CN116802496A - 一种可结合SARS-CoV-2病毒的中和抗体及其应用 - Google Patents
一种可结合SARS-CoV-2病毒的中和抗体及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本申请涉及抗体技术领域，具体涉及一种可结合SARS‑CoV‑2病毒的中和抗体及其应用。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求于2021年12月14日提交中国专利局的申请号为202111529152.7、名称为“一种可结合SARS-CoV-2病毒的中和抗体及其应用”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。
本申请涉及生物技术领域中的抗体技术领域及免疫领域，具体涉及一种可结合SARS-CoV-2病毒的中和抗体或其抗原结合片段及其应用。
新型冠状病毒是2019年发现的一种病毒，被WHO命名为严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型(SARS-CoV-2)，可导致人类病毒性肺炎或肺部感染，截至目前该病毒已经在全球引起确诊感染新数量2.4亿左右，导致病逝人数约480万。感染新型冠状病毒后通常表现出发热、乏力、干咳等肺炎症状，少数患者伴有鼻塞、流涕、腹泻等上呼吸道和消化道症状。重症病例多在1周后出现呼吸困难，严重者快速进展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒和出凝血功能障碍。目前虽然已报道一些治疗药物，但仍需更多的临床实践证明效果，相关疫苗的研发也在开展中，但距离临床应用尚需时间。
新型冠状病毒为β属的新型冠状病毒，有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，常为多形性，直径为60-140nm。新型冠状病毒与严重急性呼吸综合征病毒(SARS-CoV)同源性达到70％，序列差异主要体现在与宿主细胞作用的关键spike基因(编码S-蛋白)，因此针对S-蛋白的抗体(尤其是中和活性抗体)开发是该疾病预防或治疗的关键。
有鉴于此，提出本申请。
发明概述
针对上述技术问题，本申请通过锐意研究开发一些列可结合SARS-CoV-2病毒的中和抗体或其抗原结合片段，进而实现本申请的如下目的。
本申请第一目的是提供一种抗SARS-CoV-2 S蛋白的抗体或其抗原结合片段；
本申请第二目的是提供一种编码上述抗体或其抗原结合片段的多核苷酸、相应重组载体、宿主细胞，或包含其的试剂盒或药物组合物等；
本申请第三目的是提供一种上述抗体或抗原结合片段在预防或治疗新冠肺炎中的应用；
本申请第四目的是提供一种上述抗体或抗原结合片段在检测/筛选/纯化/制备中和抗体中的应用。
本申请第五目的是提供一种制备可结合SARS-CoV-2病毒的中和抗体或其抗原结合片段的方法；
本申请第六目的是提供一种预防或治疗新型冠状病毒肺炎的方法。
为了实现上述目的，本申请采用以下技术方案。
本申请的第一方面提供了包含重链可变区和轻链可变区的抗体或其抗原结合片段，包含SEQ ID NO.30，SEQ ID NO.46任一所示的重链可变区氨基酸序列中的3个CDR和SEQ ID NO.32，SEQ ID NO.48任一所示的轻链可变区氨基酸序列中的3个CDR；或者与上述轻重链CDR区具有单个或者多个CDR不超过每个CDR区2个氨基酸变化的变体。
进一步的，当按照Kabat编码规则对抗体HCDRs编码时，所述抗体或抗原结合片段包含如下CDR序列：
i.所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.103或127任一所示；
ii.所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.104或128任一所示；
iii.所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.105或129任一所示；
iv.所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.106或130任一所示；
v.所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.107或131任一所示；
vi.所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.108或132任一所示；
或者，与上述i-vi的6个CDR区具有单个或者多个CDR不超过每个CDR区2个氨基酸变化的变体。
进一步的，所述HCDR1/HCDR2/HCDR3的组合可以包含选自以下的一组或多组：
(1)HCDR1/HCDR2/HCDR3:
SEQ ID NO.103/SEQ ID NO.104/SEQ ID NO.105；
或SEQ ID NO.127/SEQ ID NO.128/SEQ ID NO.129；
(2)或者含有一处或多处不超过2个氨基酸的氨基酸取代、缺失或插入的上述(1)的HCDR；
所述LCDR1/LCDR2/LCDR3的组合包含选自以下的一组或多组：
(1)LCDR1/LCDR2/LCDR3为：
SEQ ID NO.106/SEQ ID NO.107/SEQ ID NO.108；
或SEQ ID NO.130/SEQ ID NO.131/SEQ ID NO.132；
(2)或者含有一处或多处不超过2个氨基酸的氨基酸取代、缺失或插入的上述(1)的HCDR。
在一些方式中，所述抗体或其抗原结合片段具体为ACRO3-286L、ACRO3-347K。在一些方式中，本申请的可结合SARS-CoV-2病毒的中和抗体或其抗原结合片段，还包括重链可变区VH序列和轻链可变区VL序列，所述重链可变区VH序列与选自包括以下序列的组中的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的序列一致性：SEQ ID NO.30，SEQ ID NO.46；所述轻链可变区VL序列与选自包括以下序列的组中的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的序列一致性：SEQ ID NO.32，SEQ ID NO.48。
进一步的，所述抗体或抗原结合片段可进一步包含连接至多肽的偶联部分，所述偶联部分选自放射性核素、药物、毒素、细胞因子、酶、荧光素、载体蛋白、脂类、和生物素中的一种或多种，其中所述多肽或抗体与所述偶联部分可选择性通过连接子相连，优选所述连接子为肽或多肽。
进一步的，所述抗体或抗原结合片段可选自单克隆抗体、多克隆抗体、抗血清、嵌合抗体、人源化抗体和人抗体；更优选的，所述抗体选自多特异性抗体、单链Fv(scFv)、单链抗体、抗独特型(抗-Id)抗体、双抗体、微型抗体、纳米抗体、单结构域抗体、Fab片段、F(ab’)片段、二硫化物连接的双特异性Fv(sdFv)和胞内抗体。
本申请第二方面，还提供了编码第一方面抗体分或其抗原结合片段的核酸，优选的，所述核酸序列组合如SEQ ID NO.41和SEQ ID NO.43、SEQ ID NO.89和SEQ ID NO.91。
本申请的第三方面提供了包含第二方面的核酸的载体，以及任选的调控序列；
进一步的，所述重组载体可以是克隆载体或表达载体，不作限制；
进一步的，所述调控序列可以选自前导序列、多聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号序列、转录终止子，或其任何组合，不作限制。
本申请的第四方面提供了包含第二方面的核酸或第三方面的载体的宿主细胞。
进一步的，所述宿主细胞包括但不限于酵母细胞、中国仓鼠卵巢细胞、人胚肾细胞等哺乳动物细胞或适用于制备抗体或其抗原结合片段的其它细胞。
本申请的第五方面提供了一种药物组合物，包含上述任一所述的抗体或抗原结合片段、多核苷酸、重组载体或宿主细胞的一种或更多种；
优选的，所述组合物还包含药学上可接受的载体或辅料。
本申请的第六方面提供了一种试剂盒，其特征在于，包含上述任一所述的抗体或抗原结合片段、多核苷酸、重组载体和宿主细胞中的一种或更多种，并容纳于合适的容器中。
本申请的第七方面提供了制备第一方面的可结合SARS-CoV-2病毒的中和抗体或其抗原结合片段的方法，该方法包括在宿主细胞培养物中表达第三方面的载体以产生所述抗体；和从细胞培养物中回收抗体分子。
本申请的第八方面提供一种包含第一方面的抗体或其抗原结合片段在如下任一方面中的应用：
a)在治疗新冠肺炎中的应用；
b)在制备治疗新冠肺炎药物组合物中的应用；
c)在预防新冠肺炎中的应用
d)在制备新冠肺炎疫苗中的应用；
e)检测/筛选/纯化/制备中和抗体中的应用；
f)在制备中和抗体检测/筛选/纯化试剂盒中的应用。
本申请的第九方面提供了一种药物组合物，包括第一方面所述的抗SARS-CoV-2 S蛋白抗体或其抗原结合片段，和药学上任选的药用载体。
本申请的第十方面提供了一种治疗新型冠状病毒肺炎的方法，通过向需要治疗的个体施用有效量的第一方面的抗体或其抗原结合片段，或第八方面的药物组合物来治疗SARS-CoV-2的方法。
发明详述
本申请公开了一种分离抗体或其抗原结合片段，本领域技术人员可以参考本文内容，实现其应用，特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本申请内。本申请的制备方法及应用已经通过较佳的实施 例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本申请内容、精神和范围内对本文制备方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本申请技术。除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本申请所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。
以下术语或定义仅仅是为了帮助理解本申请而提供。这些定义不应被理解为具有小于本领域技术人员所理解的范围。
除非在下文中另有定义，本申请具体实施方式中所用的所有技术术语和科学术语的含义意图与本领域技术人员通常所理解的相同。虽然相信以下术语对于本领域技术人员很好理解，但仍然阐述以下定义以更好地解释本申请。
如本申请中所使用，术语“包括”、“包含”、“具有”、“含有”或“涉及”为包含性的(inclusive)或开放式的，且不排除其它未列举的元素或方法步骤。术语“由…组成”被认为是术语“包含”的优选实施方案。如果在下文中某一组被定义为包含至少一定数目的实施方案，这也应被理解为揭示了一个优选地仅由这些实施方案组成的组。
在提及单数形式名词时使用的不定冠词或定冠词例如“一个”或“一种”，“所述”，包括该名词的复数形式。
本申请中的术语“大约”、“大体”表示本领域技术人员能够理解的仍可保证论及特征的技术效果的准确度区间。该术语通常表示偏离指示数值的±10％，优选±5％。
术语“或更多”、“至少”、“超过”等，例如“至少一种”应当理解为包括但不限于至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000或超过所述值。还包括其间任何更大的数字或分数。
相反地，术语“不超过”包括小于所述值的每个值。例如，“不超过100个核苷酸”包括100、99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、89、88、87、86、85、84、83、82、81、80、79、78、77、76、75、74、73、72、71、70、69、68、67、66、65、64、63、62、61、60、59、58、57、56、55、54、53、52、51、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1和0个核苷酸。还包括其间任何更小的数字或分数。
术语“多个”、“至少两个”、“两个或更多个”、“至少第二个”等应当理解为包括但不限于至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000或更多。还包括其间任何更大的数字或分数。
术语定义：
如本文中所使用的，术语“抗体”是指能够非共价地、可逆地并以特异性方式结合对应抗原的免疫球蛋白家族的多肽。例如，天然存在的IgG抗体是一种包括通过二硫键互连的至少两个重(H)链和两个轻(L)链的四聚体。每个重链包含重链可变区(在此缩写为VH)和重链恒定区。重链恒定区包含三个结构域CH1、CH2和CH3。每个轻链包含轻链可变区(在此缩写为VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域CL。VH区和VL区可以进一步细分为被称作互补决定区(CDR)的超变区，所述超变区散布有更保守的被称作框架区(FR)的区。每个VH和VL由按照以下顺序从氨基末端到羧基末端布置的三个CDR和四个FR构成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包含免疫系统的不同细胞(例如，效应细胞)以及经典补体系统的第一组分(Clq)。“抗体”包含但不限于单克隆抗体、人抗体、人源化抗体、骆驼科抗体、嵌合抗体和抗独特型(抗Id)抗体(包含例如针对本公开的抗体的抗Id抗体)。抗体可以属于任何同种型/种类(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)或子类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)。
抗体包含称为“结构域”的重链或轻链多肽的球状区域。结构域可包含肽环，通常为3至4个环，其例如通过β折叠和/或链内二硫键得以稳定。基于在“恒定”域的情况下，不同类别成员的结构域内相对缺乏序列变异，或者在“可变”域的情况下，不同类别成员的结构域内的显著变异，结构域通常称为“恒定”或“可变”。抗体或多肽“结构域”在本领域中通常可互换地称为抗体或多肽“区域”。
根据抗体重链恒定区的氨基酸序列进行区分，将抗体可以分为5类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些类别中的几种同种型别可以进一步划分成亚类，如，IgG1、IgG2、IgG3和IgA1以及IgA2。对应于不同种类免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。根据抗体轻链恒定区(CL)的不同可以划分κ和λ。在全长轻链和重链内，通常可变区和恒定区由约12个或更多个氨基酸的“J”区连接，且重链还包括约10个以上氨基酸的“D”区。
术语“单克隆抗体”是指具有单一氨基酸组成的抗体分子的制备物，不涉及其制备的方法。单克隆抗体或其免疫活性片段可以通过杂交瘤技术、重组技术、噬菌体展示技术、合成技术等或其它本领域已知的生产技术来产生，本申请中涉及单克隆抗体制备的方法包括杂交瘤细胞体外培养制备或通过DNA重组技术制备。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原位点。每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。
术语“抗原”是免疫球蛋白或抗体(或其抗原结合片段)特异性结合的实体(例如，蛋白实体或肽)。
术语“片段”是指抗体或抗体链的一部分或部分，其包含的氨基酸残基比完整或完全抗体或抗体链少，其中该部分优选保留当该部分存在于完整抗体中时与该部分正常相关的功能中的至少一个，优选大部分或全部的功能。片段可以通过化学或酶促处理完整或完全抗体或抗体链而获得。片段还可以通过重组方式获得。
术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR)或超变区中的三个片段中。可变区 中较保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，在某些情况下可形成部分β折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位(参见Kabat等，NIH Publ.No.91-3242，卷I，647-669页(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。
“互补决定结构域”或“互补决定区”(“CDR”)可互换地指VL和VH的超变区。CDR是携带此种靶蛋白的特异性的抗体链的靶蛋白结合位点。每个人VL或VH中存在三个CDR(CDR1-3，按顺序从N末端编号)，总计占可变结构域的约15-20％。CRD可以由其区和顺序指代。例如，“VHCDR1”或“HCDR1”两者指代重链可变区的第一CDR。CDR与靶蛋白的表位在结构上互补并且因此直接负责结合特异性。VL或VH的其余延伸段(所谓的框架区)在氨基酸序列中展现出较少变化(Kuby,《免疫学(Immunology)》,第4版,第4章W.H.弗里曼公司(W.H.Freeman&Co.),纽约,2000)。
在一个给定的轻链可变区或重链可变区氨基酸序列中，各CDR的精确氨基酸序列边界可以使用许多公知的抗体CDR指派系统的任一种或其组合确定，所述指派系统包括例如：基于抗体的三维结构和CDR环的拓扑学的Chothia(Chothia等人.(1989)Nature 342:877-883，Al-Lazikani等人,“Standard conformations for the canonical structures of immunoglobulins”,Journal of Molecular Biology,273,927-948(1997))，基于抗体序列可变性的Kabat(Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第4版,U.S.Department of Health and Human Services,National Institutes of Health(1987)),AbM(University of Bath)，Contact(University College London)，国际ImMunoGeneTics database(IMGT)，以及基于利用大量晶体结构的近邻传播聚类(affinity propagation clustering)的North CDR定义。
然而，应该注意，基于不同的指派系统获得的同一抗体的可变区的CDR的边界可能有所差异。即不同指派系统下定义的同一抗体可变区的CDR序列有所不同。例如，对使用Kabat和Chothia编号的CDR区域在不同指派系统定义下的残基范围如下表所示。
不同指派系统定义下的CDR残基范围
因此，在涉及用本申请定义的具体CDR序列限定抗体时，所述抗体的范围还涵盖了这样的抗体，其可变区序列包含所述的具体CDR序列，但是由于应用了不同的方案(例如不同的指派系统规则或组合)而导致其所声称的CDR边界与本申请所定义的具体CDR边界不同。
本申请抗体的CDR可以根据本领域的任何方案或其组合人工地评估确定边界。除非另有说明，否则在本申请中，术语“CDR”或“CDR序列”涵盖以上述任一种方式确定的CDR序列。
抗体可以包括例如，单克隆抗体、重组产生的抗体、单特异性抗体、多特异性抗体(包括双特异性抗体)、人抗体、工程化抗体、人源化抗体、嵌合抗体、免疫球蛋白、合成抗体、包含两个重链和两个轻链分子的四聚体抗体、抗体轻链单体、抗体重链单体、抗体轻链二聚体、抗体重链二聚体、抗体轻链-抗体重链对、胞内抗体、抗体融合物(本文有时称为“抗体缀合物”)、异缀合抗体、单结构域抗体、单价抗体、单链抗体或单链Fv(scFv)、骆驼源化抗体、亲和体、Fab片段、F(ab’)2片段、二硫键连接的Fv(sdFv)、抗独特型(抗Id)抗体(包括例如，抗-抗Id抗体)、微抗体、结构域抗体、合成抗体(本文有时称为“抗体模拟物”)和以上任何的抗原结合片段。
术语“抗原结合片段”是指保留与抗原的表位特异性地相互作用(例如，通过结合、位阻、稳定化/去稳定化、空间分布)的能力的抗体的一个或多个部分。结合片段的实例包含但不限于：单链Fv(scFv)、二硫键连接的Fv(sdFv)、Fab片段、F(ab')片段(即由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段)；F(ab)2片段(即包括在铰链区处由二硫桥连接的两个Fab片段的双价片段)；由VH和CH1结构域组成的Fd片段；由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；由VH结构域组成的dAb片段(Ward等人,《自然》341:544-546,1989)；以及分离的互补决定区(CDR)或抗体的其它表位结合片段。此外，虽然Fv片段的两个结构域VL和VH由单独的基因编码，但是这两个结构域可以使用重组方法通过使这两个结构域能够成为单个蛋白链的合成连接子来连接，在所述单个蛋白链中，VL区和VH区对用于形成单价分子(被称为单链Fv(“scFv”))；参见例如，Bird等人,《科学(Science)》242:423-426,1988；以及Huston等人,《美国国家科学院院刊》85:5879-5883,1988)。此类单链抗体也旨在涵盖于术语“抗原结合片段”内。使用本领域技术人员已知的常规技术获得这些抗原结合片段，并且以与完整抗体相同的方式筛选所述片段的实用性。
抗原结合片段还可以并入到单结构域抗体、大抗体、微抗体、纳米抗体、胞内抗体、双抗体、三抗体、四抗体、v-NAR和双-scFv中(参见例如，Hollinger和Hudson,《自然生物技术(Nature Biotechnology)》23:1126-1136,2005)。抗原结合片段可以基于如纤连蛋白III型(Fn3)等多肽接枝到支架中(参见美国专利第6,703,199号，所述美国专利描述了纤连蛋白多肽单抗)。抗原结合片段可以并入到包括与互补轻链多肽一起形成一对抗原结合区的一对串联Fv区段(VH-CH1-VH-CH1)的单链分子中(Zapata等人,《蛋白质工程(Protein Eng.)》8:1057-1062,1995；以及美国专利第5,641,870号。
术语“嵌合抗体”指重链和/或轻链的一部分(一般指可变区)衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的其余部分(一般指恒定区)衍生自另一物种的抗体或属于另一种抗体类别或亚类的抗体、以及这些抗体的片段中的相应序列相同或同源，只要它们表现出期望的生物学活性。在本申请中涉及的嵌合 抗体如来自鼠源抗体的重链/轻链可变区通过抗体工程技术嫁接到人源抗体的重链/轻链的恒定区，其表现出相似的生物活性。
术语“人源化抗体”是指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在一些实施方案中，人源化抗体将包含基本上所有的至少一个、通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有的HVR(例如，CDR)对应于非人抗体的序列，并且所有或基本上所有的FR对应于人抗体的序列。
术语“亲和力”是指抗体与抗原之间在单个抗原位点处的相互作用的强度。在每个抗原位点内，抗体“臂”的可变区通过弱非共价力与抗原在许多位点处相互作用；相互作用越多，亲和力越强。
本文中术语“竞争”指用于竞争相同表位的抗原结合蛋白(例如中和抗原结合蛋白或中和抗体)的情况中时，意指在抗原结合蛋白之间竞争，其通过以下测定法来测定：在所述测定法中，待检测的抗原结合蛋白(例如抗体或其免疫学功能片段)防止或抑制(例如降低)参考抗原结合蛋白(例如配体或参考抗体)与共同抗原的特异性结合。
如本文所用，术语“变体”是指已经修饰至少一个，例如1、2或3个氨基酸取代、缺失或添加的重链可变区或轻链可变区，其中包含重链或轻链变体的经修饰的抗原结合蛋白基本上保留修饰前抗原结合蛋白的生物学特征。在一个实施方案中，含有变体重链可变区或轻链可变区序列的抗原结合蛋白保留修饰前抗原结合蛋白的70％、80％、90％、100％生物学特征。应当理解，可以单独或在与另一个重链可变区或轻链可变区组合修饰每个重链可变区或轻链可变区。本公开的抗原结合蛋白包含与本文描述的重链可变区氨基酸序列70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％同源的重链可变区氨基酸序列。本公开的抗原结合蛋白包括与本文描述的轻链可变区氨基酸序列70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％同源的轻链可变区氨基酸序列。同源性百分比可以在整个重链可变区和/或整个轻链可变区上，或者百分比同源性可以限于构架区，而对应于CDR的序列与重链可变区和/或轻链可变区内本文中公开的CDR具有100％同一性。如本文所用，术语“CDR变体”是指已经修饰至少一个，例如1、2或3个氨基酸取代、缺失或添加的CDR，其中包含CDR变体的经修饰的抗原结合蛋白基本上保留修饰前抗原结合蛋白的生物学特征。在一个实施方案中，含有变体CDR的抗原结合蛋白保留修饰前抗原结合蛋白的60％、70％、80％、90％、100％生物学特征。应当理解，可以修饰的每个CDR可以单独或与另一个CDR组合修饰。在一个实施方案中，修饰是取代，特别是保守取代。
术语“载体”在本文中使用时是指能够通过转化扩增与其相连的另一个核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及结合到已经引入其的宿主细胞的基因组中的载体。一些载体能够指导与其可操作相连的核酸的表达。这样的载体在本文中被称为“表达载体”。
术语“宿主细胞”是指引入外源核酸的细胞，包括这种细胞的后代。并能够表达外源核酸于细胞内或细胞膜或释放至胞外。
术语“受试者”包含人和非人动物。非人动物包含所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，如非人灵长类动物、绵羊、狗、牛、鸡、两栖动物和爬行动物。除在指出时之外，术语“患者”或“受试者”在本文中可互换使用。
术语“中和”是指抑制宿主细胞的病毒感染，如通过不存在病毒基因表达所展示的。在不受任何一种理论限制的情况下，通过特定抗体进行中和的机制可以包含阻断病毒衣壳蛋白与细胞表面受体的相互作用或在病毒基因组递送到宿主细胞的细胞核之前破坏进入和运输过程的任何阶段。
如本文所使用的，一方面，术语任何疾病或病症的“治疗”是指减轻所述疾病或病症(即，减缓或阻止或减少疾病或其临床症状中的至少一种症状的发展)。另一方面，“治疗”是指缓解或改善至少一个物理参数，所述至少一个物理参数包含患者可能无法辨别的那些物理参数。在又另一个方面，“治疗”是指在物理上(例如，稳定可辨别症状)、在生理学上(例如，稳定物理参数)或两者上调节疾病或病症。
术语“试剂盒”用于指有助于样品分析的试剂和其它材料的组合。在一些实施方式中，本文所述的免疫测定试剂盒包括合适的抗原、包含可检测部分的结合剂和检测试剂。用于放大由可检测部分产生的信号的系统也可以包括或不包括在试剂盒中。此外，在其它实施方式中，试剂盒包括但不限于诸如用于样品收集的装置、样品管、支架、托盘、架子、盘子、板、试剂盒用户的说明书、溶液或其它化学试剂等组件，以及用于标准化、归一化的样品和/或对照样品。
术语“药学上可接受”是指载体、稀释剂、赋形剂和/或其盐在化学和/或物理上与制剂中的其他成分相容，并且与接受者在生理学上相容。
术语“药学上可接受的载体和/或赋形剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性剂相容的载体和/或赋形剂，其在本领域中是公知的(参见例如，Remington’s Pharmaceutical Sciences.Edited by Gennaro AR，19th ed.Pennsylvania:Mack Publishing Company，1995)，并且包括但不限于pH调节剂，表面活性剂，佐剂和离子强度增强剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液；表面活性剂包括但不限于阳离子、阴离子或非离子表面活性剂，例如Tween-80；离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。
本申请抗体所针对的新型冠状病毒
冠状病毒(包括SARS-CoV和新近发现的2019-nCoV)是球形单股正链RNA病毒，其特征是，具有从病毒体表面突出的刺突蛋白(Barcena,M.等人，Cryo-electron tomography of mouse hepatitis virus:Insights into the structure of the coronavirion.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2009,106,582–587)。病毒颗粒的球形形态以及刺突突起使得冠状病毒在电子显微镜下看起来像冠冕而被命名为冠状病毒。
冠状病毒是被包膜的病毒(所被包膜衍生自宿主细胞膜的脂质双层)，具有主要由病毒结构蛋白(例如刺突蛋白(Spike，S)，膜蛋白(Membrane，M)，包膜蛋白(Envelope，E)和核衣壳蛋白(Nucleocapsid，N))形成的病毒结构，其中S蛋白、M蛋白和E蛋白均嵌入在病毒包膜中，N蛋白与病毒RNA相互作用，位于病毒颗粒的核心，形成核衣壳(Fehr,A.R.等人，Coronaviruses:An overview of their replication and pathogenesis.Methods Mol.Biol.2015,1282,1–23)。S蛋白是一种高度糖基化的蛋白，可在病毒颗粒表面形成同源三聚体的刺突，并介导病毒进入宿主细胞。
2019-nCoV是具有膜结构的、大小为80-120nm的单股正链RNA病毒，基因组长度约为29.9kb，该病毒与同属于冠状病毒科β冠状病毒属的SARS-CoV的基因组序列之间的同源性为80％。病毒基因组的可读框(Open reading frame，ORF)ORF1a和ORF1b占基 因组的2/3，表达水解酶以及与复制、转录相关的酶，例如，半胱氨酸蛋白酶(PLpro)和丝氨酸蛋白酶(3CLpro)，RNA依赖RNA聚合酶(RdRp)和解旋酶(Hel)；后面的基因组1/3区域主要负责编码结构蛋白，包括刺突蛋白(S)、包膜蛋白(E)、膜蛋白(M)、核衣壳蛋白(N)等主要结构蛋白，其中N蛋白包裹病毒基因组形成核蛋白复合体，E蛋白和M蛋白主要参与病毒的装配过程，S蛋白则主要通过与宿主细胞受体结合介导病毒的入侵并决定病毒的宿主特异性。经序列比对，发现2019-nCoV病毒和SARS-CoV病毒的S蛋白具有75％的相似度，据报道称多株SARS-CoV冠状病毒分离株中位于S蛋白与ACE2受体(在人体中主要分布于呼吸道上皮细胞、肺脏、心脏、肾脏和消化道等位置)复合物界面的442、472、479、487和491位点的氨基酸残基是高度保守的。与SARS-CoV的S蛋白相比较，在所述5个位点处，2019-nCoV S蛋白仅第491位氨基酸相同，其它4处氨基酸都发生了突变(Xu X等人，Sci China Life Sci.,2020年3月；63(3):457-460)。尽管如此，通过蛋白质3D结构模拟预测发现虽然2019-nCOV S蛋白与ACE2受体结合的所述4个关键氨基酸都发生了替换，但是相对于SARS-CoV S蛋白，2019-nCoV S蛋白中的受体结合结构域(receptor binding domain，RBD)的三维结构几乎不变，由此2019-nCoV S蛋白与人体ACE2仍然具有较高的亲和力，文章(Wrapp D等人，Cryo-EM structure of the 2019-nCoV Spike in the Prefusion Conformation，Science,2020年2月19日，网上公开，pii:eabb2507.doi:10.1126/science.abb2507)以及(Xiaolong Tian等人，Potent binding of 2019novel coronavirus spike protein by a SARS coronavirus-specific human monoclonal antibody,Emerging Microbes&Infections，2020,9:1,p382-385,DOI:10.1080/22221751.2020.1729069)通过Fortebio检测，2019-nCoV的S蛋白结合人类ACE2的亲和力(KD)约为15nM，与SARS-CoV的S蛋白结合人类ACE2的亲和力相当，由此可见，ACE2也是2019-nCoV感染人体进入细胞内部的受体蛋白。预期针对冠状病毒S蛋白并且阻断其与ACE2受体结合的高亲和力中和抗体，能够有效预防和治疗冠状病毒(例如，2019-n CoV)感染。
而随着全球疫情继续蔓延，新型冠状病毒也在不断发生着变异，所有变异株，比如最新的德尔塔(Delta)变异株、奥密克戎(Omicron)变异株等，都属于本文新型冠状病毒范畴。
1、本申请的针对新型冠状病毒S蛋白的抗体或抗原结合片段
术语“针对冠状病毒S蛋白的抗体”、“抗冠状病毒S蛋白的抗体”、“抗S蛋白抗体”、“冠状病毒S蛋白抗体”、“S蛋白抗体”或“结合S蛋白的抗体”在本文中可互换地使用，是指这样的本申请的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段能够以足够的亲和力结合冠状病毒S蛋白(例如，2019-n CoV S蛋白、SARS-CoV S蛋白)，由此所述抗体可以用于靶向冠状病毒S蛋白的诊断、预防和/或治疗。
本申请的抗体和抗原结合片段以高亲和力特异性结合冠状病毒S蛋白。在一些实施方案中，本申请的抗体是阻断抗体或中和抗体。在一些实施方案中，该阻断抗体或中和抗体可以用于预防冠状病毒感染和/或治疗冠状病毒感染的个体。
在一些实施方案中，根据上述定义中关于CDR的不同分析方法可知，本申请的冠状病毒S蛋白抗体或抗原结合片段是这样一类序列：
其可以包含SEQ ID NO.30，SEQ ID NO.46任一所示的重链可变区氨基酸序列中的3个CDR，和SEQ ID NO.32，SEQ ID NO.48任一所示的轻链可变区氨基酸序列中的3 个CDR；或者与上述轻重链CDR区具有单个或者多个CDR不超过每个CDR区2个氨基酸变化的变体。
在一些实施方案中，当按照Kabat编码规则对抗体HCDRs编码时，所述抗体或抗原结合片段包含如下CDR序列：
i.所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.103、127任一所示；
ii.所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.104、128任一所示；
iii.所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.105、129任一所示；
iv.所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.106、130任一所示；
v.所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.107、131任一所示；
vi.所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.108、132任一所示；
或者，与上述i-vi的6个CDR区具有单个或者多个CDR不超过每个CDR区2个氨基酸变化的变体。
在一些实施方案中，所述HCDR1/HCDR2/HCDR3的组合可以包含选自以下的一组或多组：
(1)HCDR1/HCDR2/HCDR3:
SEQ ID NO.103/SEQ ID NO.104/SEQ ID NO.105；
或SEQ ID NO.127/SEQ ID NO.128/SEQ ID NO.129；
(2)或者含有一处或多处不超过2个氨基酸的氨基酸取代、缺失或插入的上述(1)的HCDR；
所述LCDR1/LCDR2/LCDR3的组合包含选自以下的一组或多组：
(1)LCDR1/LCDR2/LCDR3为：
SEQ ID NO.106/SEQ ID NO.107/SEQ ID NO.108；
或SEQ ID NO.130/SEQ ID NO.131/SEQ ID NO.132；
(2)或者含有一处或多处不超过2个氨基酸的氨基酸取代、缺失或插入的上述(1)的HCDR。
在一些具体的实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段具体为ACRO3-286L、ACRO3-347K。在一些具体的实施方案中，本申请的可结合SARS-CoV-2病毒的中和抗体或其抗原结合片段，还包括重链可变区VH序列和轻链可变区VL序列。所述重链可变区VH序列与选自包括以下序列的组中的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的序列一致性：SEQ ID NO.30，SEQ ID NO.46；所述轻链可变区VL序列与选自包括以下序列的组中的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的序列一致性：SEQ ID NO.32，SEQ ID NO.48；优选地，所述氨基酸变化不发生在CDR区中。
在一些更具体的实施方案中，本申请的一些特定抗体序列如下表所示(本申请可结合SARS-CoV-2病毒的中和抗体或其抗原结合片段的特定VH和VL序列)。
在一些实施方案中，本申请的抗体或抗原结合片段还包含Fc区，所述Fc区来自IgG，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
在一些实施方案中，上述氨基酸同源性中的氨基酸变化包括氨基酸的取代、插入或缺失。优选的，本文所述的氨基酸变化为氨基酸取代，优选地保守取代。保守取代是指一个氨基酸经相同类别内的另一氨基酸取代，例如一个酸性氨基酸经另一酸性氨基酸取代，一个碱性氨基酸经另一碱性氨基酸取代，或一个中性氨基酸经另一中性氨基酸取代。示例性的取代如下表所示(氨基酸取代)。
| 原始残基 | 示例性取代 | 优选的取代 |
| Ala(A) | Val；Leu；Ile | Val |
| Arg(R) | Lys；Gln；Asn | Lys |
| Asn(N) | Gln；His；Asp、Lys；Arg | Gln |
| Asp(D) | Glu；Asn | Glu |
| Cys(C) | Ser；Ala | Ser |
| Gln(Q) | Asn；Glu | Asn |
| Glu(E) | Asp；Gln | Asp |
| 原始残基 | 示例性取代 | 优选的取代 |
| Gly(G) | Ala | Ala |
| His(H) | Asn；Gln；Lys；Arg | Arg |
| Ile(I) | Leu，Val；Met；Ala；Phe；正亮氨酸 | Leu |
| Leu(L) | 正亮氨酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe | Ile |
| Lys(K) | Arg；Gln；Asn | Arg |
| Met(M) | Leu；Phe；Ile | Leu |
| Phe(F) | Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr | Tyr |
| Pro(P) | Ala | Ala |
| Ser(S) | Thr | Thr |
| Thr(T) | Val；Ser | Ser |
| Trp(W) | Tyr；Phe | Tyr |
| Tyr(Y) | Trp；Phe；Thr；Ser | Phe |
| Val(V) | Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正亮氨酸 | Leu |
在优选的实施方案中，本申请所述的氨基酸变化发生在CDR外的区域(例如在FR中)。更优选地，本申请所述的氨基酸变化发生在Fc区。在一些实施方案中，提供了包含含有一个或多个突变的Fc结构域的抗冠状病毒S蛋白抗体，该突变增强或减弱抗体例如与中性pH相比在酸性pH下与FcRn受体的结合。
在一些实施方案中，本申请按照Kabat编码规则对抗体CDRs编码，特定编号抗体的CDRs序列如下表所示(本申请可结合SARS-CoV-2病毒的中和抗体或其抗原结合片段的HCDRs和LCDRs序列)
在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段可进一步包含连接至多肽的偶联部分，所述偶联部分选自放射性核素、药物、毒素、细胞因子、酶、荧光素、载体蛋白、脂类、和生物素中的一种或多种，其中所述多肽或抗体与所述偶联部分可选择性通过连接子相连，优选所述连接子为肽或多肽。
在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段可选自单克隆抗体、多克隆抗体、抗血清、嵌合抗体、人源化抗体和人抗体；更优选的，所述抗体选自多特异性抗体、单链Fv(scFv)、单链抗体、抗独特型(抗-Id)抗体、双抗体、微型抗体、纳米抗体、单结构域抗体、Fab片段、F(ab’)片段、二硫化物连接的双特异性Fv(sdFv)和胞内抗体。
在一些实施方案中，本申请所述的抗体或其抗原结合片段可以通过重组表达产生。可以将编码任选与恒定区连接的轻链和重链可变区的上述核酸插入表达载体中。包含编码本文所述抗体的核酸的载体本身是本申请的一方面。轻链和重链可以克隆到相同或不同的表达载体中。编码本文所述抗体链的核酸可以与表达载体中的一个或多个控制序列可操作地连接，以确保抗体链的表达。表达控制序列包括但不限于启动子(例如，天然相关或异源启动子)、信号序列、增强子元件和转录终止序列。优选地，表达控制序列是能够转化或转染真核宿主细胞的载体中的真核启动子系统。此类载体可并入合适的宿主中，由此宿主维持在适合于高水平表达核苷酸序列以及收集和纯化抗体的条件下。
2、本申请的核酸、包含其的载体和宿主细胞
本申请提供了编码以上任何冠状病毒S蛋白抗体或其抗原结合片段或其任一条链的核酸。在一个实施方案中，提供包含所述核酸的载体。在一个实施方案中，载体是表达载体。在一个实施方案中，提供包含所述核酸或所述载体的宿主细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是真核的。在另一个实施方案中，宿主细胞选自酵母细胞、哺乳动物细胞或适用于制备抗体或其抗原结合片段的其它细胞。在另一个实施方案中，宿主细胞是原核的。
本申请涉及的核酸是编码抗SARS-CoV-2 S蛋白抗体或其抗原结合片段或其VH或VL结构域的核酸；可以理解但凡能够编码上述抗体或其抗原结合片段或其VH或VL结构域的核酸都在本申请的范围内。
在一些具体的实施方案中，所述核酸序列组合如下表所示(编码本申请可结合SARS-CoV-2病毒的中和抗体或其抗原结合片段的特定核酸序列组合)
当然，本申请的核酸也可以是与上述任一具有密码子兼并性的核酸序列，比如与上述序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。
本申请的包含上述一种或多种编码本文所述抗体的核酸的载体，载体可以是克隆载体或表达载体，在此不作限制。
在一个实施方案中，载体是表达载体，例如真核表达载体。载体包括但不限于病毒、质粒、粘粒、λ噬菌体或酵母人工染色体(YAC)等。
在一个实施方案中，载体包含任选的调控序列；在一些实施方式中，所述调控序列可以选自前导序列、多聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号序列、转录终止子，或其任何组合，不作限制。
本申请的包含所述表达载体的宿主细胞，比如宿主细胞为酵母细胞、哺乳动物细胞或适用于制备抗体或其抗原结合片段的其它细胞。在一些实施方案中，合适的宿主细胞包括原核微生物，如大肠杆菌。宿主细胞还可以是真核微生物如丝状真菌或酵母，或各种真核细胞，例如昆虫细胞等。也可以将脊椎动物细胞用作宿主。例如，可以使用被改造以适合于悬浮生长的哺乳动物细胞系。有用的哺乳动物宿主细胞系的例子包括SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(HEK293或293F细胞)、293细胞、幼仓鼠肾细胞(BHK)、猴肾细胞(CV1)、非洲绿猴肾细胞(VERO-76)、人宫颈癌细胞(HELA)、犬肾细胞(MDCK)、布法罗大鼠肝脏细胞(BRL 3A)、人肺细胞(W138)、人肝脏细胞(Hep G2)、中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)、CHOS细胞、NSO细胞、骨髓瘤细胞系如Y0、NS0、P3X63和Sp2/0等。适于产生蛋白质的哺乳动物宿主细胞系的综述参见例如Yazaki和Wu，Methods in Molecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo编著，Humana Press，Totowa，NJ)，第255-268页(2003)。在一个优选的实施方案中，所述宿主细胞是CHO细胞或293细胞。
可以通过熟知的方法将本文描述的包含感兴趣的多核苷酸序列(例如，重链和轻链编码序列和表达控制序列)的载体转移到宿主细胞中，该方法根据细胞宿主的类型而有所不同。例如，氯化钙转染通常用于原核细胞，而磷酸钙处理、电穿孔、脂质转染、生物射弹或基于病毒的转染可用于其它细胞宿主。(通常参见Green和Sambrook，分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)(冷泉港出版社，第4版，2012年)。用于转化哺乳动物细胞的其它方法包括使用聚凝胺、原生质体融合、脂质体、电穿孔和显微注射(通常参见，Sambrook等.,同上)。为了产生转基因动物，可以将转基因显微注射到受精卵母细胞中，或者可以将其整合到胚胎干细胞的基因组中，并且这些细胞的细胞核被转移到去核卵母细胞中。
3、本申请的抗体或抗原结合片段的制备、生产和纯化
本申请的制备抗体或其抗原结合片段的方法，可以包括在宿主细胞培养物中表达本文所述的载体以产生所述抗体，并从细胞培养物中回收该抗体。
在一些实施方案中，该方法可包括将包含一种或多种编码如上所述抗SARS-CoV-2 S蛋白抗体或其抗原结合片段或其抗体链的核酸的载体转移到如本文所述的宿主细胞中，在允许表达核酸的条件下培养宿主细胞培养物，回收表达的抗SARS-CoV-2 S蛋白抗体或其抗原结合片段。可以采用本领域已知的任何合适的方法。
本申请提供了制备冠状病毒抗体或抗原结合片段的方法，其中所述方法包括在适于表达编码所述冠状病毒抗体或抗原结合片段的核酸的条件下培养包含编码所述抗体的核酸或包含所述核酸的表达载体的宿主细胞，以及任选地分离所述抗体或抗原结合片段。在某个实施方案中，所述方法还包括从所述宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收纯化相应抗体或抗原结合片段。
在一些实施方案中，本文所述制备的抗体或抗原结合片段可以通过已知的现有技术如高效液相色谱、离子交换层析、凝胶电泳、亲和层析、大小排阻层析等纯化。用来纯化特定蛋白质的实际条件还取决于净电荷、疏水性、亲水性等因素，并且这些对本领域技术人员是显而易见的。可以通过多种熟知分析方法中的任一种方法确定本申请的抗体的纯度，所述熟知分析方法包括大小排阻层析、凝胶电泳、高效液相色谱等。
在一些实施方案中，可以通过本领域中已知的多种测定法对本文中提供的新型冠状病毒抗体鉴定、筛选或表征其物理/化学特性和/或生物学活性。一方面，对本申请的抗体测试其抗原结合活性，例如通过已知的方法诸如ELISA，Western印迹等来进行。可使用本领域已知方法来测定对冠状病毒S蛋白的结合，在一些实施方案中，可以使用SPR或生物膜层干涉测定本申请的冠状病毒S蛋白抗体对冠状病毒S蛋白的结合。
4、本申请的药物组合物，以及治疗应用
在一些实施方案中，本申请提供包含本文所述的任何冠状病毒S蛋白抗体或抗原结合片段的组合物，优选地组合物为药物组合物，该药用组合物可以是预防性用途，也可以是治疗性用途。可以理解，预防性用途可以包括疫苗类组合物。
在一个实施方案中，所述组合物还包含药用辅料。在一个实施方案中，组合物(例如，药物组合物)包含本申请的冠状病毒S蛋白抗体或抗原结合片段，以及一种或多种其它治疗剂(例如抗感染活性剂、小分子药物)的组合。所述抗感染活性剂、小分子药物是用来治疗、预防或缓解受试者中冠状病毒感染的任何抗感染活性剂、小分子药物，包括但不限于瑞德西韦、利巴韦林、奥司他韦、扎那米韦、羟氯喹、干扰素-α2b、镇痛药、阿奇霉素和皮质类固醇。在本申请的上下中，冠状病毒感染包括由冠状病毒(包括但不限于2019-n CoV、SARS-CoV)引起的感染。
在一些实施方案中，本申请所述的抗SARS-CoV-2 S蛋白抗体或其抗原结合片段可以作为包含活性治疗性抗体试剂和各种其它药学上可接受的成分的药物组合物配制和/或给予。优选的形式取决于预期的给药方式和治疗应用。取决于所需的制剂，组合物还可包含药学上可接受的、无毒的运载体或稀释剂，它们被定义为通常用于配制用于动物或人给药的药物组合物的载体。选择稀释剂以不影响组合的生物活性。此类稀释剂的例子是蒸馏水、生理性磷酸缓冲盐水、林格氏液、葡萄糖溶液和汉克氏液。此外，药物组合物或制剂还可以包括其它运载体、佐剂或无毒、非治疗性、非免疫原性的稳定剂等。
在一些实施方案中，本申请所述的抗SARS-CoV-2 S蛋白抗体或其抗原结合片段的药物组合物还可包括大的、缓慢代谢的大分子，例如蛋白、多糖，如壳聚糖、聚乳酸、聚乙醇酸和共聚物(例如琼脂糖、纤维素等)、聚合氨基酸、氨基酸共聚物和脂质聚集体(如油滴或脂质体)。此外，这些运载体可用作免疫刺激剂(即佐剂)。
在一个实施方案中，本申请的药物组合物还可以包含超过一种活性成分，所述活性成分是被治疗的特定适应症所需的，优选具有不会不利地彼此影响的互补活性的那些活性成分。例如，理想的是还提供其它抗感染活性成分，例如其它抗体、抗感染活性剂、小分子药物或免疫调节剂等。所述活性成分以对于目的用途有效的量合适地组合存在。
在一些实施方式中，所述抗感染活性剂、小分子药物是用来治疗、预防或缓解受试者中冠状病毒感染的任何抗感染活性剂、小分子药物，包括但不限于瑞德西韦、利巴韦林、奥司他韦、扎那米韦、羟氯喹、干扰素-α2b、镇痛药、阿奇霉素和皮质类固醇。
术语“药用载体”可包括生理上相容的任何和全部溶剂、分散介质、等渗剂和吸收延迟剂等。适用于本申请的药用载体可以是无菌液体，如水和油，包括那些石油、动物、植物或合成来源的，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当静脉内施用药物组合物时，水是优选的载体。还可以将盐水溶液和水性右旋糖以及甘油溶液用作液体载体，特别是用于可注射溶液。合适的赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、甘油单硬脂酸酯、滑石、氯化钠、干燥的脱脂乳、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。对于赋形剂的使用及其用途，亦参见“Handbook of Pharmaceutical Excipients”,第五版,R.C.Rowe,P.J.Seskey和S.C.Owen,Pharmaceutical Press,London,Chicago。若期望的话，所述组合物还可以含有少量的润湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂。这些组合物可以采用溶液、悬浮液、乳剂、片剂、丸剂、胶囊剂、粉末、持续释放配制剂等的形式。口服配制剂可以包含标准药用载体和/或赋形剂，如药用级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精。
在一个实施方案中，本申请提供了用于预防受试者中冠状病毒相关疾病或病患的方法，其包括向受试者施用本上述药物组合物。
具有冠状病毒相关疾病风险的受试者包括与感染者接触的受试者或以一些其他方式暴露于冠状病毒的受试者。预防剂例如疫苗的施用可以在表现出冠状病毒相关疾病的症状特征之前施用，以便阻止疾病，或可选择地延迟疾病的进展。
在一个实施方案中，本申请还提供了治疗患者中冠状病毒相关疾病的方法。在一个实施方案中，该方法涉及将中和冠状病毒的本申请的抗体、或药物组合物施用至患所述疾病的患者。
6、本申请的抗体或其抗原结合片段用于诊断和检测冠状病毒的方法和组合物
本申请提供的抗体或抗原结合片段可以用于检测冠状病毒在生物样品中的存在，进而用于诊断和检测冠状病毒。
本申请提供的抗SARS-CoV-2 S蛋白抗体或其抗原结合片段能方便地用于试剂盒中，体内或体外的生物流体内或组织上的SARS-CoV-2 S蛋白可被本申请提供的抗体或其抗原结合片段检测出来。能用于任何含有可检测量的SARS-CoV-2 S蛋白的样品。
本申请所述试剂盒可包含至少一种本文所述的抗体或其抗原结合片段。试剂盒可包含在一个或多个本文所述的组合物，任选地与一种或多种其它预防或治疗剂一起用于诊断、预防、控制或治疗SARS-CoV-2。试剂盒还可包括用于预防、治疗、控制或改善SARS-CoV-2，以及副作用和给药方法的剂量信息的说明书。
检测样本中新冠病毒抗体的存在可以表明该样本之前所在的受试者正在或之前被新冠病毒感染。检测样本中新冠病毒抗体的存在可以表明该样本之前所在的受试者对于当前或之前新冠病毒感染的免疫反应，特别是体液免疫反应。
本申请所述样品可以包括但不限于液体如尿、唾液、脑脊髓液、血液、血清及类似物，或者样品可以是固体或半固体如组织、粪便及类似物，或者，可以是如那些常用于组织学诊断的固体组织。
在一些实施方式中，受试者可以是新冠患者，新冠康复患者，或者是接种过新冠疫苗的个体。
术语“检测”用于本文中时，包括定量或定性检测，示例性的检测方法可以涉及免疫组织化学、免疫细胞化学、流式细胞术(例如，FACS)、抗体分子复合的磁珠、ELISA测 定法。在一些实施方式中，本申请的抗SARS-CoV-2 S蛋白抗体或其抗原结合片段可以偶联荧光素酶、生物素酶等可检测标记，在液相或固相中用于FACS、IHC、ELISA等直接或间接的免疫测定，包括竞争性或非竞争性。
在一个实施方案中，提供检测冠状病毒在生物样品中的存在的方法。在某些实施方案中，所述方法包括检测冠状病毒S蛋白在生物样品中的存在。在某些实施方案中，所述方法包括将生物样品与如本文所述的冠状病毒S蛋白抗体或抗原结合片段在允许冠状病毒S蛋白抗体或抗原结合片段与冠状病毒S蛋白结合的条件下接触，并检测在冠状病毒S蛋白抗体或抗原结合片段和冠状病毒S蛋白之间是否形成复合物。复合物的形成表示存在冠状病毒。该方法可以是体外或体内方法。
用于冠状病毒的示例性诊断测定包括例如使用本申请的抗冠状病毒S蛋白接触从患者获得的样品，其中使用可检测的标记或报告分子标记抗冠状病毒S蛋白或用作捕获配体以选择性地从患者样品分离冠状病毒。备选地，未标记的抗冠状病毒S蛋白可与本身被可检测地标记的第二抗体组合在诊断应用中使用。可检测的标记或报告分子可以是放射性同位素、如3H、14C、32P、35S或125I；荧光或化学发光的部分如荧光素异硫氰酸酯或罗丹明，或酶如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶或荧光素酶。可用于检测或测量样品中冠状病毒的具体的示例性测定包括酶连接的免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)和荧光活化细胞分选(FACS)。
可在根据本申请的冠状病毒诊断测定中使用的样品包括从患者可获得的任何生物样品，其包含在正常或生理条件下可检测量的冠状病毒刺突蛋白或其片段。在一些实施方案中，生物样品是血液、血清、咽拭子、下呼吸道样本(如气管分泌物、气管吸取物、肺泡灌洗液)或生物来源的其他样品。一般而言，将测量从健康患者获得的特定样品中的冠状病毒刺突蛋白水平(例如未受与冠状病毒相关的疾病所扰的患者)以初始性地建立基线或标准冠状病毒水平。该冠状病毒基线水平可随后与从疑似具有冠状病毒相关病况或与该病况相关的症状的个体获得的样品中测量的冠状病毒水平进行比较。
6、本申请的抗体或其抗原结合片段的其他方面应用
可以理解，基于本申请的中和活性抗体基础性质，本申请的抗体或其抗原结合片段还可以应用于检测/筛选/纯化/制备中和抗体中等。
下面将结合实施例对本申请的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
下面将结合附图对本申请的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
实施例1单记忆B细胞分选和抗体克隆
志愿者招募及抽血经复旦大学基础医学院伦理委员会批准。研究参与者，四名接受三剂CoronaVac灭活疫苗的捐赠者和三名接受两剂的捐赠者，在接种疫苗后一个月献 血。所有捐献者的年龄都在23-52岁之间，男女比例为3:4。采集外周血后，将人外周血单核细胞(PBMC)分离、分装并储存在液氮中。
将储存的PBMC解冻，并与CD19微球(Miltenyi Biotec)一起孵育。然后将CD19+B淋巴细胞与人Fc段(BD Biosciences)、抗CD20-PECy7(BD Biosciences)、S-ECD-PE和S-ECD-APC依次孵育。然后使用FACSAria II(BD Biosciences)将单个记忆B细胞(CD20-PECy7+S-ECD-PE+S-ECD-APC+)分选到96孔板中，并用于抗体克隆。免疫球蛋白重链和κ/λ轻链Fab区的扩增PCR产物进行电泳和Sanger测序。通过IMGT/V-QUEST和IgBlast分析它们的核苷酸序列，并确定每个抗体的V(D)J基因片段和CDR3序列。
实施例2抗体表达
对选定的抗体进行载体构建和抗体表达。简而言之，所有克隆的人单克隆抗体均通过瞬时转染哺乳动物HEK293F细胞制备，这些细胞使用无血清OPM-293-CD05培养基(OPM Biosciences)在37℃、5％CO2和100rpm振荡下培养。共表达了30种克隆抗体。
实施例3假病毒中和实验
使用假病毒进行体外中和试验，如前所述。简而言之，接种Huh-7细胞，然后与假病毒/抗体混合物一起孵育12小时。抗体在PBS中以1:3的比例连续稀释，共稀释9次，起始浓度为10μg/ml。使用新鲜的DMEM培养基代替混合物进行进一步培养。24或48小时后，收集Huh-7细胞并如前所述测量发光。实验结果如表1所示。
表1假病毒中和实验结果
注：Neg代表negative，阴性。
从表1可以看出，抗体ACRO3-286L和ACRO3-347K对WT、B.1.1.7(Alpha)、B.1.351(Beta)、P.1(Gamma)、B.1.617.2(Delta)、C.37(Lambda)及B.1.1.529(Omicron)假病毒毒株中和能力较好。
实施例4真病毒中和实验
从恢复期和接种疫苗的志愿者收集的血浆样品首先在56℃下灭活0.5h。灭活的血清样品或纯化的mAb用细胞培养基从1:4或50,000ng/mL连续稀释，分两步稀释，并与含有100TCID50的病毒悬浮液混合，并在36.5℃下孵育2小时。之后，将混合物加入到接种了融合的Vero细胞的96孔板中，并在36.5℃、5％CO2的培养箱中再培养5天。由三个不同的个体在显微镜下观察和记录每个孔的细胞病变效应(CPE)，然后用于通过Reed-Muench方法计算中和效价。实验结果如表2所示。
表2真病毒中和实验结果
从表2所示，在真病毒中和方面，抗体ACRO3-286L和ACRO3-347K在WT、B.1.351(Beta)、P.1(Gamma)、B.1.617.2(Delta)中展示出较高的中和效价，表明这些抗体的高中和活性。
前述对本申请的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本申请限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本申请的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本申请的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本申请的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
Claims (14)
- 一种抗SARS-CoV-2 S蛋白的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，包含SEQ ID NO.30或SEQ ID NO.46任一所示的重链可变区氨基酸序列中的3个CDR和SEQ ID NO.32或SEQ ID NO.48任一所示的轻链可变区氨基酸序列中的3个CDR；或者与上述轻重链CDR区具有单个或者多个CDR不超过每个CDR区2个氨基酸变化的变体。
- 权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，当按照Kabat编码规则对抗体HCDRs编码时，所述抗体或抗原结合片段包含如下CDR序列：i.所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.103或127任一所示；ii.所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.104或128任一所示；iii.所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.105或129任一所示；iv.所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.106或130任一所示；v.所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.107或131任一所示；vi.所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.108或132任一所示；或者，与上述i-vi的6个CDR区具有单个或者多个CDR不超过每个CDR区2个氨基酸变化的变体。
- 权利要求2所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述HCDR1/HCDR2/HCDR3的组合包含选自以下的一组或多组：(1)HCDR1/HCDR2/HCDR3:SEQ ID NO.103/SEQ ID NO.104/SEQ ID NO.105；或SEQ ID NO.127/SEQ ID NO.128/SEQ ID NO.129；(2)或者含有一处或多处不超过2个氨基酸的氨基酸取代、缺失或插入的上述(1)的HCDR；所述LCDR1/LCDR2/LCDR3的组合包含选自以下的一组或多组：(1)LCDR1/LCDR2/LCDR3为：SEQ ID NO.106/SEQ ID NO.107/SEQ ID NO.108；或SEQ ID NO.130/SEQ ID NO.131/SEQ ID NO.132；(2)或者含有一处或多处不超过2个氨基酸的氨基酸取代、缺失或插入的上述(1)的HCDR。
- 权利要求1-3任一所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，序列选自如下：a)所述重链可变区的氨基酸序列包含选自由SEQ ID NO.30或SEQ ID NO.46所组成的组中的氨基酸序列，或与组中的序列具有至少70％、80％、90％、95％、99％或100％序列同一性；b)所述轻链可变区的氨基酸序列包含选自由SEQ ID NO.32或SEQ ID NO.48所组成的组中的氨基酸序列或与组中的序列具有至少70％、80％、90％、95％、99％或100％序列同一性。
- 权利要求1-4任一所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段进一步包含连接至多肽的偶联部分，所述偶联部分选自放射性核素、药物、毒素、细胞因子、酶、荧光素、载体蛋白、脂类、和生物素中的一种或多种，其中所述多肽或抗体与所述偶联部分可选择性通过连接子相连，优选所述连接子为肽或多肽。
- 权利要求1-5任一所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原 结合片段选自单克隆抗体、多克隆抗体、抗血清、嵌合抗体、人源化抗体和人抗体；优选的，所述抗体选自多特异性抗体、单链Fv(scFv)、单链抗体、抗独特型(抗-Id)抗体、双抗体、微型抗体、纳米抗体、单结构域抗体、Fab片段、F(ab’)片段、二硫化物连接的双特异性Fv(sdFv)和胞内抗体。
- 一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码权利要求1-6任一所述的抗体或抗原结合片段。
- 一种重组载体，其包含权利要求7所述的多核苷酸，以及任选的调控序列；优选的，所述重组载体为克隆载体或表达载体；更优选的，所述调控序列选自前导序列、多聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号序列、转录终止子，或其任何组合。
- 一种宿主细胞，其特征在于，包含权利要求8所述的重组载体；优选的，所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞；更优选的，所述宿主细胞包括但不限于酵母细胞、中国仓鼠卵巢细胞、人胚肾细胞。
- 一种药物组合物，其特征在于，包含如权利要求1-9任一所述的抗体或抗原结合片段、多核苷酸、重组载体和宿主细胞中的一种或更多种；优选的，所述组合物还包含药学上可接受的载体或辅料。
- 一种试剂盒，其特征在于，包含如权利要求1-9任一所述的抗体或抗原结合片段、多核苷酸、重组载体和宿主细胞中的一种或更多种，并容纳于合适的容器中。
- 权利要求1-6任一所述的抗体或抗原结合片段的如下任一应用：a)在治疗新冠肺炎中的应用；b)在制备治疗新冠肺炎药物组合物中的应用；c)在预防新冠肺炎中的应用d)在制备新冠肺炎疫苗中的应用；e)检测/筛选/纯化/制备抗体中的应用；f)在制备中和抗体检测/筛选/纯化试剂盒中的应用。
- 一种制备可结合SARS-CoV-2病毒的中和抗体或其抗原结合片段的方法，其特征在于，所述方法包括在权利要求9所述宿主细胞培养物中表达第三方面载体以产生所述抗体，和从细胞培养物中回收抗体分子。
- 治疗新型冠状病毒肺炎的方法，其特征在于，通过向受试个体施用有效量的权利要求1-6任一所述抗体或其抗原结合片段，或权利要求10所述药物组合物。
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