WO2021237534A1 - 抗新型冠状病毒的抗体、抗体组合、制备方法、包含其的检测试剂盒 - Google Patents

抗新型冠状病毒的抗体、抗体组合、制备方法、包含其的检测试剂盒 Download PDF

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Definitions

  • nucleic acid diagnosis is fast, it is greatly affected by the quality of sampling, and there are false positives and false negatives, which affect the implementation of prevention and control measures.
  • Some asymptomatic infections are also negative in the late stage of the disease.
  • Nucleic acid testing alone is prone to missed diagnosis.
  • Serological diagnosis is to detect the body's immune response after pathogen infection. It lasts for a long time and the immune response is stable, and the immune response shows a dynamic trend with the progression of the disease. Therefore, serological diagnosis is also an important means for early diagnosis and evaluation of infection status.
  • the monoclonal antibody or antigen binding portion thereof comprises the heavy chain variable region CDR1-3 shown in SEQ ID NO. 25-27, and the heavy chain variable region CDR1-3 shown in SEQ ID NO. 29-31.
  • the light chain variable region CDR1-3 is shown.
  • Suitable antibody or secondary antibody labels have been described above, including various enzymes, prosthetic groups, fluorescent materials, luminescent materials, and radioactive materials.
  • Suitable enzyme markers include horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, ⁇ -galactosidase, or acetylcholinesterase, etc.
  • suitable prosthetic group complexes include streptavidin/biotin and egg white affinity
  • Suitable fluorescent materials include umbelliferone, fluorescein, fluorescein isothiocyanate, rhodamine, dichlorotriazinylamine fluorescein, dansyl chloride or phycoerythrin, etc.
  • luminescent materials include Luminol
  • suitable radioactive substances include 125 I, 131 I, 35 S or 3 H, etc.
  • the two domains of the Fv fragment, VL and VH are encoded by separate genes, they can be connected through a synthetic linker using recombinant methods, so that they can be prepared into a single protein chain, in which the VL and VH regions are paired to form Monovalent molecules (referred to as single-chain Fv (scFv); see, for example, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; and Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883).
  • single chain antibodies are also intended to be encompassed by the term "antigen binding portion".
  • These antibody fragments can be obtained using conventional techniques well known to those skilled in the art, and can be used for screening fragments in the same manner as intact antibodies.
  • amino acid sequence of CDR2 in the heavy chain variable region is shown in SEQ ID NO.10;
  • amino acid sequence of CDR2 of the heavy chain variable region is shown in SEQ ID NO.26;
  • amino acid sequence of CDR2 in the heavy chain variable region is shown in SEQ ID NO.58;
  • JS09 antibody sequence is as follows:
  • amino acid sequence of CDR2 in the heavy chain variable region is shown in SEQ ID NO. 74;
  • amino acid sequence of CDR2 in the heavy chain variable region is shown in SEQ ID NO.106;
  • JS16 antibody sequence is as follows:
  • the amino acid sequence of CDR2 in the heavy chain variable region is shown in SEQ ID NO. 122;
  • amino acid sequence of CDR2 of the light chain variable region is shown in SEQ ID NO.126;
  • the CM5 chip was regenerated with pH 2.0 glycine-hydrochloric acid, and then the next concentration detection was performed. After the experiment is over, use the Biacore T200 Evaluation Software software to fit the curve globally to obtain the binding affinity.

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Abstract

提供了抗新型冠状病毒的抗体、抗体组合、制备方法、包含其的检测试剂盒。抗体和检测试剂盒可用于新型冠状病毒检测或新型冠状病毒感染诊断。

Description

抗新型冠状病毒的抗体、抗体组合、制备方法、包含其的检测试剂盒 技术领域
本发明属于细胞免疫学、分子生物学领域，涉及抗新型冠状病毒的抗体、抗体组合、制备方法、包含其的检测试剂盒。
背景技术
国际病毒分类委员会将新型冠状病毒命名为SARS-CoV-2，世界卫生组织将感染此病毒引起的肺炎称为COVID-19。此病毒传染性强，传播途径广。该病毒能迅速适应人体环境，感染后在潜伏期即具有传播能力，同时还有一些无症状感染者报道，甚至在多种动物体内也检测到病毒核酸。这些因素使得对该病毒的防控变的非常复杂，而且目前没有有效治疗药物及疫苗上市。
SARS-CoV-2属于冠状病毒属，为单股正链RNA病毒，大小约30kb，与SARS-CoV相似性为79％，与蝙蝠体内分离的冠状病毒(Coronavirus，CoV)相似性最高约88％。SARS-CoV-2具有典型的冠状病毒特征，病毒包膜上有典型的棘突，形似日冕。核衣壳为螺旋对称型，主要结构蛋白是核衣壳蛋白(Nucleocapsid protein,NP)，NP全长420个氨基酸。NP在病毒结构蛋白中含量最多，在宿主感染早期大量表达，且免疫原性较强，能引起宿主强烈的免疫应答。因此，NP可作为SARS-CoV-2感染血清学诊断的主要靶标抗原。
由于特异性治疗药物及有效疫苗尚未研发成功，早期诊断成为防控疫情重要的措施，早期核酸诊断及临床诊断为确诊重要依据。虽然核酸诊断速度快，受采样的质量的影响大，存在假阳性和假阴性，影响防控措施的落实。部分无症状感染者在病程晚期核酸检测也呈阴性，单凭核酸检测很容易出现漏诊。血清学诊断是检测病原感染后机体的免疫反应，持续时间长，免疫反应稳定，且免疫反应随着病程进展呈动态变化趋势。因此，血清学诊断同样也是早期诊断和感染现状评价的的重要手段。
发明内容
本发明通过提供特异性结合新型冠状病毒NP蛋白的分离的、重组的或合成的抗体、或其抗原结合部分或衍生物来提供对于这些和其他问题的解决方案。
本发明的单克隆抗体分子可为免疫球蛋白分子的任何种类(例如IgG、IgE、IgM、IgD或IgA)或亚类。可根据所推荐的单克隆抗分子功能选择抗体的恒定区结构域(如果存在)。例如，恒定区结构域可为人IgA、IgD、IgE、IgG或IgM结构域。尤其可使用人IgG恒定区结构域，特别是IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
单克隆抗体片段包括例如，例如Fab、F(ab)2、Fab’、F(ab’)2、F(ab’)3、F(v)、Fd、dAb、双抗体、小型抗体、纳米抗体片段、单个可变结构域(例如VH或VL结构域)的片段，或仅含重链或轻链结构域的片段。
本发明的抗新型冠状病毒的单克隆抗体，可为鼠类的、嵌合的、灵长类化的、人源化的或全人源抗体。本发明的抗体可为多聚、异二聚、半二聚(hemidimeric)、单价、二价、四价、双特异性的，并且可包括单链抗体；及这些的衍生物。
在本发明的一个实施方案中，抗新型冠状病毒NP蛋白的单克隆抗体指全人源抗体。全人源抗体含具有源自人免疫球蛋白的序列(例如，得自人免疫球蛋白编码序列)的抗体多肽或免疫球蛋白可变结构域。本文中将术语“人”应用于抗体或片段(例如可变结构域)时，不含已通过将人恒定区序列移植到抗体多肽(即，用人恒定区替换非人恒定区)或通过将人V区构架序列移植到来自非人哺乳动物的免疫球蛋白可变结构域(即用人构架区替换V结构域的非人构架区)而“人源化”的来自另一个物种(例如小鼠)的抗体。
本发明的单克隆抗体含合成抗体或使用重组DNA技术产生的重组抗体，例如由噬菌体表达的抗体。还应解释为包括已通过合成编码抗体的DNA分子或确定抗体的氨基酸序列产生的抗体，所述DNA分子表达抗体蛋白、其中DNA或氨基酸序列已使用本领域可用且众所周知的合成DNA或氨基酸序列技术获得。
本发明提供了一种抗新型冠状病毒的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含SEQ ID NO.1-3、SEQ ID NO.5-7、SEQ ID NO.9-11、SEQ ID NO.13-15、SEQ ID NO.17-19、SEQ ID NO.21-23、SEQ ID NO.25-27、SEQ ID NO.29-31、SEQ ID NO.33-35、SEQ ID NO.37-39、SEQ ID NO.41-43、SEQ ID NO.45-47、SEQ ID  NO.49-51、SEQ ID NO.53-55、SEQ ID NO.57-59、SEQ ID NO.61-63、SEQ ID NO.65-67、SEQ ID NO.69-71、SEQ ID NO.73-75、SEQ ID NO.77-79、SEQ ID NO.81-83、SEQ ID NO.85-87、SEQ ID NO.89-91、SEQ ID NO.93-95、SEQ ID NO.97-99、SEQ ID NO.101-103、SEQ ID NO.105-107、SEQ ID NO.109-111、SEQ ID NO.113-115、SEQ ID NO.117-119、SEQ ID NO.121-123、SEQ ID NO.125-127所示的氨基酸序列或与其具有至少80％同源性的氨基酸序列所代表的CDR中的至少一个。
进一步，本发明所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含重链可变区中的一个或多个CDR，和/或轻链可变区的一个或多个CDR；
其中，重链可变区的CDR包含选自SEQ ID NO.1-3、SEQ ID NO.9-11、SEQ ID NO.17-19、SEQ ID NO.25-27、SEQ ID NO.33-35、SEQ ID NO.41-43、SEQ ID NO.49-51、SEQ ID NO.57-59、SEQ ID NO.65-67、SEQ ID NO.73-75、SEQ ID NO.81-83、SEQ ID NO.89-91、SEQ ID NO.97-99、SEQ ID NO.105-107、SEQ ID NO.113-115、SEQ ID NO.121-123中的至少一个所示或与其具有至少80％同源性的氨基酸序列；
轻链可变区的CDR包含选自SEQ ID NO.5-7、SEQ ID NO.13-15、SEQ ID NO.21-23、SEQ ID NO.29-31、SEQ ID NO.37-39、SEQ ID NO.45-47、SEQ ID NO.53-55、SEQ ID NO.61-63、SEQ ID NO.69-71、SEQ ID NO.77-79、SEQ ID NO.85-87、SEQ ID NO.93-95、SEQ ID NO.101-103、SEQ ID NO.109-111、SEQ ID NO.117-119、SEQ ID NO.125-127中的至少一个所示或与其具有至少80％同源性的氨基酸序列。
更进一步，本发明所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，重链可变区的CDR包含选自SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.41、SEQ ID NO.49、SEQ ID NO.57、SEQ ID NO.65、SEQ ID NO.73、SEQ ID NO.81、SEQ ID NO.89、SEQ ID NO.97、SEQ ID NO.105、SEQ ID NO.113、SEQ ID NO.121所示的CDR1；
重链可变区的CDR包含选自SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.50、SEQ ID NO.58、SEQ ID NO.66、SEQ ID NO.74、SEQ ID NO.82、SEQ ID NO.90、SEQ ID NO.98、 SEQ ID NO.106、SEQ ID NO.114、SEQ ID NO.122所示的CDR2；
重链可变区的CDR包含选自SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.43、SEQ ID NO.51、SEQ ID NO.59、SEQ ID NO.67、SEQ ID NO.75、SEQ ID NO.83、SEQ ID NO.91、SEQ ID NO.99、SEQ ID NO.107、SEQ ID NO.115、SEQ ID NO.123所示的CDR3；
轻链可变区的CDR包含选自SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.37、SEQ ID NO.45、SEQ ID NO.53、SEQ ID NO.61、SEQ ID NO.69、SEQ ID NO.77、SEQ ID NO.85、SEQ ID NO.93、SEQ ID NO.101、SEQ ID NO.109、SEQ ID NO.117、SEQ ID NO.125所示的CDR1；
轻链可变区的CDR包含选自SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.54、SEQ ID NO.62、SEQ ID NO.70、SEQ ID NO.78、SEQ ID NO.86、SEQ ID NO.94、SEQ ID NO.102、SEQ ID NO.110、SEQ ID NO.118、SEQ ID NO.126所示的CDR2；
轻链可变区的CDR包含选自SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.47、SEQ ID NO.55、SEQ ID NO.63、SEQ ID NO.71、SEQ ID NO.79、SEQ ID NO.87、SEQ ID NO.95、SEQ ID NO.103、SEQ ID NO.111、SEQ ID NO.119、SEQ ID NO.127所示的CDR3。
在本发明的具体实施方案中，所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含SEQ ID NO.1-3所示的重链可变区CDR1-3、SEQ ID NO.5-7所示的轻链可变区CDR1-3。
在本发明的具体实施方案中，所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含SEQ ID NO.9-11所示的重链可变区CDR1-3、SEQ ID NO.13-15所示的轻链可变区CDR1-3。
在本发明的具体实施方案中，所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含SEQ ID NO.17-19所示的重链可变区CDR1-3、SEQ ID NO.21-23所示的轻链可变区CDR1-3。
在本发明的具体实施方案中，所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含SEQ ID NO.25-27所示的重链可变区CDR1-3、SEQ ID NO.29-31所示的轻链可变区CDR1-3。
在本发明的具体实施方案中，所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含SEQ ID NO.33-35所示的重链可变区CDR1-3、SEQ ID NO.37-39所示的轻链可变区CDR1-3。
在本发明的具体实施方案中，所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含SEQ ID NO.41-43所示的重链可变区CDR1-3、SEQ ID NO.45-47所示的轻链可变区CDR1-3。
在本发明的具体实施方案中，所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含SEQ ID NO.49-51所示的重链可变区CDR1-3、SEQ ID NO.53-55所示的轻链可变区CDR1-3。
在本发明的具体实施方案中，所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含SEQ ID NO.57-59所示的重链可变区CDR1-3、SEQ ID NO.61-63所示的轻链可变区CDR1-3。
在本发明的具体实施方案中，所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含SEQ ID NO.65-67所示的重链可变区CDR1-3、SEQ ID NO.69-71所示的轻链可变区CDR1-3。
在本发明的具体实施方案中，所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含SEQ ID NO.73-75所示的重链可变区CDR1-3、SEQ ID NO.77-79所示的轻链可变区CDR1-3。
在本发明的具体实施方案中，所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含SEQ ID NO.81-83所示的重链可变区CDR1-3、SEQ ID NO.85-87所示的轻链可变区CDR1-3。
在本发明的具体实施方案中，所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含SEQ ID NO.89-91所示的重链可变区CDR1-3、SEQ ID NO.93-95所示的轻链可变区CDR1-3。
在本发明的具体实施方案中，所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含SEQ ID NO.97-99所示的重链可变区CDR1-3、SEQ ID NO.101-103所示的轻链可变区CDR1-3。
在本发明的具体实施方案中，所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含SEQ ID NO.105-107所示的重链可变区CDR1-3、SEQ ID NO.109-111所示的轻链 可变区CDR1-3。
在本发明的具体实施方案中，所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含SEQ ID NO.113-115所示的重链可变区CDR1-3、SEQ ID NO.117-119所示的轻链可变区CDR1-3。
在本发明的具体实施方案中，所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含SEQ ID NO.121-123所示的重链可变区CDR1-3、SEQ ID NO.125-127所示的轻链可变区CDR1-3。
本发明所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含重链可变区，和/或轻链可变区，其中，重链可变区包含选自SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.52、SEQ ID NO.60、SEQ ID NO.68、SEQ ID NO.76、SEQ ID NO.84、SEQ ID NO.92、SEQ ID NO.100、SEQ ID NO.108、SEQ ID NO.116、SEQ ID NO.124所示的氨基酸序列或与其具有至少80％同源性的氨基酸序列；
轻链可变区包含选自SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.48、SEQ ID NO.56、SEQ ID NO.64、SEQ ID NO.72、SEQ ID NO.80、SEQ ID NO.88、SEQ ID NO.96、SEQ ID NO.104、SEQ ID NO.112、SEQ ID NO.120、SEQ ID NO.128或与其具有至少80％同源性的氨基酸序列。
本发明的新型冠状病毒的单克隆抗体可经PEG化。其中抗体可在重链、轻链或两条链上经PEG化。
术语“聚乙二醇化”、“聚乙二醇”或“PEG”包括聚亚烷基二醇化合物或其衍生物，连同或不连同偶联剂或者用偶联或活化部分(例如用硫醇、三氟甲磺酸盐(triflate)、三氟乙磺酸盐(tresylate)、氮丙啶、环氧乙烷，或优选用马来酰亚胺部分(例如PEG-马来酰亚胺))的衍生化。其他合适的聚亚烷基二醇化合物包括但不限于，马来酰亚胺单甲氧基PEG、活化PEG聚丙二醇、以及下述类型的带电或中性聚合物：右旋糖、多聚乙酰神经氨酸、或其他基于碳水化合物的聚合物、氨基酸聚合物、以及生物素和其他亲和剂衍生物。
双特异性分子，其包含与第二功能性模块相连的前面所述的单克隆抗体或其 抗原结合部分，该第二功能性模块具有与所述单克隆抗体或其抗原结合部分不同的结合特异性。
单克隆抗体或其抗原结合部分的组合，所述组合选自前面所述的单克隆抗体或其抗原结合部分中的任意两种。
进一步，所述组合中的一种单克隆抗体或其抗原结合部分包含SEQ ID NO.57-59所示的重链可变区CDR1-3、SEQ ID NO.61-63所示的轻链可变区CDR1-3。
更进一步，所述组合中的一种单克隆抗体或其抗原结合部分包含SEQ ID NO.60所示的重链可变区、SEQ ID NO.64所示的轻链可变区。
本发明还提供了编码前面所述的单克隆抗体或其抗原结合部分的分离的、重组的和/或合成的核酸分子。
本发明的核酸分子可含例如通过化学处理产生的合成DNA、cDNA、基因组DNA或其任何组合。
在本发明的具体实施方案中，所述核酸分子包含SEQ ID NO.129-160所示的核苷酸序列。
编码本发明的单克隆抗体核苷酸可含前导或信号序列。前导和信号序列可改变，并且可用备选前导序列取代，并且应当理解，在某些实施方案中，本发明的抗体含无前导序列的序列。可使用任何合适的备选前导或信号序列。
本发明还提供了含有前面所述的核酸分子的载体。
本发明还提供含本发明的核酸分子或载体的宿主细胞。
在某些方面，本发明涉及用于产生前面所述的单克隆抗体的方法，其包括在适合于由宿主细胞产生抗体的条件下，培养含上述任何载体的宿主细胞。在一些实施方案中，该方法包括从宿主细胞培养物中回收抗体。
宿主细胞可为例如原核细胞例如大肠杆菌，或其他微生物细胞，或真核细胞包括但不限于哺乳动物细胞，例如人、小鼠、猴、兔、山羊、仓鼠或大鼠细胞，昆虫细胞，禽类细胞，植物细胞和低等真核细胞例如真菌细胞。
在本发明的一些实施方案中，用于实践本发明的宿主细胞可为例如(1)细 菌细胞例如大肠杆菌、新月柄杆菌(Caulobacter crescentus)、链球菌属(Streptococci)、葡萄球菌属(Staphylococci)、链霉菌属(Streptomyces)物种和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)细胞、和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)；(2)真菌细胞和曲霉菌属(Aspergillus)细胞、酵母细胞，例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、栗酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)、其他毕赤酵母属物种、乳酸克鲁维氏酵母(K.lactis)，(3)昆虫细胞系，例如来自草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)的细胞(如Sf9和Sf21细胞系，以及expresSFTM细胞(Protein Sciences Corp.，Meriden，CT，USA))、果蝇属S2细胞，和粉纹叶蛾(Trichoplusia ni)High Cells(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)；(4)哺乳动物细胞，或(5)植物细胞。
一般的哺乳动物细胞包括COS1和COS7细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NSO骨髓瘤细胞、NIH3T3细胞、293细胞、HΕPG2细胞、HeLa细胞、C127、3T3、BHK、Bowes黑素瘤细胞、L细胞、MDCK、HEK293、WI38、鼠类ES细胞系(例如，来自品系129/SV、C57/BL6、DBA-1、129/SVJ)、K562、Jurkat细胞和BW5147。
本发明的抗体能够使用基因重组的方法生产。
首先，制备编码前面所述的抗体的DNA，但也可以为其他碱基序列。DNA的制备能够使用PCR等公知的方法进行。也能够利用化学合成制备该DNA。
将编码所得到的VH或VL的DNA分别插入具有编码抗体的CH或CL的序列的载体，构建抗体表达载体。其中，具有编码抗体的CH或CL的序列的载体能够从市场获得。通过将构建的表达载体导入宿主细胞，得到表达抗体的重组细胞。然后，培养该重组细胞，从该培养物获得所期望的抗体。
作为本发明的抗体的纯化方法没有特别限定，能够采用公知的方法。例如，能够回收上述重组细胞的培养上清，组合各种色谱、盐析、透析、膜分离等公知的方法，纯化本发明的抗体。在抗体的同种型为IgG的情况下，也能够利用使用了蛋白A的亲和色谱简便地进行纯化。
评估抗体对抗原的结合能力的标准测定法是本领域公知的，包括例如ELISA、Western印迹和RIA。抗体的结合动力学(例如结合亲和力)也可以通过本领域已知的标准测定法来评估，诸如通过Biacore分析。
本发明还提供了一种抗体衍生物，其包含前面所述的单克隆抗体或其抗原结合部分、以及与其连接的物质。
进一步，所述物质包括诊断剂，可用于本发明的诊断剂包括：放射性核素、造影剂、荧光剂、化学发光剂、生物发光剂、顺磁性离子、酶和光敏诊断剂。
放射性核素包括 110In、 111In、 177Lu、 18F、 52Fe、 62Cu、 64Cu、 67Cu、 67Ga、 68Ga、 86Y、 90Y、 89Zr、 94mTc、 94Tc、 99mTc、 120I、 123I、 124I、 125I、 131I、 154-158Gd、 32F、 11C、 13N、 15O、 186Re、 188Re、 51Mn、 52mMn、 55Co、 72As、 75Br、 76Br、 82mRb、 83Sr或其它γ发射体、β发射体或正电子发射体。
顺磁性离子包括：铬(III)、锰(II)、铁(III)、铁(II)、钴(II)、镍(II)、铜(II)、钕(III)、钐(III)、镱(III)、钆(III)、钒(II)、铽(III)、镝(III)、钬(III)和铒(III)。
荧光标记化合物包括异硫氰酸荧光素、罗丹明、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二甲醛和荧光胺。
化学发光标记化合物包括鲁米诺、异鲁米诺、芳族吖啶酯、咪唑、吖啶盐和草酸酯。
生物发光化合物包括荧光素、荧光素酶和水母发光蛋白。
在另外其他的实施方案中，本发明的抗体与可为标记部分的显像剂缀合。标记剂可为生物素、荧光或发光部分、放射性部分、组氨酸标签或肽标签。
本发明还提供了一种新型冠状病毒检测产品或新型冠状病毒感染诊断产品，其包含前面所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，前面所述的双特异性分子，前面所述的单克隆抗体或其抗原结合部分的组合，或前面所述的抗体衍生物。
所述产品包括利用酶联免疫吸附法、免疫荧光检测法、放射免疫法、发光免疫测定法、胶体金免疫层析法、凝集法、免疫比浊法检测抗原抗体结合的产品。
所述产品的实例可以是试剂盒。
前面所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，前面所述的双特异性分子，前面 所述的单克隆抗体或其抗原结合部分的组合，或前面所述的抗体衍生物可单独或作为试剂盒的部分与标签和施用说明书一起包括在容器、包装或分配器中。
本发明的单克隆抗体或其抗原结合部分可用于检测患者样品中的靶标因此可用作诊断剂。例如，本发明的抗体或其抗原结合部分用于体外测定法，例如，ELISA，以检测患者样品中的靶标水平。
在一个实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合部分固定在固体支持物(例如，微量滴定板的孔)上。固定的抗体或其抗原结合部分用作测试样品中可存在的任何靶标的捕获抗体。将固定的抗体或其抗原结合部分与患者样品接触之前，将固体支持物清洗，和用封闭试剂诸如乳蛋白或白蛋白处理以防止分析物的非特异性吸附。
随后，将孔用疑似含有抗原的测试样品或用含有标准量的抗原的溶液处理。此样品是例如来自疑似具有被认为是病理诊断的循环抗原水平的主体的血清样品。在洗去测试样品或标准品后，固体支持物用可检测标记的第二抗体处理。标记的第二抗体用作检测抗体。测量可检测标记的水平，测试样品中靶抗原的浓度通过与自标准样品产生的标准曲线相比较来测定。
本发明还提供了检测新型冠状病毒的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)提供怀疑存在新型冠状病毒或其NP蛋白的样品；
(2)将样品与前面所述的单克隆抗体或抗原结合部分接触；
(3)检测包含所述单克隆抗体或抗原结合部分与抗原的复合物的形成，存在复合物则指示样品中含有新型冠状病毒或其NP蛋白。
进一步，所述样品包括血液。
本发明还提供了一种新型冠状病毒感染的诊断方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)提供来自怀疑感染新型冠状病毒的个体的样品；
(2)将样品与前面所述的单克隆抗体或抗原结合部分接触；
(3)检测包含所述单克隆抗体或抗原结合部分与抗原的复合物的形成，存 在复合物则指示该个体感染了新型冠状病毒。
进一步，所述样品包括血液。
本发明提供了一种检测生物样品中新型冠状病毒NP蛋白的方法，包括用本发明的前面所述的单克隆抗体或其抗原结合片段与生物样品接触，检测抗体与NP蛋白的结合，以确定样品中的新型冠状病毒是否存在。在一种实施方案中，抗体直接用某种可检测的标记物标记。在另一种实施方案中，抗NP蛋白的抗体(第一抗体)不标记，而第二抗体或其他可结合抗NP蛋白抗体的分子被标记。本领域的专业人员都知道，选择的第二抗体应能特异性结合第一抗体的种属和类别。例如，如果抗NP蛋白的抗体是一种人源IgG，那么第二抗体可以是抗人IgG抗体。能结合抗体的其他分子包括(不限于)蛋白A和蛋白G。
合适的抗体或第二抗体标记物在上文已做了描述，包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料和放射性物质等。合适的酶标记物包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、或乙酰胆碱酯酶等；合适的辅基复合物包括链亲和素/生物素和卵清亲和素/生物素等；合适的荧光材料包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、若丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白等；发光材料有发光氨；合适的放射性物质包括 125I、 131I、 35S或 3H等。
在另一种实施方案中，生物样品中的NP蛋白可以通过竞争免疫试验来检测，即使用以可测物质标记的NP蛋白标准品和未标记的抗NP蛋白的抗体进行试验。在这项试验中，生物样品、标记的NP蛋白标准品和抗NP蛋白抗体混合在一起，测定与未标记的抗体结合的标记的NP蛋白标准品的量。生物样品中的NP蛋白的量与抗NP蛋白抗体结合的标记的NP蛋白标准品的量成反比。
前面所述的单克隆抗体或其抗原结合部分在制备新型冠状病毒检测产品中的应用。
前面所述的单克隆抗体或其抗原结合部分在制备新型冠状病毒感染诊断产品中的应用。
前面所述的双特异性分子在制备新型冠状病毒检测产品中的应用。
前面所述的双特异性分子在制备新型冠状病毒感染诊断产品中的应用。
前面所述的抗体组合在制备新型冠状病毒感染诊断产品中的应用。
前面所述的抗体组合在制备新型冠状病毒检测产品中的应用。
前面所述的抗体衍生物在制备新型冠状病毒检测产品中的应用。
前面所述的抗体衍生物在制备新型冠状病毒感染诊断产品中的应用。
除在这里特别定义的以外，本发明中使用的科学和技术术语其含义与本领域普通技术人员通常所理解的一致。此外，除非上下文需要，本发明中使用的单数名词包括复数含义，复数名词包含单数含义。通常来说，这里描述的细胞组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学、蛋白质和核酸化学的相关术语是本领域中众所周知和常用的。本发明使用的方法和技术除非特别说明基本上是按照本领域中众所周知的常规方法进行的，这些方法在各种普通或专门的参考书籍中都有描述，如Sambrook et al.Molecular Cloning：ALaboratory Manual，2d ed.，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)；Ausubel et al.，Current Protocols in Molecular Biology，Greene PublishingAssociates(1992)；Harlow and Lane Antibodies：A LaboratoryManual Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1990)等。酶促反应和纯化技术按制造商说明书操作，有的是本领域的常规方法，有的在这里做了描述。这里使用的与分析化学、有机合成化学和药物化学相关的名词或实验操作程序都是本领域众所周知的和常用的。化学合成、化学分析、药物制剂、处方、运输和对病人的治疗均采用标准技术。
如本文所用，术语“抗体”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白(Ig)分子的免疫活性部分，即，含有特异性结合抗原(与其免疫反应)的抗原结合位点的分子。“特异性结合”意指抗体与所需抗原的一个或多个抗原决定簇反应和不与其他多肽反应或以低得多的亲和力结合(Kd>10 -6)。抗体包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、结构域抗体、单链、Fab和F(ab')2片段、scFv和Fab表达文库。
基础抗体结构单位已知包含四聚体。各四聚体由两个相同的多肽链对构成，每一对具有一个“轻”链(约25kDa)和一个“重”链(约50-70kDa)。各链的氨基末端部分包括约100-110或更多个氨基酸的可变区，其主要负责抗原识别。各链的羧基末端部分限定了恒定区，其主要负责效应子功能。通常，获得自人的抗体分子涉及类别IgG、IgM、IgA、IgE和IgD中的任一类别，它们彼此不同之处在于 分子中存在的重链的性质。某些类别还具有亚类，诸如IgG1、IgG2和其他。此外，在人中，轻链可以是κ链或λ链。
如本文所用的术语“单克隆抗体”是指仅含有一个分子种类的抗体分子的抗体分子群，所述抗体分子由独特的轻链基因产物和独特的重链基因产物组成。具体而言，单克隆抗体的互补决定区(CDR)在所述群的所有分子中相同。mAb含有能够与抗原的特定表位起免疫反应的抗原结合位点，特征在于对其有独特的结合亲和力。
术语“抗原结合部分”(或简称为“抗体部分”)在用于本文时指一个或多个保留了与抗原特异性结合的能力的抗体片段。已显示抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段行使。术语“抗原结合部分”所涵盖的结合片段的实例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，包含通过铰链区二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)Fd片段，由VH和CH1结构域组成；(iv)Fv片段，由抗体单臂的VL和VH结构域组成；(v)dAb片段(Ward等人(1989)Nature 341:544-546)，由VH结构域组成；和(vi)分离的互补决定区(CDR)。此外，虽然Fv片段的两个结构域，VL和VH由分开的基因编码，但是可以使用重组方法通过合成的接头将它们连接，从而使它们能够制备成单个蛋白链，其中VL和VH区配对形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见例如Bird等人(1988)Science 242:423-426；和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883)。此类单链抗体也意图涵盖在术语“抗原结合部分”中。这些抗体片段可使用本领域技术人员公知的常规技术获得，可以以与完整抗体相同的方式对片段筛选功用。
可通过已知技术来产生识别特定表位的抗原结合部分。如可通过胃蛋白酶消化抗体分子产生F(ab')2片段，以及可通过还原F(ab')2片段的二硫桥产生Fab'片段。或者，可构建Fab'表达文库(Huse等,1989,Science,246:1274-1281)以允许快速和容易鉴定具有所需特异性的单克隆Fab'片段。
单链Fv分子(scFv)包含VL结构域和VH结构域。VL结构域和VH结构域缔合以形成靶标结合位点。这两个结构域由肽接头(L)进一步共价连接。用于制备scFv分子以及设计适合肽接头的方法公开于美国专利号4,704,692；美国专利号4,946,778；R.Raag和M.Whitlow,"Single Chain Fvs."FASEB第9 卷:73-80(1995)以及R.E.Bird和B.W.Walker,"Single Chain Antibody Variable Regions,"TIBTECH,第9卷:132-137(1991)中。
可通过已知方法制备抗体片段，例如如由Goldenberg,美国专利号4,036,945和4,331,647以及其中含有的参考文献所公开。此外，参见Nisonoff等，Arch Biochem.Biophys.89:230(1960)；Porter,Biochem.J.73:119(1959)；Edelman等，METHODS IN ENZYMOLOGY第1卷，第422页(Academic Press 1967)；以及Coligan，第2.8.1-2.8.10以及2.10.-2.10.4页。
应用于多肽时，术语“具有至少80％同源性”意指，两个肽序列当诸如通过程序GAP或BESTFIT使用默认的空位权重最佳比对时，具有至少80％的序列同源性或同一性，在一些实施方案中，具有至少90％的序列同一性，在一些实施方案中共有至少95％的序列同一性，和在一些实施方案中共有至少99％的序列同一性。
术语＂载体＂、意为通过其DNA或RNA序列(例如外源基因)可转入宿主细胞进而转化宿主并促进导入的基因表达(例如转录和翻译)的媒介物。
因此，本发明的另一目的涉及包含本发明核酸的载体。
这种载体可包含调节组成，如启动子、增强子、终止子等，以在施用至受试者时引起或指导所述多肽的表达。在表达载体中使用的用于动物细胞的启动子和增强子的实例包括SV40早期启动子和增强子(Mizukami T.等人1987)、LTR启动子莫洛尼小鼠白血病病毒(Moloney mouse leukemia virus)(Kuwana Y等人1987)的增强子、启动子(Mason JO等人1985)和免疫球蛋白H链增强子(Gillies SD等人1983)等。
可使用任何用于动物细胞的表达载体，只要编码人抗体C区的基因可以插入和表达。合适的载体的实例包括pAGE107(Miyaji H等人1990)、pAGE103(Mizukami T等人1987)、pHSG274(Brady G等人1984)、pKCR(O＇Hare K等人1981)、pSG1βd2-4-(Miyaji H等人1990)等。质粒的其他实例包括包含复制起点的质粒，或整合质粒，如pUC、pcDNA、pBR等。
病毒载体的其他实例包括腺病毒、逆转录病毒、疱疹病毒和AAV载体。这种重组病毒可通过本领域已知的技术产生，如通过转染包装细胞或通过使用复制质粒或病毒的瞬时转染。病毒包装细胞的典型实例包括PA317细胞、PsiCRIP细 胞、GPenv+细胞、293细胞等。用于产生这种复制缺陷性重组病毒的详细方案可例如在WO 95/14785、WO 96/22378、US 5,882,877、US 6,013,516、US 4,861,719、US 5,278,056和WO 94/19478中发现。
术语“Ka”在用于本文时意图指特定抗体－抗原相互作用的结合速率(association rate)，术语“Kd”在用于本文时意图指特定抗体－抗原相互作用的解离速率(dissociation rate)。术语“KD”在用于本文时意图指解离常数，其由Kd与Ka的比值(即Kd/Ka)获得，以摩尔浓度(M)表示。抗体的KD值可以使用本领域公知的方法测定。一种优选的测定抗体KD的方法使用表面等离振子共振(surface plasmon resonance)，更优选使用生物传感器系统，例如系统。
在用于本文时，术语IgG抗体的“高亲和力”指抗体对靶抗原具有10 -8M或更小，更优选10 -9M或更小，甚至更优选10 -10M或更小的KD。但是，“高亲和力”结合对于其它抗体同种型可能有所不同。
附图说明
图1显示本发明的重组SARS-CoV2 NP蛋白的SDS-PAGE图；
图2显示利用间接ELISA检测抗体滴度的结果图；
图3显示利用WB检测抗体与抗原结合的结果图；
图4显示利用SPR检测JS01的亲和活性结果图；
图5显示利用SPR检测JS02的亲和活性结果图；
图6显示利用SPR检测JS03的亲和活性结果图；
图7显示利用SPR检测JS04的亲和活性结果图；
图8显示利用SPR检测JS05的亲和活性结果图；
图9显示利用SPR检测JS06的亲和活性结果图；
图10显示利用SPR检测JS07的亲和活性结果图；
图11显示利用SPR检测JS08的亲和活性结果图；
图12显示利用SPR检测JS09的亲和活性结果图；
图13显示利用SPR检测JS10的亲和活性结果图；
图14显示利用SPR检测JS11的亲和活性结果图；
图15显示利用SPR检测JS12的亲和活性结果图；
图16显示利用SPR检测JS13的亲和活性结果图；
图17显示利用SPR检测JS14的亲和活性结果图；
图18显示利用SPR检测JS15的亲和活性结果图；
图19显示利用SPR检测JS16的亲和活性结果图；
图20显示利用双抗体夹心法检测抗体包被浓度的结果图；
图21显示利用双抗体夹心法检测抗体检测灵敏度的结果图；
图22显示本发明的抗原检测层析条的检测效果图。
具体实施方式
下面通过附图和实施例进一步说明本发明。应该理解的是，本发明的实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。
实施例1抗体筛选
一、重组SARS-CoV2核蛋白(NP)表达
1.1主要试剂
SARS-CoV2 NP基因序列(GenBank序列号:MT066176.1)以及相关引物合成和测序均由通用生物系统(安徽)有限公司完成；E.coli DH5α，BL21(DE3)感受态细胞购自通用生物系统(安徽)有限公司；BamH Ⅰ和Not Ⅰ核酸内切酶购自New England Biolabs(NEB)公司；EX Taq酶购自TaKaRa公司；HRP标记抗人Fc抗体购自Sigma公司；其他化学试剂均为国产分析纯试剂；感染2019-nCoV患者血清由本中心收集及保存，全部为江苏病例。
1.2原核表达质粒构建
设计NP基因原核表达引物，上游引物带BamH Ⅰ酶切位点，下游引物带Not Ⅰ酶切位点。引物序列为：Cov2-NP-F:CGGGATCCTCTGATAATGGACCCCAAAATC；Cov2-NP-R: ATAAGAATGCGGCCGCAGGCCTGAGTTGAGTCAGCAC。使用EX Taq酶扩增NP基因，PCR反应程序为：94℃3min；94℃30s,58℃30s,72℃80s，共30个循环；72℃10min。PCR产物经胶回收约1 300bp目的片段，然后经BamH Ⅰ和Not Ⅰ双酶切后连接pET28a载体，转化E.coli DH5α感受态细胞。次日挑选单菌落测序正确后，提质粒转化原核表达菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞。
1.3 NP表达及纯化
将NP表达菌培养至OD600＝0.6后，加入终浓度0.5mmol/L的IPTG，16℃诱导6h，收集菌体，超声破碎后离心收集包涵体。将包涵体溶于8mol/L尿素中，然后用镍柱亲和层析纯化包涵体蛋白。纯化后梯度减少尿素含量，使蛋白透析复性至PBS中，最后经SDS-PAGE检测蛋白表达及纯化效果。小量表达成功以后即上100L发酵罐进行大量发酵，发酵培养基为TB培养基(1％甘油)，发酵参数为280rpm，通气比为0.5vvm(15L/min)，pH控制在6.8～7.2，罐压0.06MPa～0.1MPa，发酵温度为16℃，培养24h。
SDS-PAGE结果显示：NP全长加上载体中的His tag及其他附带氨基酸，预计蛋白相对分子质量约50×10 3。表达菌经IPTG诱导后，发现在50×10 3左右出现明显的条带，与预计分子量大小一致(图1A)。包涵体溶解后，过镍柱纯化，在150mmol/L咪唑时有明显的洗脱峰。蛋白经透析复性后，经SDS-PAGE发现在同样的位置出现单一蛋白条带(图1B)。此说明NP被成功诱导表达并且纯化后纯度较高。注：图中M：蛋白Makers；1：未诱导的pET28a-NP表达菌；2：IPTG诱导后pET28a-NP重组表达菌；3：纯化后重组核衣壳蛋白。
二、噬菌体文库构建
1、采集COVID-19患者恢复期外周血，从外周血中分离单个核细胞(PBMC)
本项目于2020年2月14日，经过知情同意，从江苏省某市采集5位COVID-19确诊患者出院前外周血各20ml。5位患者为同一传播链，其中一人为武汉归来人员，经过在酒店浴室共浴感染另外3位患者，第5位患者与共浴的3位患者其中之一为同事关系。5人均非重症，经过治疗后分别与2月15日-22日出院居家隔离。使用GE的Ficoll-Paque PLUS，经密度梯度离心法，分离20ml肝素抗凝血中的单个核细胞(PBMC)。
2、PBMC中RNA的提取和cDNA的合成
使用QIAGEN的RNeasy Mini Kit提取PBMC细胞RNA，然后使用罗氏公司的第一链合成试剂盒(Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit，Roche，Cat No.：04896866001)将RNA反转录成cDNA。
3、PCR扩增VK，VL和VH(EX Taq，Takara,Cat No.:DRR001A)
(1)扩增VK&VL体系如表1所示。
表1扩增VK&VL体系
溶液或组分 体积(μL)
cDNA 1
EX Buffer(10x) 5
dNTPs(10mM each) 4
P1(10μM) 2
P2(10μM) 2
EX Taq 1U/μl 0.3
dH 2O 35.7
(2)扩增重链Fd段体系如表2所示。
表2扩增重链Fd段体系
溶液或组分 体积(μL)
cDNA 2
EX Buffer(10x) 10
dNTPs(10mM each) 8
P1(10μM) 2
P2(10μM) 2
EX Taq 1U/μl 0.6
dH 2O 75.4
(3)反应程序如表3所示。
表3反应程序
Figure PCTCN2020092711-appb-000001
PCR产物过2％琼脂糖凝胶电泳，回收750bp左右的片段。
4、轻链克隆(将VK和VL克隆入pComb3H载体)
VK和VL经Xba Ⅰ和Sac Ⅰ酶切后与同样经Xba Ⅰ和Sac Ⅰ酶切的pComb3H载体连接后，回收连接产物，然后电转XL1-Blue感受态细胞。
电击菌液涂15cm大平皿，次日刮菌，提质粒即为轻链库。此时重组质粒为pComb3H-VK和pComb3H-VL。
5、重链克隆(将VH基因克隆入pComb3H-VK和pComb3H-VL轻链库中)
将轻链库pComb3-L和Fd片段分别经XhoI和SpeI双酶切，与同样经XhoI和SpeI双酶切的pComb3H-VK和pComb3H-VL连接，然后电转即得到抗体文库。
6、抗体库的包装
(1)从-80℃冰箱取出抗体库，冰上融化后取1ml加入10ml A+(20μg/ml)2YT培养基中，37℃200rpm摇1小时；
(2)加100ml A+(100μg/ml)，T+(20μg/ml)2YT培养基，200rpm摇1小时；
(3)加10 12pfu的VCSM13辅助噬菌体，37℃静置20min，200rpm摇2小时；
(4)加终浓度70μg/ml卡那30℃200rpm摇过夜；
(5)次日6000rpm离心20min，倒出上清，加入4％PEG8000(4g)和3％NaCl(3g)，混匀，置于冰上30min以上；
(6)分装于50ml离心管中9000rpm离心25min，弃去上清，控干，沉淀用1ml PBS重悬即为包装文库。
三、噬菌体文库筛选
1、将重组SARS-CoV2核蛋白(NP)包被于免疫管中，按50μg/管包被3管，于4℃放置过夜，次日用2％脱脂牛奶封闭免疫管1h。
2、向免疫管中加1.75ml含2％脱脂牛奶的PBS和250μl噬菌体文库，37℃摇1h，再37℃静置1h。
3、倒去噬菌体文库，用PBST洗20次，每次摇5min。
4、用1ml pH＝2.2的Gly-HCl洗脱免疫管，室温静置5min，再37℃摇5min，然后吸至1.5ml EP管中，加入57μl 2M Tris中和至pH＝7。
5、将洗脱液转移至一个新的50ml离心管中，立即加入10ml OD＝1的新鲜XL1-Blue，混匀后37℃孵育30min，加入10ml 2YT(Amp 100μg/ml，Tet 20μg/ml)。
6、取10μl菌液用来测洗脱库容量，剩下20ml培养基倒入500ml三角瓶，230rpm摇1h。
7、加入130ml 2YT(Amp 100ug/ml，Tet 20μg/ml)，230rpm摇1h。
8、加入MOI＝20的辅助噬菌体，37℃静置孵育30min。
9、3000g 10min离心，重悬沉淀至150ml 2YT(Amp 100μg/ml，Tet 20μg/ml)中，37℃，230rpm摇2h。
10、加入110μl 70mg/ml卡那霉素，30℃230rpm过夜。次日再加1/5体积的PEG-NaCl(40ml)，混匀后冰浴至少1h，然后10000g 4℃离心20min，沉淀重悬于2-3ml PBS中，瞬时离心去除杂菌，过0.45μm滤器后用于下一轮筛选。
11、重复上述筛选步骤3次，以达到对噬菌体文库富集筛选的目的。
12、第三轮富集完以后，挑选2*96个克隆。经IPTG诱导后，次日进行ELSA检测。
四、ELISA检测2*96个克隆的结合特异性
1、分别包被2块抗人Fab抗体(1:3000)和2块NP蛋白(2μg/ml)，于4℃包被过夜。
2、次日用3％脱脂牛奶封闭1h，然后加入50μl诱导上清和50μl脱脂牛奶， 37℃孵育1h，PBST洗涤。
3、4块板均加入HRP标记的抗人Fab抗体(1:3000)，37℃孵育1h，PBST洗涤后，TMB显色。
经筛选共获得178株能与NP特异性结合的噬菌体抗体片段，该片段为人源的Fab段，包括轻链全长及重链的Fd段。将178个单菌落扩增后送测序，共获得159株轻重链齐全的合格序列。
实施例2全抗体的表达及相关功能验证
从获得的159株抗体中最终选定16株抗体用于全抗体的表达及相关功能验证，将此16株抗体命名为JS01～JS16。
其中，JS01抗体序列如下所示：
重链可变区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
重链可变区CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
重链可变区CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；
轻链可变区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；
轻链可变区CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；
轻链可变区CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，核酸序列如SEQ ID NO.129所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，核酸序列如SEQ ID NO.130所示。
其中，JS02抗体序列如下所示：
重链可变区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示；
重链可变区CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示；
重链可变区CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示；
轻链可变区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示；
轻链可变区CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示；
轻链可变区CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示；
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示，核酸序列如SEQ ID NO.131所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示，核酸序列如SEQ ID NO.132所示。
其中，JS03抗体序列如下所示：
重链可变区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示；
重链可变区CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示；
重链可变区CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.19所示；
轻链可变区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.21所示；
轻链可变区CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.22所示；
轻链可变区CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.23所示；
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.20所示，核酸序列如SEQ ID NO.133所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.24所示，核酸序列如SEQ ID NO.134所示。
其中，JS04抗体序列如下所示：
重链可变区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.25所示；
重链可变区CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.26所示；
重链可变区CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.27所示；
轻链可变区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.29所示；
轻链可变区CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.30所示；
轻链可变区CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.31所示；
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.28所示，核酸序列如SEQ ID NO.135所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.32所示，核酸序列如SEQ ID NO.136所示。
其中，JS05抗体序列如下所示：
重链可变区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.33所示；
重链可变区CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.34所示；
重链可变区CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.35所示；
轻链可变区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.37所示；
轻链可变区CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.38所示；
轻链可变区CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.39所示；
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.36所示，核酸序列如SEQ ID NO.137所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.40所示，核酸序列如SEQ ID NO.138所示。
其中，JS06抗体序列如下所示：
重链可变区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.41所示；
重链可变区CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.42所示；
重链可变区CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.43所示；
轻链可变区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.45所示；
轻链可变区CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.46所示；
轻链可变区CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.47所示；
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.44所示，核酸序列如SEQ ID NO.139所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.48所示，核酸序列如SEQ ID NO.140所示。
其中，JS07抗体序列如下所示：
重链可变区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.49所示；
重链可变区CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.50所示；
重链可变区CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.51所示；
轻链可变区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.53所示；
轻链可变区CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.54所示；
轻链可变区CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.55所示；
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.52所示，核酸序列如SEQ ID NO.141所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.56所示，核酸序列如SEQ ID NO.142所示。
其中，JS08抗体序列如下所示：
重链可变区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.57所示；
重链可变区CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.58所示；
重链可变区CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.59所示；
轻链可变区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.61所示；
轻链可变区CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.62所示；
轻链可变区CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.63所示；
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.60所示，核酸序列如SEQ ID NO.143所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.64所示，核酸序列如SEQ ID NO.144所示。
其中，JS09抗体序列如下所示：
重链可变区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.65所示；
重链可变区CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.66所示；
重链可变区CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.67所示；
轻链可变区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.69所示；
轻链可变区CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.70所示；
轻链可变区CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.71所示；
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.68所示，核酸序列如SEQ ID NO.145所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.72所示，核酸序列如SEQ ID NO.146所示。
其中，JS10抗体序列如下所示：
重链可变区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.73所示；
重链可变区CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.74所示；
重链可变区CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.75所示；
轻链可变区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.77所示；
轻链可变区CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.78所示；
轻链可变区CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.79所示；
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.76所示，核酸序列如SEQ ID  NO.147所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.80所示，核酸序列如SEQ ID NO.148所示。
其中，JS11抗体序列如下所示：
重链可变区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.81所示；
重链可变区CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.82所示；
重链可变区CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.83所示；
轻链可变区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.85所示；
轻链可变区CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.86所示；
轻链可变区CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.87所示；
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.84所示，核酸序列如SEQ ID NO.149所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.88所示，核酸序列如SEQ ID NO.150所示。
其中，JS12抗体序列如下所示：
重链可变区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.89所示；
重链可变区CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.90所示；
重链可变区CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.91所示；
轻链可变区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.93所示；
轻链可变区CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.94所示；
轻链可变区CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.95所示；
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.92所示，核酸序列如SEQ ID NO.151所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.96所示，核酸序列如SEQ ID NO.152所示。
其中，JS13抗体序列如下所示：
重链可变区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.97所示；
重链可变区CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.98所示；
重链可变区CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.99所示；
轻链可变区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.101所示；
轻链可变区CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.102所示；
轻链可变区CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.103所示；
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.100所示，核酸序列如SEQ ID NO.153所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.104所示，核酸序列如SEQ ID NO.154所示。
其中，JS14抗体序列如下所示：
重链可变区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.105所示；
重链可变区CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.106所示；
重链可变区CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.107所示；
轻链可变区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.109所示；
轻链可变区CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.110所示；
轻链可变区CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.111所示；
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.108所示，核酸序列如SEQ ID NO.155所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.112所示，核酸序列如SEQ ID NO.156所示。
其中，JS15抗体序列如下所示：
重链可变区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.113所示；
重链可变区CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.114所示；
重链可变区CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.115所示；
轻链可变区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.117所示；
轻链可变区CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.118所示；
轻链可变区CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.119所示；
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.116所示，核酸序列如SEQ ID NO.157所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.120所示，核酸序列如SEQ ID NO.158所示。
其中，JS16抗体序列如下所示：
重链可变区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.121所示；
重链可变区CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.122所示；
重链可变区CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.123所示；
轻链可变区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.125所示；
轻链可变区CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.126所示；
轻链可变区CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.127所示；
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.124所示，核酸序列如SEQ ID NO.159所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.128所示，核酸序列如SEQ ID NO.160所示。
1、全抗体表达
将上述16株人源抗体，构建成IgG形式人源全分子抗体，并在293F细胞中表达，用Protein A纯化后备用。
2、ELISA检测16株抗体与重组NP结合特异性
将重组NP用PBS按1μg/ml浓度包被ELISA板，将所有抗体浓度稀释到1mg/ml，然后从1:10000开始倍比稀释，37℃孵育30min。然后PBST洗3次，加入HRP标记的抗人IgG(1:5000)，37℃孵育30min后PBST洗3次，然后TMB显色，终止后读取OD450吸光度值。
采用间接ELISA检测16株NP抗体的稀释滴度，阴性对照的平均OD值为0.119，标准差为0.132，因此将cutoff值定义为
Figure PCTCN2020092711-appb-000002
由此判断16株抗体的检测滴度为1:80000～1:1280000之间(图2)。
3、16株抗体与纯化NP的Western Blot结果
将1μg重组NP经SDS-PAGE电泳后，转印至PVDF膜中，用上述16种抗体(0.5μg/ml)37℃孵育1h，用PBST洗涤3次，然后用HRP标记的抗人IgG(1:5000)孵育30min，PBST洗涤3次，然后用DAB之间在膜上显色。
WB实验结果显示16株抗体均能特异性结合重组表达的核蛋白(NP)，并在50kDa处出现明显的显色带，此提示该组抗体全部为线性表位的抗体(图3)。
4、抗体亲和活性检测
抗体亲和力测定由Biacore T200工作站完成，具体按以下步骤进行：首先使 用氨基偶联活化剂NHS和EDC以10μl/min 300s活化CM5芯片，然后用10mM醋酸钠缓冲液(pH5.5)将重组表达的SARS-CoV-2NP稀释到1ug/mL，以10μl/min流经芯片30s使响应值(Response units,RUs)达到600左右，最后设置10μl/min、420s，进样乙醇胺对芯片表面剩余活化位点进行封闭。系列稀释的抗体，在25℃时以30μl/min流速依次进样，每测定一次浓度以后用pH 2.0的甘氨酸-盐酸再生CM5芯片，然后进行下个浓度检测。实验结束后，利用Biacore T200 Evaluation Software软件全局拟合曲线来获得结合亲和力。
实验结果如图4-19所示，JS01-JS16可高效结合SARS-CoV-2 NP蛋白，亲和活性相关参数见表4。
表4抗体亲和力参数
抗体名称 配体偶联量 ka(1/Ms) Kd(1/s) KD(M)
JS01 102RU 2.18E+06 4.79E-04 2.20E-10
JS02 162RU 9.12E+05 5.83E-05 6.39E-11
JS03 102RU 8.97E+05 2.12E-04 2.36E-10
JS04 162RU 7.15E+04 1.91E-04 2.67E-09
JS05 162RU 5.94E+05 2.43E-04 4.09E-10
JS06 136RU 1.61E+05 0.002576 1.61E-08
JS07 110RU 1.44E+06 1.78E-04 1.24E-10
JS08 162RU 3.03E+04 5.77E-06 1.90E-10
JS09 129RU 6.89E+05 4.79E-05 6.94E-11
JS10 136RU 1.47E+06 2.99E-04 2.04E-10
JS11 110RU 1.93E+05 5.62E-05 2.92E-10
JS12 110RU 4.88E+05 7.33E-05 1.50E-10
JS13 110RU 8.05E+05 9.66E-05 1.20E-10
JS14 136RU 1.24E+06 2.21E-04 1.78E-10
JS15 110RU 7.72E+04 1.22E-04 1.58E-09
JS16 136RU 2.68E+05 4.01E-05 1.50E-10
5、抗体配对实验
5.1抗体包被浓度的确定
(1)将100μl JS12抗体从5μg/ml开始倍比稀释到0.0024μg/ml共稀释12个稀释度，然后包被于ELISA板中。4℃包被过夜，次日用1％BSA封闭2h，PBST洗3次。
(2)向每个包被浓度的第一孔加入50ng的重组NP，然后倍比稀释到0.39ng/孔，共8个稀释度，37℃孵育1h，PBST洗3次。
(3)加入1:1000稀释HRP标记的JS08，37℃孵育1h，PBST洗3次，TMB显色后读取OD450nm吸光度值。
由图20的曲线可以看出，包被抗体的量对检测灵敏性有影响，从5μg/ml到0.00245μg/ml的包被量看来，影响不大，检测NP抗原的灵敏性看小于3.9ng/ml。因此，后续配对实验，我们均选择2μg/ml浓度作为抗体包被量，用1:4000作为酶标抗体的稀释度。
5.2双抗夹心法检测NP
(1)将16株NP抗体JS01～JS16按2μg/ml浓度包被ELISA板，于4℃包被过夜，次日用1％BSA封闭2h，PBST洗3次。
(2)加入0.1μg/ml重组NP蛋白，然后倍比稀释至0.78ng/ml，共8个稀释度，37℃孵育1h，PBST洗3次。
(3)加入HRP标记的JS08(1:1000)，37℃孵育1h，PBST洗3次，TMB显色，读取OD450nm吸光度值。
由图21可见，酶标的JS08不能与JS06，JS11和JS08自身配对，而与其他13株NP抗体均可配对用于双抗夹心法检测NP。其中JS08与JS16配对效果最好，其检测限可达0.78ng/ml以下，其他配对抗体检测限在12.5-1.56ng/ml之间。
6、双抗体夹心免疫层析法检测重组NP的灵敏度
将抗JS08单抗包被在硝酸纤维素膜上形成T线，抗人IgG抗体标记至C线处。NP蛋白系列稀释后加50μL于样本孔中，样本孔下的结合垫上的标有色微球的JS01～JS16抗体与NP形成免疫复合物，然后通过层析作用迁移至T线处， 与此处标记抗体结合固定，形成有色T线。多余的人源单抗再继续迁移至C线处，与抗人抗体结合，形成C线。以此来测定对NP的结合灵敏度。
采用有色微球标记JS08抗体与13株抗体分别配对，制成抗原检测层析条。用2ng/ml的重组NP验证试纸条，从结果可见全部层析条均可见明显的检测T线，而质控C线也非常明显(图22)。这说明13对抗体组合均可用于检测新冠状病毒的核蛋白，且检测限小于2ng/ml。
虽然以上仅描述了本发明的具体实施方式范例，但是本领域的技术人员应当理解，这些仅是举例说明，本发明的保护范围是由所附权利要求书限定的。本领域的技术人员在不背离本发明的原理和实质的前提下，可以对这些实施方式做出多种变更或修改，但这些变更或修改均落入本发明的保护范围。

Claims (44)

  1. 一种抗新型冠状病毒的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含SEQ ID NO.1-3、SEQ ID NO.5-7、SEQ ID NO.9-11、SEQ ID NO.13-15、SEQ ID NO.17-19、SEQ ID NO.21-23、SEQ ID NO.25-27、SEQ ID NO.29-31、SEQ ID NO.33-35、SEQ ID NO.37-39、SEQ ID NO.41-43、SEQ ID NO.45-47、SEQ ID NO.49-51、SEQ ID NO.53-55、SEQ ID NO.57-59、SEQ ID NO.61-63、SEQ ID NO.65-67、SEQ ID NO.69-71、SEQ ID NO.73-75、SEQ ID NO.77-79、SEQ ID NO.81-83、SEQ ID NO.85-87、SEQ ID NO.89-91、SEQ ID NO.93-95、SEQ ID NO.97-99、SEQ ID NO.101-103、SEQ ID NO.105-107、SEQ ID NO.109-111、SEQ ID NO.113-115、SEQ ID NO.117-119、SEQ ID NO.121-123、SEQ ID NO.125-127所示的氨基酸序列或与其具有至少80％同源性的氨基酸序列所代表的CDR中的至少一个。
  2. 根据权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含重链可变区中的一个或多个CDR，和/或轻链可变区的一个或多个CDR；
    其中，重链可变区的CDR包含选自SEQ ID NO.1-3、SEQ ID NO.9-11、SEQ ID NO.17-19、SEQ ID NO.25-27、SEQ ID NO.33-35、SEQ ID NO.41-43、SEQ ID NO.49-51、SEQ ID NO.57-59、SEQ ID NO.65-67、SEQ ID NO.73-75、SEQ ID NO.81-83、SEQ ID NO.89-91、SEQ ID NO.97-99、SEQ ID NO.105-107、SEQ ID NO.113-115、SEQ ID NO.121-123中的至少一个所示或与其具有至少80％同源性的氨基酸序列；
    轻链可变区的CDR包含选自SEQ ID NO.5-7、SEQ ID NO.13-15、SEQ ID NO.21-23、SEQ ID NO.29-31、SEQ ID NO.37-39、SEQ ID NO.45-47、SEQ ID NO.53-55、SEQ ID NO.61-63、SEQ ID NO.69-71、SEQ ID NO.77-79、SEQ ID NO.85-87、SEQ ID NO.93-95、SEQ ID NO.101-103、SEQ ID NO.109-111、SEQ ID NO.117-119、SEQ ID NO.125-127中的至少一个所示或与其具有至少80％同源性的氨基酸序列。
  3. 根据权利要求2所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，重链可变区的CDR包含选自SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.25、SEQ ID  NO.33、SEQ ID NO.41、SEQ ID NO.49、SEQ ID NO.57、SEQ ID NO.65、SEQ ID NO.73、SEQ ID NO.81、SEQ ID NO.89、SEQ ID NO.97、SEQ ID NO.105、SEQ ID NO.113、SEQ ID NO.121所示的CDR1；
    重链可变区的CDR包含选自SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.50、SEQ ID NO.58、SEQ ID NO.66、SEQ ID NO.74、SEQ ID NO.82、SEQ ID NO.90、SEQ ID NO.98、SEQ ID NO.106、SEQ ID NO.114、SEQ ID NO.122所示的CDR2；
    重链可变区的CDR包含选自SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.43、SEQ ID NO.51、SEQ ID NO.59、SEQ ID NO.67、SEQ ID NO.75、SEQ ID NO.83、SEQ ID NO.91、SEQ ID NO.99、SEQ ID NO.107、SEQ ID NO.115、SEQ ID NO.123所示的CDR3；
    轻链可变区的CDR包含选自SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.37、SEQ ID NO.45、SEQ ID NO.53、SEQ ID NO.61、SEQ ID NO.69、SEQ ID NO.77、SEQ ID NO.85、SEQ ID NO.93、SEQ ID NO.101、SEQ ID NO.109、SEQ ID NO.117、SEQ ID NO.125所示的CDR1；
    轻链可变区的CDR包含选自SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.54、SEQ ID NO.62、SEQ ID NO.70、SEQ ID NO.78、SEQ ID NO.86、SEQ ID NO.94、SEQ ID NO.102、SEQ ID NO.110、SEQ ID NO.118、SEQ ID NO.126所示的CDR2；
    轻链可变区的CDR包含选自SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.47、SEQ ID NO.55、SEQ ID NO.63、SEQ ID NO.71、SEQ ID NO.79、SEQ ID NO.87、SEQ ID NO.95、SEQ ID NO.103、SEQ ID NO.111、SEQ ID NO.119、SEQ ID NO.127所示的CDR3。
  4. 根据权利要求3所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含含有SEQ ID NO.1-3所示的重链可变区CDR1-3、SEQ ID NO.5-7所示的轻链可变区CDR1-3。
  5. 根据权利要求3所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含含有SEQ ID NO.9-11所示的重链可变区CDR1-3、SEQ ID NO.13-15所示的轻链可变区CDR1-3。
  6. 根据权利要求3所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含含有SEQ ID NO.17-19所示的重链可变区CDR1-3、SEQ ID NO.21-23所示的轻链可变区CDR1-3。
  7. 根据权利要求3所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含含有SEQ ID NO.25-27所示的重链可变区CDR1-3、SEQ ID NO.29-31所示的轻链可变区CDR1-3。
  8. 根据权利要求3所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含含有SEQ ID NO.33-35所示的重链可变区CDR1-3、SEQ ID NO.37-39所示的轻链可变区CDR1-3。
  9. 根据权利要求3所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含含有SEQ ID NO.41-43所示的重链可变区CDR1-3、SEQ ID NO.45-47所示的轻链可变区CDR1-3。
  10. 根据权利要求3所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含含有SEQ ID NO.49-51所示的重链可变区CDR1-3、SEQ ID NO.53-55所示的轻链可变区CDR1-3。
  11. 根据权利要求3所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含含有SEQ ID NO.57-59所示的重链可变区CDR1-3、SEQ ID NO.61-63所示的轻链可变区CDR1-3。
  12. 根据权利要求3所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含含有SEQ ID NO.65-67所示的重链可变区CDR1-3、SEQ ID NO.69-71所示的轻链可变区CDR1-3。
  13. 根据权利要求3所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含含有SEQ ID NO.73-75所示的重链可变区CDR1-3、SEQ ID NO.77-79所示的轻链可变区CDR1-3。
  14. 根据权利要求3所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含含有SEQ ID NO.81-83所示的重链可变区CDR1-3、SEQ ID NO.85-87所示的轻链可变区CDR1-3。
  15. 根据权利要求3所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含含有SEQ ID NO.89-91所示的重链可变区CDR1-3、SEQ ID NO.93-95所示的轻链可变区 CDR1-3。
  16. 根据权利要求3所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含含有SEQ ID NO.97-99所示的重链可变区CDR1-3、SEQ ID NO.101-103所示的轻链可变区CDR1-3。
  17. 根据权利要求3所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含含有SEQ ID NO.105-107所示的重链可变区CDR1-3、SEQ ID NO.109-111所示的轻链可变区CDR1-3。
  18. 根据权利要求3所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含含有SEQ ID NO.113-115所示的重链可变区CDR1-3、SEQ ID NO.117-119所示的轻链可变区CDR1-3。
  19. 根据权利要求3所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含含有SEQ ID NO.121-123所示的重链可变区CDR1-3、SEQ ID NO.125-127所示的轻链可变区CDR1-3。
  20. 根据权利要求1-3中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含重链可变区，和/或轻链可变区，其中，重链可变区包含选自SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.52、SEQ ID NO.60、SEQ ID NO.68、SEQ ID NO.76、SEQ ID NO.84、SEQ ID NO.92、SEQ ID NO.100、SEQ ID NO.108、SEQ ID NO.116、SEQ ID NO.124所示的氨基酸序列或与其具有至少80％同源性的氨基酸序列；
    轻链可变区包含选自SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.48、SEQ ID NO.56、SEQ ID NO.64、SEQ ID NO.72、SEQ ID NO.80、SEQ ID NO.88、SEQ ID NO.96、SEQ ID NO.104、SEQ ID NO.112、SEQ ID NO.120、SEQ ID NO.128或与其具有至少80％同源性的氨基酸序列。
  21. 双特异性分子，其包含与第二功能性模块相连的权利要求1-20中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，该第二功能性模块具有与所述单克隆抗体或其抗原结合部分不同的结合特异性。
  22. 单克隆抗体或其抗原结合部分的组合，其特征在于，所述组合选自权利要求1-20中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合部分中的任意两种。
  23. 根据权利要求22所述的组合，其特征在于，所述组合中的一种单克隆抗体或其抗原结合部分包含SEQ ID NO.57-59所示的重链可变区CDR1-3、SEQ ID NO.61-63所示的轻链可变区CDR1-3。
  24. 根据权利要求23所述的组合，其特征在于，所述组合中的一种单克隆抗体或其抗原结合部分包含SEQ ID NO.60所示的重链可变区、SEQ ID NO.64所示的轻链可变区。
  25. 分离的核酸分子，其编码权利要求1-20中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合部分。
  26. 根据权利要求25所述的核酸分子，其包含SEQ ID NO.129-160所示的核苷酸序列。
  27. 包含权利要求25或26所述的核酸分子的载体。
  28. 包含权利要求27所述的载体的宿主细胞。
  29. 用于产生新型冠状病毒的单克隆抗体的方法，其包括在适合于宿主细胞产生单克隆抗体的条件下，培养权利要求28所述的宿主细胞。
  30. 一种抗体衍生物，其包含权利要求1-20中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，以及与其连接的物质。
  31. 根据权利要求30所述的抗体衍生物，其特征在于，所述物质包括诊断剂，所述诊断剂包括放射性核素、造影剂、荧光剂、化学发光剂、生物发光剂、顺磁性离子、酶、光敏诊断剂。
  32. 一种新型冠状病毒检测产品或新型冠状病毒感染诊断产品，其包含权利要求1-20中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，权利要求21所述的双特异性分子，或权利要求22-24中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合部分的组合。
  33. 根据权利要求32所述的产品，其特征在于，所述产品包括利用酶联免疫吸附法、免疫荧光检测法、放射免疫法、发光免疫测定法、胶体金免疫层析法、凝集法、免疫比浊法检测抗原抗体结合的产品。
  34. 一种检测新型冠状病毒或其NP蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
    (1)提供怀疑存在新型冠状病毒或其NP蛋白的样品；
    (2)将样品与权利要求1-20中任一项所述的单克隆抗体或抗原结合部分接触；
    (3)检测包含所述单克隆抗体或抗原结合部分与抗原的复合物的形成，存在复合物则指示样品中含有新型冠状病毒或其NP蛋白。
  35. 根据权利要求34所述的方法，其特征在于，所述样品包括血液。
  36. 一种新型冠状病毒感染的诊断方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
    (1)提供来自怀疑感染新型冠状病毒的个体的样品；
    (2)将样品与权利要求1-20中任一项所述的单克隆抗体或抗原结合部分接触；
    (3)检测包含所述单克隆抗体或抗原结合部分与抗原的复合物的形成，存在复合物则指示该个体感染了新型冠状病毒。
  37. 根据权利要求36所述的方法，其特征在于，所述样品包括血液。
  38. 权利要求1-20中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合部分在制备新型冠状病毒检测产品中的应用。
  39. 权利要求1-20中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合部分在制备新型冠状病毒感染诊断产品中的应用。
  40. 权利要求21所述的双特异性分子在制备新型冠状病毒检测产品中的应用。
  41. 权利要求21所述的双特异性分子在制备新型冠状病毒感染诊断产品中的应用。
  42. 权利要求22-24中任一项所述的抗体组合在制备新型冠状病毒感染诊断产品中的应用。
  43. 权利要求30或31所述的抗体衍生物在制备新型冠状病毒检测产品中的应用。
  44. 权利要求30或31所述的抗体衍生物在制备新型冠状病毒感染诊断产品中的应用。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115028715A (zh) * 2022-06-23 2022-09-09 生工生物工程（上海）股份有限公司 一种抗新型冠状病毒的抗体或其抗原结合片段、试剂盒及应用
WO2023108936A1 (zh) * 2021-12-14 2023-06-22 杭州安旭生物科技股份有限公司 一种可结合SARS-CoV-2病毒的中和抗体及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019084538A1 (en) * 2017-10-27 2019-05-02 Board Of Regents, The University Of Texas System TUMOR SPECIFIC ANTIBODIES, T CELL RECEPTORS AND METHODS OF IDENTIFICATION THEREOF
CN111024954A (zh) * 2020-03-09 2020-04-17 深圳市易瑞生物技术股份有限公司 联合检测covid-19抗原和抗体的胶体金免疫层析装置及其使用法
CN111153991A (zh) * 2020-02-26 2020-05-15 北京博奥森生物技术有限公司 一种人SARS-CoV-2单克隆抗体及其制备方法和应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019084538A1 (en) * 2017-10-27 2019-05-02 Board Of Regents, The University Of Texas System TUMOR SPECIFIC ANTIBODIES, T CELL RECEPTORS AND METHODS OF IDENTIFICATION THEREOF
CN111153991A (zh) * 2020-02-26 2020-05-15 北京博奥森生物技术有限公司 一种人SARS-CoV-2单克隆抗体及其制备方法和应用
CN111024954A (zh) * 2020-03-09 2020-04-17 深圳市易瑞生物技术股份有限公司 联合检测covid-19抗原和抗体的胶体金免疫层析装置及其使用法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"(non-official translation: Our University Has Successfully Built an Antibody Rapid Testing Technology Platform and Has Obtained New Coronavirus Fully Human Monoclonal Antibodies)", JOURNAL OF CHONGQING MEDICAL UNIVERSITY, 28 March 2020 (2020-03-28) *
ANONYMOUS: "A Covid-19 Antigen Rapid Test Kit Delivered", 9 March 2020 (2020-03-09), XP055872426, Retrieved from the Internet <URL:https://www.genomics.sinica.edu.tw/index.php/en/news/latest-news/613-catching-virus-fast-academia-sinica-discovered-useful-antibodies-for-developing-rapid-immune-based-test-kit-of-sars-cov-2-coronavirus> *
YAN CAI-XIA, LI JIA, SHEN XIN, LUO LI, LI YAN, LI MING-YUAN: "Biological Product Development Strategies for Prevention and Treatment of Coronavirus Disease 2019", SICHUAN DAXUE XUEBAO (YIXUE BAN) - SICHUAN UNIVERSITY. JOURNAL(MEDICAL SCIENCE EDITION), SICHUAN DAXUE, CN, vol. 51, no. 2, 10 March 2020 (2020-03-10), CN , pages 139 - 145, XP055872818, ISSN: 1672-173X, DOI: 10.12182/20200360506 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023108936A1 (zh) * 2021-12-14 2023-06-22 杭州安旭生物科技股份有限公司 一种可结合SARS-CoV-2病毒的中和抗体及其应用
CN115028715A (zh) * 2022-06-23 2022-09-09 生工生物工程（上海）股份有限公司 一种抗新型冠状病毒的抗体或其抗原结合片段、试剂盒及应用
CN115028715B (zh) * 2022-06-23 2023-08-18 生工生物工程（上海）股份有限公司 一种抗新型冠状病毒的抗体或其抗原结合片段、试剂盒及应用

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