体在轻链可变区的N端还具有前导序列。
4.权利要求3的单克隆抗体或其抗原结合片段,其中,所述前导序列的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示。
5.权利要求1的单克隆抗体或其抗原结合片段,其中,所述单克隆抗体或其抗原结合片段选自Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、dAb、单链抗体、人抗体、嵌合抗体或多特异抗体。
6.权利要求5的单克隆抗体或其抗原结合片段,其中,所述多特异抗体为双特异抗体。
7.权利要求5的单克隆抗体或其抗原结合片段,其中,所述单链抗体为scFv。
8.权利要求1或2的单克隆抗体或其抗原结合片段,其中,所述单克隆抗体还包括重链恒定区。
9.权利要求8的单克隆抗体或其抗原结合片段,其中,所述重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示。
10.权利要求1或2的单克隆抗体或其抗原结合片段,其中,所述单克隆抗体还包括轻链恒定区。
11.权利要求10的单克隆抗体或其抗原结合片段,其中,所述轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。
12.分离的核酸分子,其编码权利要求1-11任一项的单克隆抗体或其抗原结合片段。
13.一种载体,其包含权利要求12的分离的核酸分子。
14.一种宿主细胞,其包含权利要求12的分离的核酸分子或权利要求13的载体。
15.制备权利要求1-11任一项的单克隆抗体或其抗原结合片段的方法,其包括,在合适的条件下培养权利要求14的宿主细胞,和从细胞培养物中回收所述单克隆抗体或其抗原结合片段。
16.一种组合物,其包含权利要求1-11任一项的单克隆抗体或其抗原结合片段,权利要求12的分离的核酸分子,权利要求13的载体,或权利要求14的宿主细胞。
17.试剂盒,其包括权利要求1-11任一项的单克隆抗体或其抗原结合片段。
18.权利要求17的试剂盒,其中,所述单克隆抗体或其抗原结合片段还包括可检测的标记。
19.权利要求17的试剂盒,其中,所述试剂盒还包括第二抗体,其特异性识别所述单克隆抗体或其抗原结合片段;所述第二抗体包括或不包括可检测的标记。
20.权利要求18或19的试剂盒,其中,所述可检测的标记选自放射性同位素,发光物质,有色物质和酶。
21.权利要求18或19的试剂盒,其中,所述可检测的标记为荧光物质。
22.用于非诊断目的的检测新型冠状病毒或其S蛋白或S蛋白的RBD在样品中的存在或其水平的方法,其包括使用权利要求1-11任一项的单克隆抗体或其抗原结合片段。
23.权利要求22的方法,其中,所述单克隆抗体或其抗原结合片段还包括可检测的标记。
24.权利要求22的方法,其中,所述方法还包括,使用携带可检测的标记的第二抗体来检测所述单克隆抗体或其抗原结合片段。
25.权利要求23或24的方法,其中,所述可检测的标记选自放射性同位素,发光物质,有色物质和酶。
26.权利要求23或24的方法,其中,所述可检测的标记为荧光物质。
27.权利要求1-11任一项的单克隆抗体或其抗原结合片段在制备试剂盒中的用途,所述试剂盒用于检测新型冠状病毒或其S蛋白或S蛋白的RBD在样品中的存在或其水平,或用于诊断受试者是否感染了新型冠状病毒。
28.权利要求27的用途,其中,所述样品为来自受试者的排泄物、口腔或鼻腔分泌物、或肺泡灌洗液。
29.权利要求28的用途,其中,所述受试者为哺乳动物。
30.权利要求28的用途,其中,所述受试者为人。
31.一种药物组合物,其包含权利要求1-11任一项的单克隆抗体或其抗原结合片段,以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。
32.权利要求31的药物组合物,其中,所述药物组合物还包含其他药学活性剂。
33.权利要求32的药物组合物,其中,所述药学活性剂选自法匹拉韦,瑞德西韦或干扰素。
34.用于非治疗目的的中和样品中的新型冠状病毒的毒力的方法,其包括,将包含新型冠状病毒的样品与权利要求1-11任一项的单克隆抗体或其抗原结合片段接触。
35.权利要求1-11任一项的单克隆抗体或其抗原结合片段用于制备药物的用途,所述药物用于中和样品中新型冠状病毒的毒力,或用于预防或治疗受试者的新型冠状病毒感染或与新型冠状病毒感染相关的疾病。
36.权利要求35的用途,其中,所述与新型冠状病毒感染相关的疾病为新型冠状病毒肺炎。
37.权利要求35的用途,其中,所述受试者是哺乳动物。
38.权利要求35的用途,其中,所述受试者是人。
39.权利要求35的用途,其中,所述药物单独使用,或与其他药学活性剂联合使用。
40.权利要求39的用途,其中,所述药学活性剂选自法匹拉韦,瑞德西韦或干扰素。
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