JP3536731B2 - ＨＩＶ−１ｐ２４抗原の免疫測定方法及び試薬 - Google Patents
ＨＩＶ−１ｐ２４抗原の免疫測定方法及び試薬Info
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- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ＨＩＶ−１ｐ２４
抗原のサンドイッチ法を用いた免疫測定方法及び該測定
方法に用いる試薬に関する。
抗原のサンドイッチ法を用いた免疫測定方法及び該測定
方法に用いる試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）は、
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）により引き起こされる
疾患群であり、ＨＩＶが血液感染することが明確にされ
て以来、日本全国の血液センターで、輸血用血液のＨＩ
Ｖ抗体スクリーニングが行われている。しかしながら、
ＨＩＶが感染して６〜８週間は抗体価が上がってこない
ため、現行のＨＩＶ抗体スクリーニングでは、ＨＩＶ感
染血液にもかかわらず陽性として検出できないウインド
ーピリオド（空白期間）が存在することが問題となって
いる。
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）により引き起こされる
疾患群であり、ＨＩＶが血液感染することが明確にされ
て以来、日本全国の血液センターで、輸血用血液のＨＩ
Ｖ抗体スクリーニングが行われている。しかしながら、
ＨＩＶが感染して６〜８週間は抗体価が上がってこない
ため、現行のＨＩＶ抗体スクリーニングでは、ＨＩＶ感
染血液にもかかわらず陽性として検出できないウインド
ーピリオド（空白期間）が存在することが問題となって
いる。
【０００３】一方、ＨＩＶ抗体スクリーニングに対し、
血液のＨＩＶ抗原スクリーニングを行うことによりウイ
ンドーピリオドを短縮する試みがなされている。ＨＩＶ
抗原を測定するには、免疫測定方法を用いるのが多数検
体を測定するスクリーニングにも適しているが、ＨＩＶ
の抗原は抗原性が変異しやすいので、中でも比較的安定
な抗原性を示すＨＩＶ−１ｐ２４抗原を測定することが
試みられている。ＨＩＶ−１ｐ２４抗原測定を行うため
の製品としては、ダイナボット社のＨＩＶ抗原・ＥＩＡ
「アボット」が販売されているが、感染血液をできるだ
け見逃さないためには、多数検体を迅速に測定でき、さ
らに、より高い検出感度の測定方法が求められている。
血液のＨＩＶ抗原スクリーニングを行うことによりウイ
ンドーピリオドを短縮する試みがなされている。ＨＩＶ
抗原を測定するには、免疫測定方法を用いるのが多数検
体を測定するスクリーニングにも適しているが、ＨＩＶ
の抗原は抗原性が変異しやすいので、中でも比較的安定
な抗原性を示すＨＩＶ−１ｐ２４抗原を測定することが
試みられている。ＨＩＶ−１ｐ２４抗原測定を行うため
の製品としては、ダイナボット社のＨＩＶ抗原・ＥＩＡ
「アボット」が販売されているが、感染血液をできるだ
け見逃さないためには、多数検体を迅速に測定でき、さ
らに、より高い検出感度の測定方法が求められている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、高い検出感度でＨＩＶ−１ｐ２４抗原を測定する免
疫測定方法および該方法に用いる試薬を提供することに
ある。
は、高い検出感度でＨＩＶ−１ｐ２４抗原を測定する免
疫測定方法および該方法に用いる試薬を提供することに
ある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者等は、従来の課
題を解決すべく、ＨＩＶ−１ｐ２４抗原測定に関する研
究を重ねた結果、ＨＩＶ−１ｐ２４抗原のＣ末端領域を
認識するポリクローナル抗体とＨＩＶ−１ｐ２４抗原の
Ｃ末端領域以外のエピトープを認識する２種類のモノク
ローナル抗体とを用いたサンドイッチ免疫測定方法によ
り、ＨＩＶ−１ｐ２４抗原を既存の測定方法よりはるか
に高い検出感度で測定することに成功して本発明を完成
した。
題を解決すべく、ＨＩＶ−１ｐ２４抗原測定に関する研
究を重ねた結果、ＨＩＶ−１ｐ２４抗原のＣ末端領域を
認識するポリクローナル抗体とＨＩＶ−１ｐ２４抗原の
Ｃ末端領域以外のエピトープを認識する２種類のモノク
ローナル抗体とを用いたサンドイッチ免疫測定方法によ
り、ＨＩＶ−１ｐ２４抗原を既存の測定方法よりはるか
に高い検出感度で測定することに成功して本発明を完成
した。
【０００６】すなわち、本発明は、ＨＩＶ−１ｐ２４抗
原のＣ末端領域を主要認識部位とする少なくとも１種類
のポリクローナル抗体と、ＨＩＶ−１ｐ２４抗原のＮ末
端を認識する少なくとも１種類のモノクローナル抗体
と、ＨＩＶ−１ｐ２４抗原の中間部位を認識する少なく
とも１種類のモノクローナル抗体とを用いることを特徴
とするＨＩＶ−１ｐ２４抗原さらにはＨＩＶ−１ｐ２４
抗原及びＨＩＶ−２ｐ２５抗原のサンドイッチ法を用い
た免疫測定方法及び該免疫測定方法に用いる試薬セット
を提供するものである。
原のＣ末端領域を主要認識部位とする少なくとも１種類
のポリクローナル抗体と、ＨＩＶ−１ｐ２４抗原のＮ末
端を認識する少なくとも１種類のモノクローナル抗体
と、ＨＩＶ−１ｐ２４抗原の中間部位を認識する少なく
とも１種類のモノクローナル抗体とを用いることを特徴
とするＨＩＶ−１ｐ２４抗原さらにはＨＩＶ−１ｐ２４
抗原及びＨＩＶ−２ｐ２５抗原のサンドイッチ法を用い
た免疫測定方法及び該免疫測定方法に用いる試薬セット
を提供するものである。
【０００７】本発明の免疫測定方法を用いれば、ＨＩＶ
−１ｐ２４抗原及びＨＩＶ−２ｐ２５抗原を高い検出感
度で測定することができ、ＨＩＶ−１ｐ２４抗原及びＨ
ＩＶ−２ｐ２５抗原の免疫測定、輸血用血液のスクリー
ニング等に広く用いることができる。
−１ｐ２４抗原及びＨＩＶ−２ｐ２５抗原を高い検出感
度で測定することができ、ＨＩＶ−１ｐ２４抗原及びＨ
ＩＶ−２ｐ２５抗原の免疫測定、輸血用血液のスクリー
ニング等に広く用いることができる。
【０００８】以下、本発明を詳細に説明する。ＨＩＶ−
１ｐ２４のアミノ酸配列は、Nature 313, P277-284 (19
85) に記載されている。ＨＩＶ−１ｐ２４抗原は、ＨＩ
Ｖ−１ｇａｇ領域の１３３〜３６３番目のアミノ酸配列
である。以下、本明細書においては、ＨＩＶ−１ｇａｇ
領域の１３３番目のアミノ酸をＨＩＶ−１ｐ２４抗原の
１番目のアミノ酸として記載する。
１ｐ２４のアミノ酸配列は、Nature 313, P277-284 (19
85) に記載されている。ＨＩＶ−１ｐ２４抗原は、ＨＩ
Ｖ−１ｇａｇ領域の１３３〜３６３番目のアミノ酸配列
である。以下、本明細書においては、ＨＩＶ−１ｇａｇ
領域の１３３番目のアミノ酸をＨＩＶ−１ｐ２４抗原の
１番目のアミノ酸として記載する。
【０００９】本発明においてＨＩＶ−１ｐ２４抗原のＣ
末端を主要認識部位とするポリクローナル抗体は、通
常、免疫原にＨＩＶ−１ｐ２４抗原を用い、ウサギ、モ
ルモット、山羊等の動物に免疫し、得られた抗ＨＩＶ−
１ｐ２４抗血清から公知の手法にて、抗体分画を精製し
たものを用いる。ここで、Ｃ末端領域とは、アミノ酸配
列１〜２３１で表されるＨＩＶ−１ｐ２４抗原のアミノ
酸配列２００付近〜２３１までの領域を意味する。Ｃ末
端領域を主要認識部位とするポリクローナル抗体は、Ｈ
ＩＶ−１ｐ２４抗原アミノ酸配列１１３〜２１２である
ペプチドｐ２４ｂ（配列番号２２に記載のアミノ酸配
列）及びＨＩＶ−１ｐ２４抗原のアミノ酸配列２１３〜
３０３であるペプチドｐ２４ｃ（配列番号２６に記載の
アミノ酸配列）のそれぞれは認識せずに、ＨＩＶ−１ｐ
２４抗原のアミノ酸配列１１３〜３０３であるペプチド
ｐ２４ｂｃ（配列番号２４に記載のアミノ酸配列）を認
識する抗体であることが好ましい。
末端を主要認識部位とするポリクローナル抗体は、通
常、免疫原にＨＩＶ−１ｐ２４抗原を用い、ウサギ、モ
ルモット、山羊等の動物に免疫し、得られた抗ＨＩＶ−
１ｐ２４抗血清から公知の手法にて、抗体分画を精製し
たものを用いる。ここで、Ｃ末端領域とは、アミノ酸配
列１〜２３１で表されるＨＩＶ−１ｐ２４抗原のアミノ
酸配列２００付近〜２３１までの領域を意味する。Ｃ末
端領域を主要認識部位とするポリクローナル抗体は、Ｈ
ＩＶ−１ｐ２４抗原アミノ酸配列１１３〜２１２である
ペプチドｐ２４ｂ（配列番号２２に記載のアミノ酸配
列）及びＨＩＶ−１ｐ２４抗原のアミノ酸配列２１３〜
３０３であるペプチドｐ２４ｃ（配列番号２６に記載の
アミノ酸配列）のそれぞれは認識せずに、ＨＩＶ−１ｐ
２４抗原のアミノ酸配列１１３〜３０３であるペプチド
ｐ２４ｂｃ（配列番号２４に記載のアミノ酸配列）を認
識する抗体であることが好ましい。
【００１０】さらに好ましくは、ＨＩＶ−１ｐ２４抗原
のアミノ酸配列２０７〜２１８（配列番号１２に記載の
アミノ酸配列）を含むペプチドを主要認識部位とするポ
リクローナル抗体が好ましい。
のアミノ酸配列２０７〜２１８（配列番号１２に記載の
アミノ酸配列）を含むペプチドを主要認識部位とするポ
リクローナル抗体が好ましい。
【００１１】該ポリクローナル抗体の免疫原には、精製
天然抗原、遺伝子工学技術によって作製したリコンビナ
ント抗原、合成ペプチド等、いずれのものも用いること
ができる。ＨＩＶ−１ｐ２４抗原Ｃ末端領域を主要認識
部位とするポリクローナル抗体を効率良く取得するため
には、ＨＩＶ−１ｐ２４抗原Ｃ末端領域のペプチドを免
疫原として調製することもできる。しかしながら、我々
の研究においては、免疫原として精製天然抗原を用いた
だけで、ＨＩＶ−１ｐ２４抗原Ｃ末端領域を主要認識部
位とするポリクローナル抗体を好適に取得することがで
きた。
天然抗原、遺伝子工学技術によって作製したリコンビナ
ント抗原、合成ペプチド等、いずれのものも用いること
ができる。ＨＩＶ−１ｐ２４抗原Ｃ末端領域を主要認識
部位とするポリクローナル抗体を効率良く取得するため
には、ＨＩＶ−１ｐ２４抗原Ｃ末端領域のペプチドを免
疫原として調製することもできる。しかしながら、我々
の研究においては、免疫原として精製天然抗原を用いた
だけで、ＨＩＶ−１ｐ２４抗原Ｃ末端領域を主要認識部
位とするポリクローナル抗体を好適に取得することがで
きた。
【００１２】本発明においてポリクローナル抗体の種類
とは、サンドイッチ法を用いた免疫測定方法に用いる試
薬の種類を意味する。すなわち、固相化抗体や標識抗体
等の抗体からなる試薬のうちポリクローナル抗体を用い
た試薬の種類が１種類であれば１種類のポリクローナル
抗体、試薬の種類が２種類であれば２種類のポリクロー
ナル抗体として数える。通常、ポリクローナル抗体は抗
原で免疫した動物血清からイムノグロブリンを精製して
調製し、この際に、免疫する動物の固体差や抗血清のロ
ット差を避けるために複数のポリクローナル抗体ロット
を混合することがあるが、本発明のポリクローナル抗体
の種類に関しては、混合した抗血清や精製ポリクローナ
ル抗体等のロット数は問わない。また、同一ロットのポ
リクローナル抗体であったとしても、固相化抗体と標識
抗体等のように異なった試薬として免疫測定に用いる場
合には、その試薬の種類に応じた数が本発明におけるポ
リクローナル抗体の種類となる。
とは、サンドイッチ法を用いた免疫測定方法に用いる試
薬の種類を意味する。すなわち、固相化抗体や標識抗体
等の抗体からなる試薬のうちポリクローナル抗体を用い
た試薬の種類が１種類であれば１種類のポリクローナル
抗体、試薬の種類が２種類であれば２種類のポリクロー
ナル抗体として数える。通常、ポリクローナル抗体は抗
原で免疫した動物血清からイムノグロブリンを精製して
調製し、この際に、免疫する動物の固体差や抗血清のロ
ット差を避けるために複数のポリクローナル抗体ロット
を混合することがあるが、本発明のポリクローナル抗体
の種類に関しては、混合した抗血清や精製ポリクローナ
ル抗体等のロット数は問わない。また、同一ロットのポ
リクローナル抗体であったとしても、固相化抗体と標識
抗体等のように異なった試薬として免疫測定に用いる場
合には、その試薬の種類に応じた数が本発明におけるポ
リクローナル抗体の種類となる。
【００１３】ポリクローナル抗体は複数の抗体の集合体
であるため、複数の認識部位を有するのが通常である
が、本発明のポリクローナル抗体は、驚くべきことにＨ
ＩＶ−１ｐ２４抗原Ｃ末端領域を認識するモノクローナ
ル抗体とはサンドイッチ免疫反応が成立しなかった。す
なわち本発明のポリクローナル抗体は、ポリクローナル
抗体であるにもかかわらずＨＩＶ−１ｐ２４抗原Ｃ末端
領域を特異的に認識しており、Ｃ末端領域を主要認識部
位とするポリクローナル抗体であった。
であるため、複数の認識部位を有するのが通常である
が、本発明のポリクローナル抗体は、驚くべきことにＨ
ＩＶ−１ｐ２４抗原Ｃ末端領域を認識するモノクローナ
ル抗体とはサンドイッチ免疫反応が成立しなかった。す
なわち本発明のポリクローナル抗体は、ポリクローナル
抗体であるにもかかわらずＨＩＶ−１ｐ２４抗原Ｃ末端
領域を特異的に認識しており、Ｃ末端領域を主要認識部
位とするポリクローナル抗体であった。
【００１４】本発明においてＨＩＶ−１ｐ２４抗原を認
識するモノクローナル抗体とは、上記ＨＩＶ−１ｐ２４
抗原を認識するポリクローナル抗体とサンドイッチ免疫
測定法を組むことのできるモノクローナル抗体である。
すなわち、該モノクローナル抗体は、ＨＩＶ−１ｐ２４
抗原を認識しかつ上記ＨＩＶ−１ｐ２４抗原を認識する
ポリクローナル抗体とは異なる認識部位をもつモノクロ
ーナル抗体である。また、本発明においては、少なくと
も２種類のＨＩＶ−１ｐ２４抗原を認識するモノクロー
ナル抗体を用いるので、該モノクローナル抗体の認識部
位もそれぞれ異なっていなければならない。
識するモノクローナル抗体とは、上記ＨＩＶ−１ｐ２４
抗原を認識するポリクローナル抗体とサンドイッチ免疫
測定法を組むことのできるモノクローナル抗体である。
すなわち、該モノクローナル抗体は、ＨＩＶ−１ｐ２４
抗原を認識しかつ上記ＨＩＶ−１ｐ２４抗原を認識する
ポリクローナル抗体とは異なる認識部位をもつモノクロ
ーナル抗体である。また、本発明においては、少なくと
も２種類のＨＩＶ−１ｐ２４抗原を認識するモノクロー
ナル抗体を用いるので、該モノクローナル抗体の認識部
位もそれぞれ異なっていなければならない。
【００１５】好ましくは、上記少なくとも１種類のポリ
クローナル抗体がＨＩＶ−１ｐ２４抗原Ｃ末端領域を認
識し、少なくとも２種類のモノクローナル抗体のうち１
種類がＨＩＶ−１ｐ２４抗原のＮ末端及び他の１種類が
ＨＩＶ−１ｐ２４抗原の中間部位を認識する。
クローナル抗体がＨＩＶ−１ｐ２４抗原Ｃ末端領域を認
識し、少なくとも２種類のモノクローナル抗体のうち１
種類がＨＩＶ−１ｐ２４抗原のＮ末端及び他の１種類が
ＨＩＶ−１ｐ２４抗原の中間部位を認識する。
【００１６】ＨＩＶ−１ｐ２４抗原のＮ末端を認識する
モノクローナル抗体とは、ＨＩＶ−１ｐ２４抗原のアミ
ノ酸配列２２〜１１２であるペプチドｐ２４ａ（配列番
号１８に記載のアミノ酸配列）は認識せずかつＨＩＶ−
１ｐ２４抗原のアミノ酸配列１〜１１２であるペプチド
ｐ２４ａ＋（配列番号２８に記載のアミノ酸配列）を認
識するモノクローナル抗体を意味する。このモノクロー
ナル抗体のさらに好ましい態様は、ＨＩＶ−１ｐ２４抗
原のアミノ酸配列１〜２７（配列番号１３に記載のアミ
ノ酸配列）を含むペプチドを認識するモノクローナル抗
体である。
モノクローナル抗体とは、ＨＩＶ−１ｐ２４抗原のアミ
ノ酸配列２２〜１１２であるペプチドｐ２４ａ（配列番
号１８に記載のアミノ酸配列）は認識せずかつＨＩＶ−
１ｐ２４抗原のアミノ酸配列１〜１１２であるペプチド
ｐ２４ａ＋（配列番号２８に記載のアミノ酸配列）を認
識するモノクローナル抗体を意味する。このモノクロー
ナル抗体のさらに好ましい態様は、ＨＩＶ−１ｐ２４抗
原のアミノ酸配列１〜２７（配列番号１３に記載のアミ
ノ酸配列）を含むペプチドを認識するモノクローナル抗
体である。
【００１７】また、ＨＩＶ−１ｐ２４抗原の中間部位を
認識するモノクローナル抗体とは、ＨＩＶ−１ｐ２４抗
原のアミノ酸配列２２〜１１２であるペプチドｐ２４ａ
（配列番号１８に記載のアミノ酸配列）及びＨＩＶ−１
ｐ２４抗原のアミノ酸配列１１３〜２１２であるペプチ
ドｐ２４ｂ（配列番号２２に記載のアミノ酸配列）のそ
れぞれは認識せずかつＨＩＶ−１ｐ２４抗原のアミノ酸
配列２２〜２１２であるペプチドｐ２４ａｂ（配列番号
２０に記載のアミノ酸配列）を認識するモノクローナル
抗体を意味する。このモノクローナル抗体のさらに好ま
しい態様は、ＨＩＶ−１ｐ２４抗原のアミノ酸配列１０
７〜１１８（配列番号１４に記載のアミノ酸配列）を含
むペプチドを認識するモノクローナル抗体である。
認識するモノクローナル抗体とは、ＨＩＶ−１ｐ２４抗
原のアミノ酸配列２２〜１１２であるペプチドｐ２４ａ
（配列番号１８に記載のアミノ酸配列）及びＨＩＶ−１
ｐ２４抗原のアミノ酸配列１１３〜２１２であるペプチ
ドｐ２４ｂ（配列番号２２に記載のアミノ酸配列）のそ
れぞれは認識せずかつＨＩＶ−１ｐ２４抗原のアミノ酸
配列２２〜２１２であるペプチドｐ２４ａｂ（配列番号
２０に記載のアミノ酸配列）を認識するモノクローナル
抗体を意味する。このモノクローナル抗体のさらに好ま
しい態様は、ＨＩＶ−１ｐ２４抗原のアミノ酸配列１０
７〜１１８（配列番号１４に記載のアミノ酸配列）を含
むペプチドを認識するモノクローナル抗体である。
【００１８】該モノクローナル抗体を作製する場合の免
疫原としては、精製天然抗原、遺伝子工学技術によって
作製したリコンビナント抗原、合成ペプチド等、いずれ
のものも用いることができるが、ＨＩＶ−１ｐ２４抗原
Ｎ末端を認識するモノクローナル抗体を取得するにはＨ
ＩＶ−１ｐ２４Ｎ末端のペプチドを、ＨＩＶ−１ｐ２４
中間部位を認識するモノクローナル抗体を取得するには
ＨＩＶ−１ｐ２４中間部位のペプチドを用いるのが好ま
しい。しかしながら、何を免疫原として用いたとして
も、モノクローナル抗体を確立する際に目的に応じた特
異性を示すモノクローナル抗体を選別すればよく、免疫
原はこれらに限定されるものではない。
疫原としては、精製天然抗原、遺伝子工学技術によって
作製したリコンビナント抗原、合成ペプチド等、いずれ
のものも用いることができるが、ＨＩＶ−１ｐ２４抗原
Ｎ末端を認識するモノクローナル抗体を取得するにはＨ
ＩＶ−１ｐ２４Ｎ末端のペプチドを、ＨＩＶ−１ｐ２４
中間部位を認識するモノクローナル抗体を取得するには
ＨＩＶ−１ｐ２４中間部位のペプチドを用いるのが好ま
しい。しかしながら、何を免疫原として用いたとして
も、モノクローナル抗体を確立する際に目的に応じた特
異性を示すモノクローナル抗体を選別すればよく、免疫
原はこれらに限定されるものではない。
【００１９】モノクローナル抗体を作製するには、公知
の方法、例えば、ケーラーとミルシュタイン（Nature 2
56 495 1975 ）、シェーラー（Nature 285 446 1980 ）
等の方法により行うことができる。すなわち、上記のよ
うな免疫原を、マウス、ラット、ハムスター等の免疫動
物に免疫し、抗体価の上昇を確認後、抗体産生細胞と腫
瘍細胞とを融合してハイブリドーマを作製する。次いで
ハイブリドーマを選択培地を用いて選択し、この培養上
清を酵素免疫測定法のような適当な免疫測定法で分析
し、目的とするＨＩＶ−１ｐ２４に特異的なモノクロー
ナル抗体を産生しているクローンを選択する。選択した
クローンを限界希釈法等のような方法でクローニングを
行い、モノクローナル化する。
の方法、例えば、ケーラーとミルシュタイン（Nature 2
56 495 1975 ）、シェーラー（Nature 285 446 1980 ）
等の方法により行うことができる。すなわち、上記のよ
うな免疫原を、マウス、ラット、ハムスター等の免疫動
物に免疫し、抗体価の上昇を確認後、抗体産生細胞と腫
瘍細胞とを融合してハイブリドーマを作製する。次いで
ハイブリドーマを選択培地を用いて選択し、この培養上
清を酵素免疫測定法のような適当な免疫測定法で分析
し、目的とするＨＩＶ−１ｐ２４に特異的なモノクロー
ナル抗体を産生しているクローンを選択する。選択した
クローンを限界希釈法等のような方法でクローニングを
行い、モノクローナル化する。
【００２０】また上述の手法により作製したモノクロー
ナル抗体は、プリスタン処理したマウスに該モノクロー
ナル抗体を産生するハイブリドーマを投与して得られた
腹水、あるいは該モノクロナール抗体を産生するハイブ
リドーマの培養上清から、塩折、イオン交換クロマトグ
ラフィー、プロテインＡを固定化したアフィニティーク
ロマトグラフィー等の分析・精製手段により回収するこ
とができる。
ナル抗体は、プリスタン処理したマウスに該モノクロー
ナル抗体を産生するハイブリドーマを投与して得られた
腹水、あるいは該モノクロナール抗体を産生するハイブ
リドーマの培養上清から、塩折、イオン交換クロマトグ
ラフィー、プロテインＡを固定化したアフィニティーク
ロマトグラフィー等の分析・精製手段により回収するこ
とができる。
【００２１】後述の実施例に示したモノクローナル抗体
は、ＨＩＶ−１の精製ｐ２４抗原を免疫原とし、上述の
公知の手法によってモノクローナル抗体産生ハイブリド
ーマを作製した。上記ＨＩＶ−１ｐ２４抗原Ｃ末端領域
を認識するポリクローナル抗体とサンドイッチ反応が効
率よく起こるモノクローナル抗体を選び、認識部位をＨ
ＩＶ−１ｐ２４抗原の各ペプチドで調べたところ、ＨＩ
Ｖ−１ｐ２４のＮ末端と中間部位を認識するモノクロー
ナル抗体が好ましかった。中でも、ＨＩＶ−１ｐ２４Ｎ
末端を認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリ
ドーマをｐ２４Ｎ１−９、ＨＩＶ−１ｐ２４中間部位を
認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ
をｐ２４Ｎ３−３と命名し、これらは生命工学工業技術
研究所に寄託され、それぞれの受託番号はＦＥＲＭ Ｐ
−１７２７６及びＦＥＲＭ Ｐ−１７２７５である。
は、ＨＩＶ−１の精製ｐ２４抗原を免疫原とし、上述の
公知の手法によってモノクローナル抗体産生ハイブリド
ーマを作製した。上記ＨＩＶ−１ｐ２４抗原Ｃ末端領域
を認識するポリクローナル抗体とサンドイッチ反応が効
率よく起こるモノクローナル抗体を選び、認識部位をＨ
ＩＶ−１ｐ２４抗原の各ペプチドで調べたところ、ＨＩ
Ｖ−１ｐ２４のＮ末端と中間部位を認識するモノクロー
ナル抗体が好ましかった。中でも、ＨＩＶ−１ｐ２４Ｎ
末端を認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリ
ドーマをｐ２４Ｎ１−９、ＨＩＶ−１ｐ２４中間部位を
認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ
をｐ２４Ｎ３−３と命名し、これらは生命工学工業技術
研究所に寄託され、それぞれの受託番号はＦＥＲＭ Ｐ
−１７２７６及びＦＥＲＭ Ｐ−１７２７５である。
【００２２】ＨＩＶ−１ｐ２４抗原とＨＩＶ−２ｐ２５
抗原とはホモロジーが高いため、本発明のポリクローナ
ル抗体及びモノクローナル抗体を、ＨＩＶ−１ｐ２４抗
原と同時にＨＩＶ−２ｐ２５抗原をも認識する抗体とす
ることもできる。後述する実施例７で作製したポリクロ
ーナル抗体、ハイブリドーマｐ２４Ｎ１−９が産生する
モノクローナル抗体及びハイブリドーマｐ２４Ｎ３−３
が産生するモノクローナル抗体は、いずれもＨＩＶ−１
ｐ２４抗原及びＨＩＶ−２ｐ２５抗原を認識する抗体で
あった。このような抗体を用いたサンドイッチ免疫測定
法は、一度の測定でＨＩＶ−１抗体及びＨＩＶ−２抗体
を検出するので、輸血用血液のＨＩＶ抗体スクリーニン
グに用いる場合等には大変便利である。
抗原とはホモロジーが高いため、本発明のポリクローナ
ル抗体及びモノクローナル抗体を、ＨＩＶ−１ｐ２４抗
原と同時にＨＩＶ−２ｐ２５抗原をも認識する抗体とす
ることもできる。後述する実施例７で作製したポリクロ
ーナル抗体、ハイブリドーマｐ２４Ｎ１−９が産生する
モノクローナル抗体及びハイブリドーマｐ２４Ｎ３−３
が産生するモノクローナル抗体は、いずれもＨＩＶ−１
ｐ２４抗原及びＨＩＶ−２ｐ２５抗原を認識する抗体で
あった。このような抗体を用いたサンドイッチ免疫測定
法は、一度の測定でＨＩＶ−１抗体及びＨＩＶ−２抗体
を検出するので、輸血用血液のＨＩＶ抗体スクリーニン
グに用いる場合等には大変便利である。
【００２３】本発明の免疫測定方法は、公知のサンドイ
ッチ法を測定原理とした免疫測定方法のいずれにも用い
ることができるが、高い測定感度で多検体を簡便かつ迅
速に測定するためには、固相法を用いた酵素標識サンド
イッチ免疫測定法が好ましい。さらに好ましくは、ＨＩ
Ｖ−１ｐ２４Ｃ末端領域を主要認識部位とするポリクロ
ーナル抗体を酵素標識体に、ＨＩＶ−１ｐ２４Ｎ末端及
びＨＩＶ−１ｐ２４中間部位を認識する２種類のモノク
ローナル抗体を固相結合体として用いる。
ッチ法を測定原理とした免疫測定方法のいずれにも用い
ることができるが、高い測定感度で多検体を簡便かつ迅
速に測定するためには、固相法を用いた酵素標識サンド
イッチ免疫測定法が好ましい。さらに好ましくは、ＨＩ
Ｖ−１ｐ２４Ｃ末端領域を主要認識部位とするポリクロ
ーナル抗体を酵素標識体に、ＨＩＶ−１ｐ２４Ｎ末端及
びＨＩＶ−１ｐ２４中間部位を認識する２種類のモノク
ローナル抗体を固相結合体として用いる。
【００２４】ＨＩＶ−１ｐ２４Ｃ末端領域を主要認識部
位とするポリクローナル抗体の酵素標識は、公知の共有
結合法等により直接標識してもよいし、ビオチン−アビ
ジン等他の結合対を用いて間接的に標識してもよい。ポ
リクローナル抗体の標識は公知の手法にて行うことがで
きるが、ポリクローナル抗体をＦab' として二架橋性試
薬等により標識すると良い。標識する酵素は、アルカリ
ホスファターゼ（以下、本明細書においてはＡＬＰと記
載する）、パーオキシダーゼ、βガラクトシダーゼ等公
知のものを用いることができるが、高い検出感度の測定
系を提供するためには、好適な発光基質のあるＡＬＰを
用いることが望ましい。
位とするポリクローナル抗体の酵素標識は、公知の共有
結合法等により直接標識してもよいし、ビオチン−アビ
ジン等他の結合対を用いて間接的に標識してもよい。ポ
リクローナル抗体の標識は公知の手法にて行うことがで
きるが、ポリクローナル抗体をＦab' として二架橋性試
薬等により標識すると良い。標識する酵素は、アルカリ
ホスファターゼ（以下、本明細書においてはＡＬＰと記
載する）、パーオキシダーゼ、βガラクトシダーゼ等公
知のものを用いることができるが、高い検出感度の測定
系を提供するためには、好適な発光基質のあるＡＬＰを
用いることが望ましい。
【００２５】モノクローナル抗体を固相化するには、物
理吸着、架橋剤を用いた化学結合等公知の方法を適宜用
いることができる。固相化に当たっては、２種類のモノ
クローナル抗体を混合して固相化してもよいが、２種類
のモノクローナル抗体を個別に固相に結合させた後、そ
れぞれの抗体結合固相を混合して測定に用いることもで
きる。測定試薬を安定製造するためには、各モノクロー
ナル抗体を個別に結合させた固相を混合して用いること
が好ましい。用いる固相はＥＬＩＳＡ用プレート、ポリ
スチレンビーズ、磁性粒子等公知のものを適宜用いるこ
とができるが、固相を混合して用いるためには、磁性粒
子等の微粒子を用いることが好ましい。
理吸着、架橋剤を用いた化学結合等公知の方法を適宜用
いることができる。固相化に当たっては、２種類のモノ
クローナル抗体を混合して固相化してもよいが、２種類
のモノクローナル抗体を個別に固相に結合させた後、そ
れぞれの抗体結合固相を混合して測定に用いることもで
きる。測定試薬を安定製造するためには、各モノクロー
ナル抗体を個別に結合させた固相を混合して用いること
が好ましい。用いる固相はＥＬＩＳＡ用プレート、ポリ
スチレンビーズ、磁性粒子等公知のものを適宜用いるこ
とができるが、固相を混合して用いるためには、磁性粒
子等の微粒子を用いることが好ましい。
【００２６】本発明の免疫測定方法の具体例としては、
検体１００μｌと２種類のモノクローナル抗体結合磁性
粒子２５０μｌを３７℃で１０分間反応させ、洗浄後、
ＡＬＰ標識ポリクローナル抗体液を２５０μｌ加えてさ
らに３７℃で１０分間反応させ、洗浄後、発光基質を２
００μｌ加えて３７℃で５分間後の発光量を測定する方
法を挙げることができる。この測定方法は、全自動化学
発光免疫測定装置ルミパルスｆ（富士レビオ社製）によ
って、好適に実施することができる。
検体１００μｌと２種類のモノクローナル抗体結合磁性
粒子２５０μｌを３７℃で１０分間反応させ、洗浄後、
ＡＬＰ標識ポリクローナル抗体液を２５０μｌ加えてさ
らに３７℃で１０分間反応させ、洗浄後、発光基質を２
００μｌ加えて３７℃で５分間後の発光量を測定する方
法を挙げることができる。この測定方法は、全自動化学
発光免疫測定装置ルミパルスｆ（富士レビオ社製）によ
って、好適に実施することができる。
【００２７】本発明の試薬とは、ＨＩＶ−１ｐ２４抗原
を測定するために必要な測定試薬及びその組み合わせを
意味し、抗体結合固相、酵素標識抗体、基質、検体希釈
液、洗浄液、陽性コントロール、陰性コントロール等の
試薬を含むものである。多検体を迅速・簡便に測定する
には、自動酵素免疫測定装置で測定することのできる試
薬として構成することが望ましい。
を測定するために必要な測定試薬及びその組み合わせを
意味し、抗体結合固相、酵素標識抗体、基質、検体希釈
液、洗浄液、陽性コントロール、陰性コントロール等の
試薬を含むものである。多検体を迅速・簡便に測定する
には、自動酵素免疫測定装置で測定することのできる試
薬として構成することが望ましい。
【００２８】なお、測定する検体には制限が無く、例え
ば血清、血漿、全血、尿、リンパ液等の各種体液や細胞
組織抽出液等をＨＩＶ−１ｐ２４抗原の免疫測定に適応
できる。
ば血清、血漿、全血、尿、リンパ液等の各種体液や細胞
組織抽出液等をＨＩＶ−１ｐ２４抗原の免疫測定に適応
できる。
【００２９】ＨＩＶは抗原性の変異が頻繁に起こる。そ
のため、通常のサンドイッチ免疫測定法のような２種類
の認識部位をもつ抗体を組み合わせた測定では、用いた
抗体が認識する抗原部位が変化している場合ＨＩＶ−１
ｐ２４抗原を測定することができなくなってしまう確率
が高くなる。このような変異しやすい抗原を測定するに
は、モノクローナル抗体よりはポリクローナル抗体を用
いる方が好ましいが、サンドイッチ反応を行うことので
きる複数のポリクローナル抗体を再現性よく調製するこ
とは、免疫測定に用いる試薬を安定供給する意味からも
困難である。
のため、通常のサンドイッチ免疫測定法のような２種類
の認識部位をもつ抗体を組み合わせた測定では、用いた
抗体が認識する抗原部位が変化している場合ＨＩＶ−１
ｐ２４抗原を測定することができなくなってしまう確率
が高くなる。このような変異しやすい抗原を測定するに
は、モノクローナル抗体よりはポリクローナル抗体を用
いる方が好ましいが、サンドイッチ反応を行うことので
きる複数のポリクローナル抗体を再現性よく調製するこ
とは、免疫測定に用いる試薬を安定供給する意味からも
困難である。
【００３０】これに対し、本発明の構成を備えた測定方
法は、１種類のポリクローナル抗体と少なくとも２種類
のモノクローナル抗体、すなわち測定系全体として少な
くとも３種類の認識部位をもつ抗体を組み合わせるた
め、抗原性の変異による影響を受けにくい。またポリク
ローナル抗体の他にモノクローナル抗体を組み合わせる
ことによって、ＨＩＶ−１ｐ２４抗原のＮ末端、中間部
位、Ｃ末端領域というそれぞれの認識部位と反応する抗
体を再現性よく調製することができ、少なくとも３種類
の抗体の認識部位がそれぞれ異なるため、サンドイッチ
測定の抗原・抗体複合体を効率よく形成し、従来の手法
より高い検出感度を示すことができるのである。
法は、１種類のポリクローナル抗体と少なくとも２種類
のモノクローナル抗体、すなわち測定系全体として少な
くとも３種類の認識部位をもつ抗体を組み合わせるた
め、抗原性の変異による影響を受けにくい。またポリク
ローナル抗体の他にモノクローナル抗体を組み合わせる
ことによって、ＨＩＶ−１ｐ２４抗原のＮ末端、中間部
位、Ｃ末端領域というそれぞれの認識部位と反応する抗
体を再現性よく調製することができ、少なくとも３種類
の抗体の認識部位がそれぞれ異なるため、サンドイッチ
測定の抗原・抗体複合体を効率よく形成し、従来の手法
より高い検出感度を示すことができるのである。
【００３１】後述する実施例にも示したように、既存の
ＨＩＶ−１ｐ２４抗原測定試薬として用いられているダ
イナボット社製のＨＩＶ抗原・ＥＩＡ「アボット」の測
定感度は、１２ｐｇ／ｍｌである。この製品の測定条件
は、検体量２００μｌを用い、合計測定時間は５時間半
である。これに対し、本発明による免疫測定方法では、
検体量１００μｌを用い、合計測定時間を２５分の測定
条件とした時の検出感度が４ｐｇ／ｍｌであった。
ＨＩＶ−１ｐ２４抗原測定試薬として用いられているダ
イナボット社製のＨＩＶ抗原・ＥＩＡ「アボット」の測
定感度は、１２ｐｇ／ｍｌである。この製品の測定条件
は、検体量２００μｌを用い、合計測定時間は５時間半
である。これに対し、本発明による免疫測定方法では、
検体量１００μｌを用い、合計測定時間を２５分の測定
条件とした時の検出感度が４ｐｇ／ｍｌであった。
【００３２】免疫測定方法の検出感度は、用いる検体量
及び免疫反応時間によって影響を受けるが、両測定方法
の検体量だけを考慮したとしても、本発明の免疫測定方
法は既存法に比較して６倍も高い感度を示し、さらに測
定時間が１／１０以下で、既存の全自動免疫測定装置ル
ミパルスｆ（富士レビオ社製）を用いて測定することが
できる等、本発明の免疫測定方法は、ＨＩＶ−１ｐ２４
抗原のスクリーニングに好適な測定方法であることが示
された。
及び免疫反応時間によって影響を受けるが、両測定方法
の検体量だけを考慮したとしても、本発明の免疫測定方
法は既存法に比較して６倍も高い感度を示し、さらに測
定時間が１／１０以下で、既存の全自動免疫測定装置ル
ミパルスｆ（富士レビオ社製）を用いて測定することが
できる等、本発明の免疫測定方法は、ＨＩＶ−１ｐ２４
抗原のスクリーニングに好適な測定方法であることが示
された。
【００３３】
【実施例】本発明を以下参考例及び実施例により更に詳
細に説明する。
細に説明する。
【００３４】実施例１ リコンビナントＤＮＡの調製
（１）ｐＷ６Ａの作製
ｐＧＥＭＥＸ−１（プロメガ社製）のＴ７プロモーター
及びＴ７ターミネーター遺伝子と、ｐＧＥＸ−２Ｔ（フ
ァルマシア社製）のアンピシリン耐性遺伝子、ｌａｃ
Ｉｑレプレッサー遺伝子及びｏｒｉとを用い、Ｔ７プロ
モーターの下流にｌａｃレプレッサーが結合できる部位
とマルチクローニングサイトに終止コドンを導入して発
現ベクターｐＷ６Ａを作製した。作製したｐＷ６Ａの制
限酵素地図を図１に示す。
及びＴ７ターミネーター遺伝子と、ｐＧＥＸ−２Ｔ（フ
ァルマシア社製）のアンピシリン耐性遺伝子、ｌａｃ
Ｉｑレプレッサー遺伝子及びｏｒｉとを用い、Ｔ７プロ
モーターの下流にｌａｃレプレッサーが結合できる部位
とマルチクローニングサイトに終止コドンを導入して発
現ベクターｐＷ６Ａを作製した。作製したｐＷ６Ａの制
限酵素地図を図１に示す。
【００３５】（２）ｐＨＩＶ２４−２の作製
ＨＩＶ−１ｇａｇ蛋白をコードするＤＮＡ断片は、ＨＩ
Ｖ感染者から分離されたウイルスからクローニングされ
たλＷＭＪ−１（Sience, 232, p1548-1553, (1986) ）
を使用した。λＷＭＪ−１を制限酵素Ｂｇｌ２で消化し
た後にＭｕｎｇＢｅａｎ Ｎｕｃｌｅａｓｅで末端を平
滑化し、さらに、制限酵素ＮｓｉＩで消化した後、アガ
ロース電気泳動を用いて分離精製し、ｇａｇ遺伝子を含
む８４５ｂｐのＤＮＡ断片を得た。
Ｖ感染者から分離されたウイルスからクローニングされ
たλＷＭＪ−１（Sience, 232, p1548-1553, (1986) ）
を使用した。λＷＭＪ−１を制限酵素Ｂｇｌ２で消化し
た後にＭｕｎｇＢｅａｎ Ｎｕｃｌｅａｓｅで末端を平
滑化し、さらに、制限酵素ＮｓｉＩで消化した後、アガ
ロース電気泳動を用いて分離精製し、ｇａｇ遺伝子を含
む８４５ｂｐのＤＮＡ断片を得た。
【００３６】また、λＷＭＪ−１を制限酵素Ｐｖｕ２と
ＮｓｉＩで消化した後、アガロース電気泳動を用いて分
離精製し、１０４ｂｐのＤＮＡ断片を得た。
ＮｓｉＩで消化した後、アガロース電気泳動を用いて分
離精製し、１０４ｂｐのＤＮＡ断片を得た。
【００３７】プラスミドｐＵＣ９（Gene, 2, p95-113,
(1977)）を制限酵素ＰｓｔＩで消化し、ＡＬＰで脱リン
酸化したものと上記の２つのフラグメントを同時にライ
ゲーションし、ｐＨＩＶ２４−２を作製した。ｐＵＣ９
に挿入した目的のＤＮＡ配列を配列番号１に示す。ｐＨ
ＩＶ２４−２は、挿入した目的ＤＮＡ配列の直後にスト
ップコドンを有している。
(1977)）を制限酵素ＰｓｔＩで消化し、ＡＬＰで脱リン
酸化したものと上記の２つのフラグメントを同時にライ
ゲーションし、ｐＨＩＶ２４−２を作製した。ｐＵＣ９
に挿入した目的のＤＮＡ配列を配列番号１に示す。ｐＨ
ＩＶ２４−２は、挿入した目的ＤＮＡ配列の直後にスト
ップコドンを有している。
【００３８】（３）解析用プラスミドの作製
解析用ペプチドを発現するために、プラスミドを作製し
た。まずプラスミドに挿入するＤＮＡ断片をＰＣＲ法に
より調製するためのプライマーを作製した。
た。まずプラスミドに挿入するＤＮＡ断片をＰＣＲ法に
より調製するためのプライマーを作製した。
【００３９】ＤＮＡ合成機（パーキンエルマー社製）を
用いてオルゴヌクレオチドを作製し、プライマー２４Ｆ
１、プライマー２４Ｆ２、プライマー２４Ｆ３、プライ
マー２４Ｆ＋１、プライマー２４Ｆ＋２、プライマー２
４Ｒ１、プライマー２４Ｒ２、プライマー２４Ｒ３、プ
ライマー２５Ｆ及びプライマー２５Ｒを調製した。
用いてオルゴヌクレオチドを作製し、プライマー２４Ｆ
１、プライマー２４Ｆ２、プライマー２４Ｆ３、プライ
マー２４Ｆ＋１、プライマー２４Ｆ＋２、プライマー２
４Ｒ１、プライマー２４Ｒ２、プライマー２４Ｒ３、プ
ライマー２５Ｆ及びプライマー２５Ｒを調製した。
【００４０】プライマー２４Ｆ１は配列番号２に、プラ
イマー２４Ｆ２は配列番号３に、プライマー２４Ｆ３は
配列番号４に、プライマー２４Ｆ＋１は配列番号５に、
プライマー２４Ｆ＋２は配列番号６に、プライマー２４
Ｒ１は配列番号７に、プライマー２４Ｒ２は配列番号８
に、プライマー２４Ｒ３は配列番号９に、プライマー２
５Ｆは配列番号１０に、プライマー２５Ｒは配列番号１
１に示す。
イマー２４Ｆ２は配列番号３に、プライマー２４Ｆ３は
配列番号４に、プライマー２４Ｆ＋１は配列番号５に、
プライマー２４Ｆ＋２は配列番号６に、プライマー２４
Ｒ１は配列番号７に、プライマー２４Ｒ２は配列番号８
に、プライマー２４Ｒ３は配列番号９に、プライマー２
５Ｆは配列番号１０に、プライマー２５Ｒは配列番号１
１に示す。
【００４１】解析用プラスミドに挿入するＤＮＡ断片
（以下、本明細書においてはフラグメントと記載するこ
とがある）を、ＰＣＲ法を用いて作製した。実施例１
（１）で作製したｐＨＩＶ２４−２をテンプレートとし
て用い、ＨＩＶ−１ｇａｇの一部をコードするものとし
て、プライマー２４Ｆ１とプライマー２４Ｒ３を用いて
フラグメント２４ａｂｃを、プライマー２４Ｆ１とプラ
イマー２４Ｒ１を用いてフラグメント２４ａを、プライ
マー２４Ｆ１とプライマー２４Ｒ２を用いてフラグメン
ト２４ａｂを、プライマー２４Ｆ２とプライマー２４Ｒ
２を用いてフラグメント２４ｂを、プライマー２４Ｆ２
とプライマー２４Ｒ３を用いてフラグメント２４ｂｃ
を、プライマー２４Ｆ３とプライマー２４Ｒ３を用いて
フラグメント２４ｃを、プライマー２４Ｆ＋１、プライ
マー２４Ｆ＋２とプライマー２４Ｒ１を用いてフラグメ
ント２４ａ＋を作製した。
（以下、本明細書においてはフラグメントと記載するこ
とがある）を、ＰＣＲ法を用いて作製した。実施例１
（１）で作製したｐＨＩＶ２４−２をテンプレートとし
て用い、ＨＩＶ−１ｇａｇの一部をコードするものとし
て、プライマー２４Ｆ１とプライマー２４Ｒ３を用いて
フラグメント２４ａｂｃを、プライマー２４Ｆ１とプラ
イマー２４Ｒ１を用いてフラグメント２４ａを、プライ
マー２４Ｆ１とプライマー２４Ｒ２を用いてフラグメン
ト２４ａｂを、プライマー２４Ｆ２とプライマー２４Ｒ
２を用いてフラグメント２４ｂを、プライマー２４Ｆ２
とプライマー２４Ｒ３を用いてフラグメント２４ｂｃ
を、プライマー２４Ｆ３とプライマー２４Ｒ３を用いて
フラグメント２４ｃを、プライマー２４Ｆ＋１、プライ
マー２４Ｆ＋２とプライマー２４Ｒ１を用いてフラグメ
ント２４ａ＋を作製した。
【００４２】ＨＩＶ−２ｇａｇをコードするものとして
は、ＨＩＶ−２ ＧＨ−１株が持続感染しているＭＯＬ
Ｔ−４／ＧＨ−１細胞株からＤＮＡを調製してＰＣＲの
テンプレートとし、プライマー２５Ｆとプライマー２５
Ｒを用いてフラグメント２５を作製した。
は、ＨＩＶ−２ ＧＨ−１株が持続感染しているＭＯＬ
Ｔ−４／ＧＨ−１細胞株からＤＮＡを調製してＰＣＲの
テンプレートとし、プライマー２５Ｆとプライマー２５
Ｒを用いてフラグメント２５を作製した。
【００４３】ｐＷ６Ａを制限酵素ＮｄｅＩと制限酵素Ｂ
ａｍＨＩで消化しＡＬＰで脱リン酸化したものと、フラ
グメント２４ａｂｃをＮｄｅＩとＢａｍＨＩで消化した
ものとをライゲーションし、プラスミドｐＨＩＶ１５０
ａｂｃを作製した。
ａｍＨＩで消化しＡＬＰで脱リン酸化したものと、フラ
グメント２４ａｂｃをＮｄｅＩとＢａｍＨＩで消化した
ものとをライゲーションし、プラスミドｐＨＩＶ１５０
ａｂｃを作製した。
【００４４】ｐＷ６ＡをＮｄｅＩと制限酵素ＸｈｏＩで
消化しＡＬＰで脱リン酸化したものと、フラグメント２
４ａをＮｄｅＩとＸｈｏＩで消化したものとをライゲー
ションし、プラスミドｐＨＩＶ１５０ａを作製した。
消化しＡＬＰで脱リン酸化したものと、フラグメント２
４ａをＮｄｅＩとＸｈｏＩで消化したものとをライゲー
ションし、プラスミドｐＨＩＶ１５０ａを作製した。
【００４５】ｐＷ６ＡをＮｄｅＩとＸｈｏＩで消化しＡ
ＬＰで脱リン酸化したものと、フラグメント２４ａｂを
ＮｄｅＩとＸｈｏＩで消化したものとをライゲーション
し、プラスミドｐＨＩＶ１５０ａｂを作製した。
ＬＰで脱リン酸化したものと、フラグメント２４ａｂを
ＮｄｅＩとＸｈｏＩで消化したものとをライゲーション
し、プラスミドｐＨＩＶ１５０ａｂを作製した。
【００４６】ｐＷ６Ａを制限酵素ＥｃｏＲＩとＸｈｏＩ
で消化しＡＬＰで脱リン酸化したものと、フラグメント
２４ｂをＥｃｏＲＩとＸｈｏＩで消化したものとをライ
ゲーションし、プラスミドｐＨＩＶ１５０ｂを作製し
た。
で消化しＡＬＰで脱リン酸化したものと、フラグメント
２４ｂをＥｃｏＲＩとＸｈｏＩで消化したものとをライ
ゲーションし、プラスミドｐＨＩＶ１５０ｂを作製し
た。
【００４７】ｐＷ６ＡをＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで消化
しＡＬＰで脱リン酸化したものと、フラグメント２４ｂ
ｃをＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで消化したものとをライゲ
ーションし、プラスミドｐＨＩＶ１５０ｂｃを作製し
た。
しＡＬＰで脱リン酸化したものと、フラグメント２４ｂ
ｃをＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで消化したものとをライゲ
ーションし、プラスミドｐＨＩＶ１５０ｂｃを作製し
た。
【００４８】ｐＷ６ＡをＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで消化
しＡＬＰで脱リン酸化したものと、フラグメント２４ｃ
をＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで消化したものとをライゲー
ションし、プラスミドｐＨＩＶ１５０ｃを作製した。
しＡＬＰで脱リン酸化したものと、フラグメント２４ｃ
をＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで消化したものとをライゲー
ションし、プラスミドｐＨＩＶ１５０ｃを作製した。
【００４９】ｐＷ６ＡをＥｃｏＲＩとＸｈｏＩで消化し
ＡＬＰで脱リン酸化したものと、フラグメント２４ａ＋
をＥｃｏＲＩとＸｈｏＩで消化したものとをライゲーシ
ョンし、プラスミドｐＨＩＶ１５１ａ＋を作製した。
ＡＬＰで脱リン酸化したものと、フラグメント２４ａ＋
をＥｃｏＲＩとＸｈｏＩで消化したものとをライゲーシ
ョンし、プラスミドｐＨＩＶ１５１ａ＋を作製した。
【００５０】ｐＷ６ＡをＮｄｅＩとＸｈｏＩで消化しＡ
ＬＰで脱リン酸化したものと、フラグメント２５をＮｄ
ｅＩとＸｈｏＩで消化したものとをライゲーションし、
プラスミドｐＨＩＶ１５２を作製した。
ＬＰで脱リン酸化したものと、フラグメント２５をＮｄ
ｅＩとＸｈｏＩで消化したものとをライゲーションし、
プラスミドｐＨＩＶ１５２を作製した。
【００５１】実施例２ ペプチドの発現及び調製
（１）ｐ２４−２の発現及び精製
実施例１（１）で作製したプラスミドｐＨＩＶ２４−２
を宿主大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入し、２０μｇ／
ｍｌアンピシリン入りのＬＢ培地にて、３７℃で培養し
た。ＯＤ６６０ｎｍ＝０．５〜０．７で、４ｍＭ ＩＰ
ＴＧを添加し誘導後、１６時間培養し発現させた。培養
液を遠心し上清を除き、菌体をペレットとして回収し
た。
を宿主大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入し、２０μｇ／
ｍｌアンピシリン入りのＬＢ培地にて、３７℃で培養し
た。ＯＤ６６０ｎｍ＝０．５〜０．７で、４ｍＭ ＩＰ
ＴＧを添加し誘導後、１６時間培養し発現させた。培養
液を遠心し上清を除き、菌体をペレットとして回収し
た。
【００５２】回収した大腸菌に、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１
００ｍＭ塩化ナトリウム、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液
ｐＨ８．０を加え、蛋白質分解阻害剤としてＰＭＳＦを
添加して、ＬｙｚｏｚｙｍｅおよびＤＮＡａｓｅ処理を
行った。つぎに、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＤＴ
Ｔ、１Ｍ尿素、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ８．０
で洗浄し、さらに、１０ｍＭ ＤＴＴ、２Ｍ尿素、５０
ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ８．０で洗浄した。つぎ
に、１０ｍＭ ＤＴＴ、４Ｍ尿素、１０ｍＭトリス−水
酸化ナトリウム緩衝液ｐＨ１０．５で目的とする発現産
物を抽出した。
００ｍＭ塩化ナトリウム、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液
ｐＨ８．０を加え、蛋白質分解阻害剤としてＰＭＳＦを
添加して、ＬｙｚｏｚｙｍｅおよびＤＮＡａｓｅ処理を
行った。つぎに、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＤＴ
Ｔ、１Ｍ尿素、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ８．０
で洗浄し、さらに、１０ｍＭ ＤＴＴ、２Ｍ尿素、５０
ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ８．０で洗浄した。つぎ
に、１０ｍＭ ＤＴＴ、４Ｍ尿素、１０ｍＭトリス−水
酸化ナトリウム緩衝液ｐＨ１０．５で目的とする発現産
物を抽出した。
【００５３】つぎに、この画分をフェニルセファロース
６ＦＦカラムにかけてクロマト精製を行った。１ｍＭ
ＤＴＴ、０．７Ｍ硫酸アンモニウム、１０ｍＭトリス−
塩酸緩衝液ｐＨ８．０にて洗浄し、さらに、硫酸アンモ
ニウム濃度を０．６Ｍとして洗浄した後、１ｍＭＤＴ
Ｔ、０．４Ｍ硫酸アンモニウム、１０ｍＭトリス−塩酸
緩衝液ｐＨ８．０にて溶出した。つぎに、この画分をハ
イドロオキシアパタイトカラムにかけてクロマト精製を
行った。１ｍＭ ＤＴＴ、０．１％ＳＤＳ、１０ｍＭト
リス−塩酸緩衝液ｐＨ８．０にて洗浄し、さらに、１ｍ
Ｍ ＤＴＴ、０．１％ＳＤＳ、０．１Ｍリン酸ナトリウ
ム酸緩衝液ｐＨ７．０にて洗浄した。さらにまた、１ｍ
Ｍ ＤＴＴ、０．１％ＳＤＳ、リン酸ナトリウム濃度を
段階的に０．２Ｍ、０．３Ｍに上昇させた緩衝液で洗浄
を繰り返した後、１ｍＭ ＤＴＴ、０．１％ＳＤＳ、
０．５Ｍリン酸ナトリウム酸緩衝液ｐＨ７．０にて溶出
した。この画分を、セファデックスＧ−２５にてゲル濾
過精製した。０．１％ＳＤＳ、１０ｍＭトリス−塩酸緩
衝液ｐＨ８．０にて溶出し、回収した発現産物をｐ２４
−２と命名した。ｐ２４−２のアミノ酸配列を、配列番
号１５に示す。
６ＦＦカラムにかけてクロマト精製を行った。１ｍＭ
ＤＴＴ、０．７Ｍ硫酸アンモニウム、１０ｍＭトリス−
塩酸緩衝液ｐＨ８．０にて洗浄し、さらに、硫酸アンモ
ニウム濃度を０．６Ｍとして洗浄した後、１ｍＭＤＴ
Ｔ、０．４Ｍ硫酸アンモニウム、１０ｍＭトリス−塩酸
緩衝液ｐＨ８．０にて溶出した。つぎに、この画分をハ
イドロオキシアパタイトカラムにかけてクロマト精製を
行った。１ｍＭ ＤＴＴ、０．１％ＳＤＳ、１０ｍＭト
リス−塩酸緩衝液ｐＨ８．０にて洗浄し、さらに、１ｍ
Ｍ ＤＴＴ、０．１％ＳＤＳ、０．１Ｍリン酸ナトリウ
ム酸緩衝液ｐＨ７．０にて洗浄した。さらにまた、１ｍ
Ｍ ＤＴＴ、０．１％ＳＤＳ、リン酸ナトリウム濃度を
段階的に０．２Ｍ、０．３Ｍに上昇させた緩衝液で洗浄
を繰り返した後、１ｍＭ ＤＴＴ、０．１％ＳＤＳ、
０．５Ｍリン酸ナトリウム酸緩衝液ｐＨ７．０にて溶出
した。この画分を、セファデックスＧ−２５にてゲル濾
過精製した。０．１％ＳＤＳ、１０ｍＭトリス−塩酸緩
衝液ｐＨ８．０にて溶出し、回収した発現産物をｐ２４
−２と命名した。ｐ２４−２のアミノ酸配列を、配列番
号１５に示す。
【００５４】（２）解析用ペプチドの発現及び調製
実施例１（３）で作製したそれぞれの解析用プラスミド
を宿主大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入した。２０μｇ
／ｍｌアンピシリン入りのＬＢ培地で３７℃、１６時間
培養を行った。さらに、２０μｇ／ｍｌアンピシリン入
りのＬＢ培地で２０倍希釈し、３７℃、２時間培養した
後、ＩＰＴＧ２００μｇ／ｍｌになるように添加し、３
時間培養し、発現させた。大腸菌を遠心し、上清を除き
ペレットとして回収した。回収した大腸菌を１００μｌ
の１００ｍＭ塩化ナトリウム、５０ｍＭトリス−塩酸ｐ
Ｈ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡに浮遊させた後、５０μｌ
の３０％ＳＤＳ、１５％２−メルカプトエタノール、１
５％グリセリンを含む緩衝液を加え、攪拌した。さら
に、沸騰水中にて５分間処理した後、粘性が無くなるま
で超音波で処理し、ウエスタンブロットのサンプルとし
た。
を宿主大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入した。２０μｇ
／ｍｌアンピシリン入りのＬＢ培地で３７℃、１６時間
培養を行った。さらに、２０μｇ／ｍｌアンピシリン入
りのＬＢ培地で２０倍希釈し、３７℃、２時間培養した
後、ＩＰＴＧ２００μｇ／ｍｌになるように添加し、３
時間培養し、発現させた。大腸菌を遠心し、上清を除き
ペレットとして回収した。回収した大腸菌を１００μｌ
の１００ｍＭ塩化ナトリウム、５０ｍＭトリス−塩酸ｐ
Ｈ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡに浮遊させた後、５０μｌ
の３０％ＳＤＳ、１５％２−メルカプトエタノール、１
５％グリセリンを含む緩衝液を加え、攪拌した。さら
に、沸騰水中にて５分間処理した後、粘性が無くなるま
で超音波で処理し、ウエスタンブロットのサンプルとし
た。
【００５５】ｐＨＩＶ１５０ａｂｃから精製したペプチ
ドをｐ２４ａｂｃ、ｐＨＩＶ１５０ａから精製したペプ
チドをｐ２４ａ、ｐＨＩＶ１５０ａｂから精製したペプ
チドをｐ２４ａｂ、ｐＨＩＶ１５０ｂから精製したペプ
チドをｐ２４ｂ、ｐＨＩＶ１５０ｂｃから精製したペプ
チドをｐ２４ｂｃ、ｐＨＩＶ１５０ｃから精製したペプ
チドをｐ２４ｃ、ｐＨＩＶ１５１ａ＋から精製したペプ
チドをｐ２４ａ＋、ｐＨＩＶ１５２から精製したペプチ
ドをｐ２５と命名した。
ドをｐ２４ａｂｃ、ｐＨＩＶ１５０ａから精製したペプ
チドをｐ２４ａ、ｐＨＩＶ１５０ａｂから精製したペプ
チドをｐ２４ａｂ、ｐＨＩＶ１５０ｂから精製したペプ
チドをｐ２４ｂ、ｐＨＩＶ１５０ｂｃから精製したペプ
チドをｐ２４ｂｃ、ｐＨＩＶ１５０ｃから精製したペプ
チドをｐ２４ｃ、ｐＨＩＶ１５１ａ＋から精製したペプ
チドをｐ２４ａ＋、ｐＨＩＶ１５２から精製したペプチ
ドをｐ２５と命名した。
【００５６】ｐ２４ａｂｃのアミノ酸配列を配列番号１
６及び塩基配列を配列番号１７に、ｐ２４ａのアミノ酸
配列を配列番号１８及び塩基配列を配列番号１９に、ｐ
２４ａｂのアミノ酸配列を配列番号２０及び塩基配列を
配列番号２１に、ｐ２４ｂのアミノ酸配列を配列番号２
２及び塩基配列を配列番号２３に、ｐ２４ｂｃのアミノ
酸配列を配列番号２４及び塩基配列を配列番号２５に、
ｐ２４ｃのアミノ酸配列を配列番号２６及び塩基配列を
配列番号２７に、ｐ２４ａ＋のアミノ酸配列を配列番号
２８及び塩基配列を配列番号２９に、ｐ２５のアミノ酸
配列を配列番号３０及び塩基配列を配列番号３１に示
す。
６及び塩基配列を配列番号１７に、ｐ２４ａのアミノ酸
配列を配列番号１８及び塩基配列を配列番号１９に、ｐ
２４ａｂのアミノ酸配列を配列番号２０及び塩基配列を
配列番号２１に、ｐ２４ｂのアミノ酸配列を配列番号２
２及び塩基配列を配列番号２３に、ｐ２４ｂｃのアミノ
酸配列を配列番号２４及び塩基配列を配列番号２５に、
ｐ２４ｃのアミノ酸配列を配列番号２６及び塩基配列を
配列番号２７に、ｐ２４ａ＋のアミノ酸配列を配列番号
２８及び塩基配列を配列番号２９に、ｐ２５のアミノ酸
配列を配列番号３０及び塩基配列を配列番号３１に示
す。
【００５７】実施例３ ＨＩＶ−１ｐ２４ 抗原精製
ＨＩＶ−１感染細胞（ＭＯＬＴ−４／ＨＩＶ−１）を１
０％ＦＣＳ（Ｆｅｔａｌ ｃａｌｆ ｓｅｒｕｍ）を含
むＲＰＭＩ１６４０培地で培養し、培養上清から蔗糖密
度勾配遠心法によりウイルスを精製した。精製したウイ
ルスはＴＮＥ緩衝液（ｐＨ７．２）に懸濁し、０．１％
ＳＤＳ及び４ｍＭ ＤＴＴを加え１００℃、５分処理し
た後、１０００ｇ、１０分遠心分離し、上清をウイルス
可溶化不活化液とした。本可溶化不活化液をハイドロオ
キシアパタイトカラムに吸着させ、０．１Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ７．０）でカラムを洗浄した後、０．２５Ｍリ
ン酸緩衝液にてＨＩＶ−１ｐ２４抗原を溶出し、精製ｐ
２４抗原とした。
０％ＦＣＳ（Ｆｅｔａｌ ｃａｌｆ ｓｅｒｕｍ）を含
むＲＰＭＩ１６４０培地で培養し、培養上清から蔗糖密
度勾配遠心法によりウイルスを精製した。精製したウイ
ルスはＴＮＥ緩衝液（ｐＨ７．２）に懸濁し、０．１％
ＳＤＳ及び４ｍＭ ＤＴＴを加え１００℃、５分処理し
た後、１０００ｇ、１０分遠心分離し、上清をウイルス
可溶化不活化液とした。本可溶化不活化液をハイドロオ
キシアパタイトカラムに吸着させ、０．１Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ７．０）でカラムを洗浄した後、０．２５Ｍリ
ン酸緩衝液にてＨＩＶ−１ｐ２４抗原を溶出し、精製ｐ
２４抗原とした。
【００５８】実施例４ モノクローナル抗体の作製
アジュバントとして、実施例２（１）で精製したｐ２４
−２抗原溶液にはフロイントのアジュバントを、実施例
３で調製した精製ｐ２４抗原溶液にはβ−グルカンパウ
ダー（Opti Vant;INTERGEN社製）を懸濁し、それぞれＢ
ＡＬＢ／ｃマウスに一匹当たり２０μｌ／０．５ｍｌを
腹腔内投与にて免疫した。１０日〜２週間の間隔で３回
接種後、マウス尾静脈より採血し、免疫原を固相化した
９６ウェルアッセイプレートを用いたＥＬＩＳＡにより
血清抗体価を調べた。
−２抗原溶液にはフロイントのアジュバントを、実施例
３で調製した精製ｐ２４抗原溶液にはβ−グルカンパウ
ダー（Opti Vant;INTERGEN社製）を懸濁し、それぞれＢ
ＡＬＢ／ｃマウスに一匹当たり２０μｌ／０．５ｍｌを
腹腔内投与にて免疫した。１０日〜２週間の間隔で３回
接種後、マウス尾静脈より採血し、免疫原を固相化した
９６ウェルアッセイプレートを用いたＥＬＩＳＡにより
血清抗体価を調べた。
【００５９】実施例３で調製した抗原については、十分
な抗体応答が得られるまでさらに２回追加免疫を行っ
た。最終免疫から３日後に脾臓を摘出し、ケーラーとミ
ルシュタインの常法（Nature 256,495,1975 ）に従い細
胞融合を行った。親細胞には、マウス骨髄腫細胞株Ｐ３
−Ｘ ６３−Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）を用い、融合剤
にはポリエチレングリコールを用いた。融合した細胞を
ＨＡＴ選択培地にて培養し、約１０日後に培養上清をＥ
ＬＩＳＡによる１次スクリーニングに供した。すなわ
ち、実施例２または３で調製したｐ２４抗原を濃度１μ
ｇ／ｍｌで９６ウエルプレートに固相化し、次にこの培
養上清を反応させ、抗マウスＩｇ−ＰＯＤ（ダコ社製）
により検出した。この様にして選択したウェルの細胞を
限界希釈法によりクローニングし、ハイブリドーマを確
立した。ハイブリドーマｐ２４Ｎ１−９、ハイブリドー
マｐ２４Ｎ３−３、ハイブリドーマｐ２４Ｎ１−２、ハ
イブリドーマｐ２４−２１はＨＩＶ−１ｐ２４に特異的
反応する抗体を産生するハイブリドーマであり、このう
ち、ハイブリドーマｐ２４Ｎ１−９、ハイブリドーマｐ
２４Ｎ３−３は生命工学工業技術研究所に寄託し、その
受託番号はそれぞれＦＥＲＭ Ｐ−１７２７６及びＦＥ
ＲＭ Ｐ−１７２７５ある。
な抗体応答が得られるまでさらに２回追加免疫を行っ
た。最終免疫から３日後に脾臓を摘出し、ケーラーとミ
ルシュタインの常法（Nature 256,495,1975 ）に従い細
胞融合を行った。親細胞には、マウス骨髄腫細胞株Ｐ３
−Ｘ ６３−Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）を用い、融合剤
にはポリエチレングリコールを用いた。融合した細胞を
ＨＡＴ選択培地にて培養し、約１０日後に培養上清をＥ
ＬＩＳＡによる１次スクリーニングに供した。すなわ
ち、実施例２または３で調製したｐ２４抗原を濃度１μ
ｇ／ｍｌで９６ウエルプレートに固相化し、次にこの培
養上清を反応させ、抗マウスＩｇ−ＰＯＤ（ダコ社製）
により検出した。この様にして選択したウェルの細胞を
限界希釈法によりクローニングし、ハイブリドーマを確
立した。ハイブリドーマｐ２４Ｎ１−９、ハイブリドー
マｐ２４Ｎ３−３、ハイブリドーマｐ２４Ｎ１−２、ハ
イブリドーマｐ２４−２１はＨＩＶ−１ｐ２４に特異的
反応する抗体を産生するハイブリドーマであり、このう
ち、ハイブリドーマｐ２４Ｎ１−９、ハイブリドーマｐ
２４Ｎ３−３は生命工学工業技術研究所に寄託し、その
受託番号はそれぞれＦＥＲＭ Ｐ−１７２７６及びＦＥ
ＲＭ Ｐ−１７２７５ある。
【００６０】各ハイブリドーマを、あらかじめプリスタ
ン０．５ｍｌを腹腔に投与したマウスの腹腔内に、１匹
当たり約１ｘ１０7 個接種した。１週間から１０日後に
貯留した腹水を採取し、プロテインＡカラム（バイオラ
ッド社製）、ＭＡＰＳ−ＩＩキット緩衝液を用いてモノ
クローナル抗体を精製した。ハイブリドーマｐ２４Ｎ１
−９、ハイブリドーマｐ２４Ｎ３−３、ハイブリドーマ
ｐ２４Ｎ１−２、ハイブリドーマｐ２４−２１が産生す
るモノクローナル抗体を、それぞれｐ２４Ｎ１−９抗
体、ｐ２４Ｎ３−３抗体、ｐ２４Ｎ１−２抗体、ｐ２４
−２１抗体と命名した。
ン０．５ｍｌを腹腔に投与したマウスの腹腔内に、１匹
当たり約１ｘ１０7 個接種した。１週間から１０日後に
貯留した腹水を採取し、プロテインＡカラム（バイオラ
ッド社製）、ＭＡＰＳ−ＩＩキット緩衝液を用いてモノ
クローナル抗体を精製した。ハイブリドーマｐ２４Ｎ１
−９、ハイブリドーマｐ２４Ｎ３−３、ハイブリドーマ
ｐ２４Ｎ１−２、ハイブリドーマｐ２４−２１が産生す
るモノクローナル抗体を、それぞれｐ２４Ｎ１−９抗
体、ｐ２４Ｎ３−３抗体、ｐ２４Ｎ１−２抗体、ｐ２４
−２１抗体と命名した。
【００６１】各モノクローナル抗体のアイソタイピング
は、アマシャム社製キットを用いたウェスタンブロッテ
イング法により行った。その結果いずれの抗体も、Ｉｇ
Ｇ１、κであった。
は、アマシャム社製キットを用いたウェスタンブロッテ
イング法により行った。その結果いずれの抗体も、Ｉｇ
Ｇ１、κであった。
【００６２】実施例５ モノクローナル抗体の反応性試
験 実施例４で作製したモノクローナル抗体の反応特異性を
ウェスタンブロッティング法により調べた。すなわち、
実施例２で調製したリコンビナント抗原ｐ２４ａ＋、ｐ
２４ａ、ｐ２４ｂ、ｐ２４ｃ、ｐ２４ａｂ、ｐ２４ｂ
ｃ、ｐ２４−２、ｐ２５（ＨＩＶ−２ｇａｇ）及び実施
例３で調製した精製ｐ２４抗原を１０％ＳＤＳ、５％２
−メルカプトエタノール、５％グリセリンを含む緩衝液
に溶解し、１５％ポリアクリルアミドゲルにて電気泳動
し、これをニトロセルロース膜に転写した。この転写膜
を１％スキムミルクを含むＰＢＳ中に４℃で一晩放置
し、マスキングを行った。実施例４で作製したモノクロ
ーナル抗体を含む溶液に転写膜を浸して１時間反応させ
た後、０．０５％ツィーン２０を含むＰＢＳで洗浄し、
ベクタスタインＡＢＣエリートキット（ベクター社）に
より検出して反応性を比較した。結果を表−１に示す。
験 実施例４で作製したモノクローナル抗体の反応特異性を
ウェスタンブロッティング法により調べた。すなわち、
実施例２で調製したリコンビナント抗原ｐ２４ａ＋、ｐ
２４ａ、ｐ２４ｂ、ｐ２４ｃ、ｐ２４ａｂ、ｐ２４ｂ
ｃ、ｐ２４−２、ｐ２５（ＨＩＶ−２ｇａｇ）及び実施
例３で調製した精製ｐ２４抗原を１０％ＳＤＳ、５％２
−メルカプトエタノール、５％グリセリンを含む緩衝液
に溶解し、１５％ポリアクリルアミドゲルにて電気泳動
し、これをニトロセルロース膜に転写した。この転写膜
を１％スキムミルクを含むＰＢＳ中に４℃で一晩放置
し、マスキングを行った。実施例４で作製したモノクロ
ーナル抗体を含む溶液に転写膜を浸して１時間反応させ
た後、０．０５％ツィーン２０を含むＰＢＳで洗浄し、
ベクタスタインＡＢＣエリートキット（ベクター社）に
より検出して反応性を比較した。結果を表−１に示す。
【表１】
【００６３】ｐ２４Ｎ１−９抗体はｐ２４抗原のＮ末
端、ｐ２４Ｎ３−３抗体はｐ２４抗原の中間部位、ｐ２
４Ｎ１−２抗体はｐ２４抗原の中間部位よりＣ末端側、
ｐ２４−２１抗体はｐ２４抗原のＣ末端領域を認識して
いることが示された。
端、ｐ２４Ｎ３−３抗体はｐ２４抗原の中間部位、ｐ２
４Ｎ１−２抗体はｐ２４抗原の中間部位よりＣ末端側、
ｐ２４−２１抗体はｐ２４抗原のＣ末端領域を認識して
いることが示された。
【００６４】実施例６ モノクローナル抗体の組み合わ
せ試験によるエピトープ分類 実施例４で作製したｐ２４−２１抗体及び実施例４に記
載の方法と同様の手法で作製した抗ＨＩＶ−１ｐ２４モ
ノクローナル抗体ＹＡＭ２４−１２抗体、ＹＡＭ２４−
７抗体、ＹＡＭ２４−９抗体の４種類について、それぞ
れ抗体感作粒子及びＡＬＰ標識抗体を作製し、組み合わ
せ試験によってどのような反応性を示すかを検討した。
せ試験によるエピトープ分類 実施例４で作製したｐ２４−２１抗体及び実施例４に記
載の方法と同様の手法で作製した抗ＨＩＶ−１ｐ２４モ
ノクローナル抗体ＹＡＭ２４−１２抗体、ＹＡＭ２４−
７抗体、ＹＡＭ２４−９抗体の４種類について、それぞ
れ抗体感作粒子及びＡＬＰ標識抗体を作製し、組み合わ
せ試験によってどのような反応性を示すかを検討した。
【００６５】（１）抗体結合粒子の調製
５０ｍｇ／ｍｌフェライト粒子（日本ペイント社製）を
０．１５ｍｌとり、これに７２０μｇ／ｍｌのＹＡＭ２
４−１２抗体溶液を２８０μｌ加え、撹拌後、２５℃１
時間エンドオーバーエンドで撹拌を続けた。フェライト
粒子を磁石で集磁し、上清を抜き取った後に０．４％Ｎ
ａＣｌ溶液で２回洗浄し、２％ＢＳＡを含む５０ｍＭト
リス緩衝液ｐＨ７．２を２ｍｌ加え、撹拌し、さらに３
７℃一晩エンドオーバーエンドで撹拌を続けた。これを
２５倍希釈して反応に用いた。ＹＡＭ２４−７抗体、Ｙ
ＡＭ２４−９抗体、ｐ２４−２１抗体についても同様に
抗体結合粒子を作製した。
０．１５ｍｌとり、これに７２０μｇ／ｍｌのＹＡＭ２
４−１２抗体溶液を２８０μｌ加え、撹拌後、２５℃１
時間エンドオーバーエンドで撹拌を続けた。フェライト
粒子を磁石で集磁し、上清を抜き取った後に０．４％Ｎ
ａＣｌ溶液で２回洗浄し、２％ＢＳＡを含む５０ｍＭト
リス緩衝液ｐＨ７．２を２ｍｌ加え、撹拌し、さらに３
７℃一晩エンドオーバーエンドで撹拌を続けた。これを
２５倍希釈して反応に用いた。ＹＡＭ２４−７抗体、Ｙ
ＡＭ２４−９抗体、ｐ２４−２１抗体についても同様に
抗体結合粒子を作製した。
【００６６】（２）ＡＬＰ標識抗体の作製
７２０μｇ／ｍｌのＹＡＭ２４−１２抗体溶液を１．２
ｍｌをとり、０．１Ｍクエン酸緩衝液ｐＨ３．５で平衡
化したＧ−２５カラム（ファルマシア社製）に添加し、
緩衝液置換を行った。これに９４μｇ／ｍｌペプシン溶
液を４３．６μｌ加え、３７℃、１時間放置し、トリス
緩衝液でｐＨを中性付近にしてからスーパーデックス２
００カラム（ファルマシア社製）に添加し、ゲル濾過精
製を行った。得られた分画の吸光度２８０ｎｍでのシン
グルピークをプールし、ＹＡＭ２４−１２抗体Ｆ（a
b’）2 フラグメントとした。このＦ（ab’）2 フラグ
メント溶液１．５３ｍｌに、０．２Ｍ ２−メルカプト
エチルアミン（以下、２−ＭＥＡと記載する）溶液を７
６．５μｌ添加し、３７℃４時間放置し、還元処理を行
った。これをＧ−２５カラムに添加し、２−ＭＥＡを除
去し、ＹＡＭ２４−１２抗体Ｆab’フラグメントとし
た。１０ｍｇ／ｍｌの高比活性ＡＬＰ溶液１ｍｌを０．
１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ６．３で平衡化したＧ−２５に添
加し、緩衝液置換を行った。これに１０ｍｇ／ｍｌ Ｎ
−（４−マレイミドブチリロキシ）−スクシンイミド
（以下、ＧＭＢＳと記載する）のジメチルホルムアミド
溶液を５１．６μｌ添加し、３７℃、１時間放置し反応
を行った。この溶液を０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７．０
で平衡化したＧ−２５カラムに添加し、過剰のＧＭＢＳ
を除去し、マレイミド化ＡＬＰを作製した。先に作製し
たＹＡＭ２４−１２抗体Ｆab’フラグメント溶液２．５
ｍｌとマレイミド化ＡＬＰ溶液２０３．５μｌとを混合
し、室温で一晩放置することでＡＬＰ標識抗体を作製し
た。これに０．５Ｍ ２−ＭＥＡ溶液を５．４μｌ加
え、３７℃、１時間放置し、余分なマレイミド基をブロ
ックした後、スーパーデックス２００カラムに添加し、
精製を行った。吸光度２８０ｎｍのいくつかのピークの
うち、Ｆab’とＡＬＰとが１：１となる分子量のピーク
をプールし、精製ＡＬＰ標識抗体とした。ＹＡＭ２４−
７抗体、ＹＡＭ２４−９抗体、ｐ２４−２１抗体につい
ても同様にＡＬＰ標識抗体を作製した。
ｍｌをとり、０．１Ｍクエン酸緩衝液ｐＨ３．５で平衡
化したＧ−２５カラム（ファルマシア社製）に添加し、
緩衝液置換を行った。これに９４μｇ／ｍｌペプシン溶
液を４３．６μｌ加え、３７℃、１時間放置し、トリス
緩衝液でｐＨを中性付近にしてからスーパーデックス２
００カラム（ファルマシア社製）に添加し、ゲル濾過精
製を行った。得られた分画の吸光度２８０ｎｍでのシン
グルピークをプールし、ＹＡＭ２４−１２抗体Ｆ（a
b’）2 フラグメントとした。このＦ（ab’）2 フラグ
メント溶液１．５３ｍｌに、０．２Ｍ ２−メルカプト
エチルアミン（以下、２−ＭＥＡと記載する）溶液を７
６．５μｌ添加し、３７℃４時間放置し、還元処理を行
った。これをＧ−２５カラムに添加し、２−ＭＥＡを除
去し、ＹＡＭ２４−１２抗体Ｆab’フラグメントとし
た。１０ｍｇ／ｍｌの高比活性ＡＬＰ溶液１ｍｌを０．
１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ６．３で平衡化したＧ−２５に添
加し、緩衝液置換を行った。これに１０ｍｇ／ｍｌ Ｎ
−（４−マレイミドブチリロキシ）−スクシンイミド
（以下、ＧＭＢＳと記載する）のジメチルホルムアミド
溶液を５１．６μｌ添加し、３７℃、１時間放置し反応
を行った。この溶液を０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７．０
で平衡化したＧ−２５カラムに添加し、過剰のＧＭＢＳ
を除去し、マレイミド化ＡＬＰを作製した。先に作製し
たＹＡＭ２４−１２抗体Ｆab’フラグメント溶液２．５
ｍｌとマレイミド化ＡＬＰ溶液２０３．５μｌとを混合
し、室温で一晩放置することでＡＬＰ標識抗体を作製し
た。これに０．５Ｍ ２−ＭＥＡ溶液を５．４μｌ加
え、３７℃、１時間放置し、余分なマレイミド基をブロ
ックした後、スーパーデックス２００カラムに添加し、
精製を行った。吸光度２８０ｎｍのいくつかのピークの
うち、Ｆab’とＡＬＰとが１：１となる分子量のピーク
をプールし、精製ＡＬＰ標識抗体とした。ＹＡＭ２４−
７抗体、ＹＡＭ２４−９抗体、ｐ２４−２１抗体につい
ても同様にＡＬＰ標識抗体を作製した。
【００６７】（３）抗体結合粒子、ＡＬＰ標識抗体を用
いたｐ２４抗原の測定 実施例６（１）で作製した抗体結合粒子を０．１５ｍｇ
／ｍｌとし、この０．２５ｍｌにｐ２４抗原濃度として
０、１２．５、２５、５０、１００ｐｇ／ｍｌの不活化
培養ＨＩＶ抗原溶液をそれぞれ５０μｌづつ添加し、３
７℃で１０分間反応させた。磁石を用いて洗浄後、実施
例６（２）で調製したＡＬＰ標識抗体を０．５μｇ／ｍ
ｌに希釈した溶液を０．２５ｍｌ加え、再び３７℃で１
０分間反応させた。磁石を用いて洗浄後、化学発光基質
である３−（２’−スピロアダマンタン）−４−メトキ
シ−４−（３”−ホスホリルオキシ）フェニル−１、２
−ジオキセタン・２ナトリウム塩（ＡＭＰＰＤ）２００
μｌを加え、３７℃、５分反応させて、発光量をルミノ
メーターで測定した。実際の測定は全自動化学発光免疫
測定装置ルミパルスｆ（富士レビオ社製）にて行った。
いたｐ２４抗原の測定 実施例６（１）で作製した抗体結合粒子を０．１５ｍｇ
／ｍｌとし、この０．２５ｍｌにｐ２４抗原濃度として
０、１２．５、２５、５０、１００ｐｇ／ｍｌの不活化
培養ＨＩＶ抗原溶液をそれぞれ５０μｌづつ添加し、３
７℃で１０分間反応させた。磁石を用いて洗浄後、実施
例６（２）で調製したＡＬＰ標識抗体を０．５μｇ／ｍ
ｌに希釈した溶液を０．２５ｍｌ加え、再び３７℃で１
０分間反応させた。磁石を用いて洗浄後、化学発光基質
である３−（２’−スピロアダマンタン）−４−メトキ
シ−４−（３”−ホスホリルオキシ）フェニル−１、２
−ジオキセタン・２ナトリウム塩（ＡＭＰＰＤ）２００
μｌを加え、３７℃、５分反応させて、発光量をルミノ
メーターで測定した。実際の測定は全自動化学発光免疫
測定装置ルミパルスｆ（富士レビオ社製）にて行った。
【００６８】上記の試験を、ＹＡＭ２４−１２抗体、Ｙ
ＡＭ２４−７抗体、ＹＡＭ２４−９抗体、ｐ２４−２１
抗体をそれぞれ結合した４種類の抗体結合粒子と、ＹＡ
Ｍ２４−１２抗体、ＹＡＭ２４−７抗体、ＹＡＭ２４−
９抗体、ｐ２４−２１抗体をそれぞれ標識した４種類の
ＡＬＰ標識抗体との組み合わせで行い、計１６種類の試
験を行った。
ＡＭ２４−７抗体、ＹＡＭ２４−９抗体、ｐ２４−２１
抗体をそれぞれ結合した４種類の抗体結合粒子と、ＹＡ
Ｍ２４−１２抗体、ＹＡＭ２４−７抗体、ＹＡＭ２４−
９抗体、ｐ２４−２１抗体をそれぞれ標識した４種類の
ＡＬＰ標識抗体との組み合わせで行い、計１６種類の試
験を行った。
【００６９】組み合わせ試験の結果を図２から５に示
す。抗体の組み合わせ試験の結果、ＹＡＭ２４−１２抗
体を固相とした時にはＹＡＭ２４−７抗体、ＹＡＭ２４
−９抗体を標識体としたときのみｐ２４抗原の測定が可
能であり、ＹＡＭ２４−１２抗体、ｐ２４−２１抗体を
標識体とした時には反応がほとんど見られず測定不可能
であった（図２）。ｐ２４−２１抗体を固相にしたとき
にも同様な結果が得られた（図３）。逆にＹＡＭ２４−
７抗体（図４）、ＹＡＭ２４−９抗体（図５）を固相に
したときには、ＹＡＭ２４−１２抗体、ｐ２４−２１抗
体を標識体としたときのみｐ２４抗原の測定が可能であ
り、ＹＡＭ２４−７抗体、ＹＡＭ２４−９抗体を標識体
としたときには反応がほとんど見られなかった。
す。抗体の組み合わせ試験の結果、ＹＡＭ２４−１２抗
体を固相とした時にはＹＡＭ２４−７抗体、ＹＡＭ２４
−９抗体を標識体としたときのみｐ２４抗原の測定が可
能であり、ＹＡＭ２４−１２抗体、ｐ２４−２１抗体を
標識体とした時には反応がほとんど見られず測定不可能
であった（図２）。ｐ２４−２１抗体を固相にしたとき
にも同様な結果が得られた（図３）。逆にＹＡＭ２４−
７抗体（図４）、ＹＡＭ２４−９抗体（図５）を固相に
したときには、ＹＡＭ２４−１２抗体、ｐ２４−２１抗
体を標識体としたときのみｐ２４抗原の測定が可能であ
り、ＹＡＭ２４−７抗体、ＹＡＭ２４−９抗体を標識体
としたときには反応がほとんど見られなかった。
【００７０】この測定系では抗体と抗体とで抗原を挟む
サンドイッチ法を使用しているため、同じエピトープを
認識する抗体同士の組み合わせでは反応がみられない。
したがって、上記の結果から、４種類のモノクローナル
抗体は、ＹＡＭ２４−１２抗体とｐ２４ー２１抗体、Ｙ
ＡＭ２４−７抗体とＹＡＭ２４−９抗体の２つのグルー
プに分けることができ、各グループ内の抗体は同じエピ
トープ部位あるいは近傍を認識をしていると判断した。
サンドイッチ法を使用しているため、同じエピトープを
認識する抗体同士の組み合わせでは反応がみられない。
したがって、上記の結果から、４種類のモノクローナル
抗体は、ＹＡＭ２４−１２抗体とｐ２４ー２１抗体、Ｙ
ＡＭ２４−７抗体とＹＡＭ２４−９抗体の２つのグルー
プに分けることができ、各グループ内の抗体は同じエピ
トープ部位あるいは近傍を認識をしていると判断した。
【００７１】実施例７ 抗ｐ２４ポリクローナル抗体の
作製 実施例２で作製したｐ２４ａｂｃ及び実施例３で精製し
た天然ｐ２４抗原を免疫原として、フロイントの完全ア
ジュバントと等量混合した。天然抗原は家兎２羽、ｐ２
４ａｂｃは家兎４羽を用い、エマルジョン化した抗原を
それぞれ３００μｇづつ皮下免疫した。１〜２週間おき
に計７回追加免疫し、マイクロオクタロニー法で抗体力
価が上昇したことを確認して、全採血した。遠心法にて
血清を分離し、それぞれの抗血清を、天然ｐ24抗原を用
いたものをＲ−１、Ｒ−２、リコンビナント抗原を用い
たものをＲ−３、Ｒ−４、Ｒ−５、Ｒ−６と命名した。
次いで、ｐ２４ａｂｃを固相化したセファロース４Ｂの
アフィニティーカラムでＲ−１〜Ｒ−６の抗血清をそれ
ぞれ精製し、抗ｐ２４ポリクローナル抗体Ｒ−１〜Ｒ−
６とした。
作製 実施例２で作製したｐ２４ａｂｃ及び実施例３で精製し
た天然ｐ２４抗原を免疫原として、フロイントの完全ア
ジュバントと等量混合した。天然抗原は家兎２羽、ｐ２
４ａｂｃは家兎４羽を用い、エマルジョン化した抗原を
それぞれ３００μｇづつ皮下免疫した。１〜２週間おき
に計７回追加免疫し、マイクロオクタロニー法で抗体力
価が上昇したことを確認して、全採血した。遠心法にて
血清を分離し、それぞれの抗血清を、天然ｐ24抗原を用
いたものをＲ−１、Ｒ−２、リコンビナント抗原を用い
たものをＲ−３、Ｒ−４、Ｒ−５、Ｒ−６と命名した。
次いで、ｐ２４ａｂｃを固相化したセファロース４Ｂの
アフィニティーカラムでＲ−１〜Ｒ−６の抗血清をそれ
ぞれ精製し、抗ｐ２４ポリクローナル抗体Ｒ−１〜Ｒ−
６とした。
【００７２】実施例８ ＡＬＰ標識抗ｐ２４ポリクロー
ナル抗体を使った測定 （１）ＡＬＰ標識抗ｐ２４ポリクローナル抗体の調製 実施例７で作製した抗ｐ２４ポリクローナル抗体Ｒ−１
を２．０ｍｇ／ｍｌの濃度にし、この０．８１ｍｌを
０．１Ｍクエン酸緩衝液ｐＨ３．５で平衡化したＧ−２
５カラム（ファルマシア社製）に添加し、緩衝液置換を
行った。これに３２９μｇ／ｍｌペプシン溶液を２４．
６μｌ加え、３７℃、１時間放置し、トリス緩衝液でｐ
Ｈを中性付近にしてからスーパーデックス２００カラム
（ファルマシア社製）に添加し、ゲル濾過精製を行っ
た。分画の吸光度２８０ｎｍでのシングルピークをプー
ルし、抗ｐ２４ポリクローナル抗体Ｆ（ab’）2 フラグ
メントとした。
ナル抗体を使った測定 （１）ＡＬＰ標識抗ｐ２４ポリクローナル抗体の調製 実施例７で作製した抗ｐ２４ポリクローナル抗体Ｒ−１
を２．０ｍｇ／ｍｌの濃度にし、この０．８１ｍｌを
０．１Ｍクエン酸緩衝液ｐＨ３．５で平衡化したＧ−２
５カラム（ファルマシア社製）に添加し、緩衝液置換を
行った。これに３２９μｇ／ｍｌペプシン溶液を２４．
６μｌ加え、３７℃、１時間放置し、トリス緩衝液でｐ
Ｈを中性付近にしてからスーパーデックス２００カラム
（ファルマシア社製）に添加し、ゲル濾過精製を行っ
た。分画の吸光度２８０ｎｍでのシングルピークをプー
ルし、抗ｐ２４ポリクローナル抗体Ｆ（ab’）2 フラグ
メントとした。
【００７３】このＦ（ab’）2 フラグメント溶液（５６
７μｇ／ｍｌ）１．４５ｍｌに０．２Ｍ ２−ＭＥＡ溶
液７６．３μｌを添加し、３７℃４時間放置し、還元処
理をおこなった。これをＧ−２５カラムに添加し、２−
ＭＥＡを除去し、抗ｐ２４ポリクローナル抗体Ｆab’フ
ラグメントとした。
７μｇ／ｍｌ）１．４５ｍｌに０．２Ｍ ２−ＭＥＡ溶
液７６．３μｌを添加し、３７℃４時間放置し、還元処
理をおこなった。これをＧ−２５カラムに添加し、２−
ＭＥＡを除去し、抗ｐ２４ポリクローナル抗体Ｆab’フ
ラグメントとした。
【００７４】１０ｍｇ／ｍｌの高比活性ＡＬＰ溶液１ｍ
ｌを０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ６．３で平衡化したＧ−
２５に添加し、緩衝液置換を行った。これに１０ｍｇ／
ｍｌＧＭＢＳジメチルホルムアミド溶液を５３．５μｌ
添加し、３７℃、１時間放置し反応を行った。この溶液
を０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７．０で平衡化したＧ−２
５カラムに添加し、過剰のＧＭＢＳを除去し、マレイミ
ド化ＡＬＰを作製した。
ｌを０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ６．３で平衡化したＧ−
２５に添加し、緩衝液置換を行った。これに１０ｍｇ／
ｍｌＧＭＢＳジメチルホルムアミド溶液を５３．５μｌ
添加し、３７℃、１時間放置し反応を行った。この溶液
を０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７．０で平衡化したＧ−２
５カラムに添加し、過剰のＧＭＢＳを除去し、マレイミ
ド化ＡＬＰを作製した。
【００７５】先に作製した抗ｐ２４ポリクローナル抗体
Ｆab’フラグメント溶液２．５ｍｌとマレイミド化ＡＬ
Ｐ溶液６０８μｌとを混合し、室温で一晩放置し、ＡＬ
Ｐ標識抗体を作製した。これに１Ｍ ２−ＭＥＡ溶液を
３１μｌ加え、３７℃、１時間放置し、余分なマレイミ
ド基をブロックした後、スーパーデックス２００カラム
に添加し、精製を行った。吸光度２８０ｎｍのいくつか
のピークのうち、Ｆａｂ’とＡＬＰとが１：１となる分
子量のピークをプールし、精製ＡＬＰ標識抗ｐ２４ポリ
クローナル抗体Ｒ−１とした。
Ｆab’フラグメント溶液２．５ｍｌとマレイミド化ＡＬ
Ｐ溶液６０８μｌとを混合し、室温で一晩放置し、ＡＬ
Ｐ標識抗体を作製した。これに１Ｍ ２−ＭＥＡ溶液を
３１μｌ加え、３７℃、１時間放置し、余分なマレイミ
ド基をブロックした後、スーパーデックス２００カラム
に添加し、精製を行った。吸光度２８０ｎｍのいくつか
のピークのうち、Ｆａｂ’とＡＬＰとが１：１となる分
子量のピークをプールし、精製ＡＬＰ標識抗ｐ２４ポリ
クローナル抗体Ｒ−１とした。
【００７６】抗ｐ２４ポリクローナル抗体Ｒ−２〜Ｒ−
６についても同様の手法で、ＡＬＰ標識抗ｐ２４ポリク
ローナル抗体Ｒ−２〜Ｒ−６を作製した。
６についても同様の手法で、ＡＬＰ標識抗ｐ２４ポリク
ローナル抗体Ｒ−２〜Ｒ−６を作製した。
【００７７】（２）標識ポリクローナル抗体とモノクロ
ーナル抗体固相を用いた組み合わせ測定 実施例６（１）で作製したＹＡＭ２４−１２抗体、ＹＡ
Ｍ２４−７抗体、ＹＡＭ２４−９抗体及びｐ２４−２１
抗体結合粒子を０．１５ｍｇ/ ｍｌの濃度にし、この
０．２５ｍｌにｐ２４抗原濃度として０、１２．５、２
５、５０、１００ｐｇ／ｍｌの不活化培養ＨＩＶ抗原溶
液をそれぞれ５０μｌづつ添加し、３７℃で１０分間反
応させた。磁石を用いて洗浄後、実施例８（１）で調製
したＡＬＰ標識抗ｐ２４ポリクローナル抗体Ｒ−１を
１．０μｇ／ｍｌに希釈した溶液を０．２５ｍｌ加え、
再び３７℃で１０分間反応させた。磁石を用いて洗浄
後、ＡＭＰＰＤを２００μｌ加え、３７℃、５分反応さ
せて、発光量をルミノメーターで測定した。実際の測定
は全自動化学発光免疫測定装置ルミパルスｆ（富士レビ
オ社製）にて行った。
ーナル抗体固相を用いた組み合わせ測定 実施例６（１）で作製したＹＡＭ２４−１２抗体、ＹＡ
Ｍ２４−７抗体、ＹＡＭ２４−９抗体及びｐ２４−２１
抗体結合粒子を０．１５ｍｇ/ ｍｌの濃度にし、この
０．２５ｍｌにｐ２４抗原濃度として０、１２．５、２
５、５０、１００ｐｇ／ｍｌの不活化培養ＨＩＶ抗原溶
液をそれぞれ５０μｌづつ添加し、３７℃で１０分間反
応させた。磁石を用いて洗浄後、実施例８（１）で調製
したＡＬＰ標識抗ｐ２４ポリクローナル抗体Ｒ−１を
１．０μｇ／ｍｌに希釈した溶液を０．２５ｍｌ加え、
再び３７℃で１０分間反応させた。磁石を用いて洗浄
後、ＡＭＰＰＤを２００μｌ加え、３７℃、５分反応さ
せて、発光量をルミノメーターで測定した。実際の測定
は全自動化学発光免疫測定装置ルミパルスｆ（富士レビ
オ社製）にて行った。
【００７８】結果を図６に示す。図６に示すように、固
相にＹＡＭ２４−７抗体、ＹＡＭ２４−９抗体を使用し
た時に標準曲線の傾きは大きくなり、高い感度が得られ
た。一方、ＹＡＭ２４−１２抗体、ｐ２４−２１抗体を
使用した時には傾きは小さく、ＹＡＭ２４−７抗体、Ｙ
ＡＭ２４−９抗体に対して３０％程度しか感度が得られ
なかった。
相にＹＡＭ２４−７抗体、ＹＡＭ２４−９抗体を使用し
た時に標準曲線の傾きは大きくなり、高い感度が得られ
た。一方、ＹＡＭ２４−１２抗体、ｐ２４−２１抗体を
使用した時には傾きは小さく、ＹＡＭ２４−７抗体、Ｙ
ＡＭ２４−９抗体に対して３０％程度しか感度が得られ
なかった。
【００７９】同様の実験をＡＬＰ標識抗ｐ−２４ポリク
ローナル抗体Ｒ−２〜Ｒ−６についても行ったが、ＹＡ
Ｍ２４−１２抗体、ＹＡＭ２４−７抗体、ＹＡＭ２４−
９抗体、ｐ２４−２１抗体に対する反応性は、ＡＬＰ標
識抗ｐ−２４ポリクローナル抗体Ｒ−１と同様であっ
た。
ローナル抗体Ｒ−２〜Ｒ−６についても行ったが、ＹＡ
Ｍ２４−１２抗体、ＹＡＭ２４−７抗体、ＹＡＭ２４−
９抗体、ｐ２４−２１抗体に対する反応性は、ＡＬＰ標
識抗ｐ−２４ポリクローナル抗体Ｒ−１と同様であっ
た。
【００８０】これらの結果を、実施例６の結果と同様に
解釈して、Ｒ−１からＲ−６のポリクローナル抗体は、
その主要認識部位がＹＡＭ２４−１２抗体、ｐ２４−２
１抗体抗体と同じ分類に属すると判断した。ポリクロー
ナル抗体は本来、抗原に対して広くエピトープを取り、
複数のエピトープを認識する抗体の集まりであるとされ
ているが、この実施例では、抗体の多くはｐ２４−２１
抗体と同じ認識部位、すなわちｐ２４抗原Ｃ末端領域を
認識し、ＹＡＭ２４−７抗体、ＹＡＭ２４−９抗体と競
合するような認識部位を持つ抗体はほとんど含まれてい
なかった。
解釈して、Ｒ−１からＲ−６のポリクローナル抗体は、
その主要認識部位がＹＡＭ２４−１２抗体、ｐ２４−２
１抗体抗体と同じ分類に属すると判断した。ポリクロー
ナル抗体は本来、抗原に対して広くエピトープを取り、
複数のエピトープを認識する抗体の集まりであるとされ
ているが、この実施例では、抗体の多くはｐ２４−２１
抗体と同じ認識部位、すなわちｐ２４抗原Ｃ末端領域を
認識し、ＹＡＭ２４−７抗体、ＹＡＭ２４−９抗体と競
合するような認識部位を持つ抗体はほとんど含まれてい
なかった。
【００８１】（３）ＡＬＰ標識抗ｐ２４ポリクローナル
抗体の作製 実施例７で作製したポリクローナル抗体の主要認識部位
は、いずれもｐ２４抗原Ｃ末端領域であったので、抗ｐ
２４ポリクローナル抗体Ｒ−３、Ｒ−４、Ｒ−５及びＲ
−６をプールし、実施例８（１）に記載の手法と同様に
してＡＬＰ標識を行い、ＡＬＰ標識抗ｐ２４ポリクロー
ナル抗体として、以後の実験に用いた。
抗体の作製 実施例７で作製したポリクローナル抗体の主要認識部位
は、いずれもｐ２４抗原Ｃ末端領域であったので、抗ｐ
２４ポリクローナル抗体Ｒ−３、Ｒ−４、Ｒ−５及びＲ
−６をプールし、実施例８（１）に記載の手法と同様に
してＡＬＰ標識を行い、ＡＬＰ標識抗ｐ２４ポリクロー
ナル抗体として、以後の実験に用いた。
【００８２】実施例９ モノクローナル抗体ｐ２４Ｎ１
−９抗体、ｐ２４Ｎ３−３抗体とポリクローナル抗体を
用いたｐ２４抗原の測定 （１）ｐ２４Ｎ１−９抗体及びｐ２４Ｎ３−３抗体結合
粒子の調製 ５０ｍｇ／ｍｌのフェライト粒子（日本ペイント社製）
０．０７５ｍｌに、実施例４で調製したモノクローナル
抗体ｐ２４Ｎ１−９抗体を７．１５ｍｇ／ｍｌの濃度に
した溶液を１４μｌ加え、撹拌後、２５℃１時間エンド
オーバーエンドで撹拌を続けた。フェライト粒子を磁石
で集磁し、上清を抜き取った後に０．４％ＮａＣｌ溶液
で２回洗浄し、２％ＢＳＡを含む５０ｍＭ炭酸緩衝液ｐ
Ｈ９．０を２ｍｌ加え、撹拌し、さらに３７℃一晩エン
ドオーバーエンドで撹拌を続けｐ２４Ｎ１−９抗体結合
粒子を調製した。
−９抗体、ｐ２４Ｎ３−３抗体とポリクローナル抗体を
用いたｐ２４抗原の測定 （１）ｐ２４Ｎ１−９抗体及びｐ２４Ｎ３−３抗体結合
粒子の調製 ５０ｍｇ／ｍｌのフェライト粒子（日本ペイント社製）
０．０７５ｍｌに、実施例４で調製したモノクローナル
抗体ｐ２４Ｎ１−９抗体を７．１５ｍｇ／ｍｌの濃度に
した溶液を１４μｌ加え、撹拌後、２５℃１時間エンド
オーバーエンドで撹拌を続けた。フェライト粒子を磁石
で集磁し、上清を抜き取った後に０．４％ＮａＣｌ溶液
で２回洗浄し、２％ＢＳＡを含む５０ｍＭ炭酸緩衝液ｐ
Ｈ９．０を２ｍｌ加え、撹拌し、さらに３７℃一晩エン
ドオーバーエンドで撹拌を続けｐ２４Ｎ１−９抗体結合
粒子を調製した。
【００８３】同様にｐ２４Ｎ３−３抗体（８．４１ｍｇ
／ｍｌ）１２μｌを用いてｐ２４Ｎ３−３抗体結合粒子
を調製した。
／ｍｌ）１２μｌを用いてｐ２４Ｎ３−３抗体結合粒子
を調製した。
【００８４】（２）ｐ２４標準抗原の測定
実施例９（１）で調製した２種類の抗体結合粒子を１．
８７５ｍｇ／ｍｌの濃度にし、これをそれぞれ１０μｌ
ずつ取り、粒子の上清のみを除去したのちに反応溶液
（５０ｍＭトリス緩衝液ｐＨ７．２、０．１５％ＮａＣ
ｌ、２％ＢＳＡ、１ｍＭエチレンジアミン４酢酸、０．
１％アジ化ナトリウム）を２５０μｌと、ｐ２４抗原濃
度として０、１２．５、２５、５０、１００ｐｇ／ｍｌ
のＨＩＶ−１ｐ２４標準抗原溶液（ダイナボット社製）
を１００μｌ添加し、３７℃で１０分間反応させた。磁
石を用いて洗浄後、実施例８（３）で作製した精製ＡＬ
Ｐ標識抗ｐ２４ポリクローナル抗体を１．０μｇ／ｍｌ
に希釈した溶液を０．２５ｍｌ加え、再び３７℃で１０
分間反応させた。磁石を用いて洗浄後、ＡＭＰＰＤ２０
０μｌを加え、３７℃、５分反応させて、発光量をルミ
ノメーターで測定した。実際の測定は全自動化学発光免
疫測定装置ルミパルスｆ（富士レビオ社製）にて行っ
た。結果を図７及び８に示す。縦軸は、カットオフ値を
１．０としたカットオフインデックス値（Ｃ．Ｏ．
Ｉ．）で示した。Ｃ．Ｏ．Ｉ．値１．０におけるｐ２４
抗原の濃度は約４ｐｇ／ｍｌとなった。
８７５ｍｇ／ｍｌの濃度にし、これをそれぞれ１０μｌ
ずつ取り、粒子の上清のみを除去したのちに反応溶液
（５０ｍＭトリス緩衝液ｐＨ７．２、０．１５％ＮａＣ
ｌ、２％ＢＳＡ、１ｍＭエチレンジアミン４酢酸、０．
１％アジ化ナトリウム）を２５０μｌと、ｐ２４抗原濃
度として０、１２．５、２５、５０、１００ｐｇ／ｍｌ
のＨＩＶ−１ｐ２４標準抗原溶液（ダイナボット社製）
を１００μｌ添加し、３７℃で１０分間反応させた。磁
石を用いて洗浄後、実施例８（３）で作製した精製ＡＬ
Ｐ標識抗ｐ２４ポリクローナル抗体を１．０μｇ／ｍｌ
に希釈した溶液を０．２５ｍｌ加え、再び３７℃で１０
分間反応させた。磁石を用いて洗浄後、ＡＭＰＰＤ２０
０μｌを加え、３７℃、５分反応させて、発光量をルミ
ノメーターで測定した。実際の測定は全自動化学発光免
疫測定装置ルミパルスｆ（富士レビオ社製）にて行っ
た。結果を図７及び８に示す。縦軸は、カットオフ値を
１．０としたカットオフインデックス値（Ｃ．Ｏ．
Ｉ．）で示した。Ｃ．Ｏ．Ｉ．値１．０におけるｐ２４
抗原の濃度は約４ｐｇ／ｍｌとなった。
【００８５】実施例１０ 既存測定系との感度比較
（１）ダイナボット社ＨＩＶ抗原・ＥＩＡ「アボット」
での測定 既存測定系としてダイナボット社ＨＩＶ抗原・ＥＩＡ
「アボット」キットを用い、測定は添付の手順書に従っ
て行った。すなわち、反応トレーに実施例９（２）で使
用したＨＩＶ−１ｐ２４標準抗原液及びコントロール検
体を２００μｌづつ分注し、これにＨＩＶ抗体ビーズを
入れて４０℃３時間反応させた。コントロール検体は、
検体２００μｌに検体希釈液２０μｌを添加して用い
た。ビーズの洗浄後、ＨＩＶ抗体２００μｌを添加し、
再び４０℃で１時間反応させた後、ビーズを洗浄し、抗
ＩｇＧ抗体ーペルオキシダーゼを２００μｌ加え、４０
℃、１時間反応させた。これを洗浄後、ペルオキシダー
ゼの基質であるオルトフェニレンジアミン二塩酸塩溶液
を３００μｌ添加し、１５〜３０℃、３０分間反応させ
た後１Ｎ硫酸を加えて反応を停止した。この溶液の吸光
度４９２ｎｍの吸光度を測定した。結果を図９及び１０
に示す。この測定キットでは、陰性コントロール３例の
平均吸光度に０．０５を加えた数値がカットオフ値とな
る。縦軸はカットオフ値を１．０としたカットオフイン
デックス値（Ｃ．Ｏ．Ｉ．）で示した。したがって、カ
ットオフ値でのｐ２４抗原の濃度は約１２ｐｇ／ｍｌと
なった。
での測定 既存測定系としてダイナボット社ＨＩＶ抗原・ＥＩＡ
「アボット」キットを用い、測定は添付の手順書に従っ
て行った。すなわち、反応トレーに実施例９（２）で使
用したＨＩＶ−１ｐ２４標準抗原液及びコントロール検
体を２００μｌづつ分注し、これにＨＩＶ抗体ビーズを
入れて４０℃３時間反応させた。コントロール検体は、
検体２００μｌに検体希釈液２０μｌを添加して用い
た。ビーズの洗浄後、ＨＩＶ抗体２００μｌを添加し、
再び４０℃で１時間反応させた後、ビーズを洗浄し、抗
ＩｇＧ抗体ーペルオキシダーゼを２００μｌ加え、４０
℃、１時間反応させた。これを洗浄後、ペルオキシダー
ゼの基質であるオルトフェニレンジアミン二塩酸塩溶液
を３００μｌ添加し、１５〜３０℃、３０分間反応させ
た後１Ｎ硫酸を加えて反応を停止した。この溶液の吸光
度４９２ｎｍの吸光度を測定した。結果を図９及び１０
に示す。この測定キットでは、陰性コントロール３例の
平均吸光度に０．０５を加えた数値がカットオフ値とな
る。縦軸はカットオフ値を１．０としたカットオフイン
デックス値（Ｃ．Ｏ．Ｉ．）で示した。したがって、カ
ットオフ値でのｐ２４抗原の濃度は約１２ｐｇ／ｍｌと
なった。
【００８６】実施例９（２）で求めた本測定系における
カットオフ値のｐ２４抗原濃度は約４ｐｇ／ｍｌ、本実
施例で求めたダイナボット社ＨＩＶ抗原・ＥＩＡ「アボ
ット」でのカットオフ値のｐ２４抗原濃度は約１２ｐｇ
／ｍｌで、差は約３倍であった。
カットオフ値のｐ２４抗原濃度は約４ｐｇ／ｍｌ、本実
施例で求めたダイナボット社ＨＩＶ抗原・ＥＩＡ「アボ
ット」でのカットオフ値のｐ２４抗原濃度は約１２ｐｇ
／ｍｌで、差は約３倍であった。
【００８７】ダイナボット社キットは検体量２００μ
ｌ、１次反応時間３時間、２次反応１時間、３次反応１
時間、酵素反応３０分であるのに対し、本測定系は検体
量１００μｌ、１次反応時間１０分、２次反応１０分、
酵素反応５分である。両測定系を比較すると、既存のダ
イナボット社キットに比べて、本測定系は検体量が１／
２倍、測定感度３倍、免疫反応時間１／１２倍であっ
た。感度は検体量、免疫反応時間に影響されるため、既
存法に比べて検体量が少なくかつ免疫反応時間が短い本
測定系の測定感度が既存法より高い本測定系は、従来に
ない高感度のＨＩＶ−１ｐ２４測定系であると判断し
た。
ｌ、１次反応時間３時間、２次反応１時間、３次反応１
時間、酵素反応３０分であるのに対し、本測定系は検体
量１００μｌ、１次反応時間１０分、２次反応１０分、
酵素反応５分である。両測定系を比較すると、既存のダ
イナボット社キットに比べて、本測定系は検体量が１／
２倍、測定感度３倍、免疫反応時間１／１２倍であっ
た。感度は検体量、免疫反応時間に影響されるため、既
存法に比べて検体量が少なくかつ免疫反応時間が短い本
測定系の測定感度が既存法より高い本測定系は、従来に
ない高感度のＨＩＶ−１ｐ２４測定系であると判断し
た。
【００８８】
【発明の効果】本発明により、ＨＩＶ−１ｐ２４抗原の
測定方法及び試薬を提供し、ＨＩＶ−１ｐ２４抗原を従
来より高感度で測定することができる。
測定方法及び試薬を提供し、ＨＩＶ−１ｐ２４抗原を従
来より高感度で測定することができる。
【００８９】
【配列表】
<110> FUJIREBIO INC.
<120> Immunoassay Method for HIV-1 p24 antigen and kit
<130> P0728
<160> 31
【００９０】
<210> 1
<211> 879
<212> DNA
<213> HIV-1
<400>
atg acc atg att acg cca agc ttg gct gca tgg gta aaa gta ata gaa
Met Thr Met Ile Thr Pro Ser Leu Ala Ala Trp Val Lys Val Ile Glu
1 5 10 15
gaa aag gct ttc agc cca gaa gtg ata ccc atg ttt tca gca tta tca
Glu Lys Ala Phe Ser Pro Glu Val Ile Pro Met Phe Ser Ala Leu Ser
20 25 30
gaa gga gcc acc cca caa gat tta aat acc atg cta aac aca gtg ggg
Glu Gly Ala Thr Pro Gln Asp Leu Asn Thr Met Leu Asn Thr Val Gly
35 40 45
gga cat caa gca gcc atg caa atg tta aaa gag acc atc aat gag gaa
Gly His Gln Ala Ala Met Gln Met Leu Lys Glu Thr Ile Asn Glu Glu
50 55 60
gct gca gaa tgg gat aga gtg cat cca gtg cat gca ggg cct att gca
Ala Ala Glu Trp Asp Arg Val His Pro Val His Ala Gly Pro Ile Ala
65 70 75 80
cca ggc cag atg aga gaa cca agg gga agt gat ata gca gga act act
Pro Gly Gln Met Arg Glu Pro Arg Gly Ser Asp Ile Ala Gly Thr Thr
85 90 95
agt acc ctt cag gaa caa ata gga tgg atg aca aac aat cca cct atc
Ser Thr Leu Gln Glu Gln Ile Gly Trp Met Thr Asn Asn Pro Pro Ile
100 105 110
cca gta gga gaa atc tat aaa aga tgg ata atc ctg gga tta aat aaa
Pro Val Gly Glu Ile tyr Lys Arg Trp Ile Ile Leu Gly Leu Asn Lys
115 120 125
ata gta aga atg tat agt cct gtt agt att ctg gac ata aga caa gga
Ile Val Arg Met tyr Ser Pro Val Ser Ile Leu Asp Ile Arg Gln Gly
130 135 140
cca aag gaa ccc ttt aga gac tat gta gat cgg ttc tat aaa act tta
Pro Lys Glu Pro Phe Arg Asp tyr Val Asp Arg Phe tyr Lys Thr Leu
145 150 155 160
aga gcc gag caa gct tca cag gag gta aaa aat tgg atg aca gaa acc
Arg Ala Glu Gln Ala Ser Gln Glu Val Lys Asn Trp Met Thr Glu Thr
165 170 175
ttg ttg gtc caa aat gcg aac cca gac tgt aag act att cta aaa gca
Leu Leu Val Gln Asn Ala Asn Pro Asp Cys Lys Thr Ile Leu Lys Ala
180 185 190
tta gga cca gca gct aca cta gaa gaa atg atg aca gca tgt cag gga
Leu Gly Pro Ala Ala Thr Leu Glu Glu Met Met Thr Ala Cys Gln Gly
195 200 205
gtg ggg gga ccc ggc cat aag gca aga gtg ttg gct gaa gca atg agc
Val Gly Gly Pro Gly His Lys Ala Arg Val Leu Ala Glu Ala Met Ser
210 215 220
caa gta aca aat tca gct acc ata atg atg cag aga ggt aat ttt agg
Gln Val Thr Asn Ser Ala Thr Ile Met Met Gln Arg Gly Asn Phe Arg
225 230 235 240
aac caa aaa aaa act gtt aag tgt ttc aat tgt ggc aaa gaa ggg cac
Asn Gln Lys Lys Thr Val Lys Cys Phe Asn Cys Gly Lys Glu Gly His
245 250 255
ata gcc aaa aat tgc agg gcc cct agg aaa aag ggc tgt tgg aaa tgt
Ile Ala Lys Asn Cys Arg Ala Pro Arg Lys Lys Gly Cys Trp Lys Cys
260 265 270
gga aag gaa gga cac caa atg aaa gat tgt act gag aga cag gct aat
Gly Lys Glu Gly His Gln Met Lys Asp Cys Thr Glu Arg Gln Ala Asn
275 280 285
ttt tta ggg aac tga
Phe Leu Gly Asn
290
【００９１】
<210> 2
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400>
caacatatga ccatgattac gccaagcttg gctgcatggg taaaagtaat ag
【００９２】
<210> 3
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400>
caaagaattc gaacaaatag gatggatgac a
【００９３】
<210> 4
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400>
caaagaattc gaaatgatga cagcatgtca g
【００９４】
<210> 5
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400>
caagaattcc ctatagtgca gaacatccag gggcaaatgg tacatcaggc catatca
【００９５】
<210> 6
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400>
tggtacatca ggccatatca cctagaactt taaatgcatg ggtaaaagta atagaag
【００９６】
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400>
gaactcgagc tgaagggtac tagtagttcc
【００９７】
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400>
gttctcgagt tctagtgtag ctgctggtcc
【００９８】
<210> 9
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400>
gttggatcct tagttcccta aaaaattagc ctgtc
【００９９】
<210> 10
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400>
caacatatgc ctgtacaaca gacaggcggt
【０１００】
<210> 11
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400>
cttctcgagt tatagtctgg ctttttggcc tgg
【０１０１】
<210> 12
<211> 12
<212> PRT
<213> HIV-1
<400>
Pro Ala Ala Thr Leu Glu Glu Met Met Thr Ala Cys
1 5 10
【０１０２】
<210> 13
<211> 27
<212> PRT
<213> HIV-1
<400>
Pro Ile Val Gln Asn Ile Gln Gly Gln Met Val His Gln Ala Ile Ser
1 5 10 15
Pro Arg Thr Leu Asn Ala Trp Val Lys Val Ile
20 25
【０１０３】
<210> 14
<211> 12
<212> PRT
<213> HIV-1
<400>
Thr Thr Ser Thr Leu Gln Glu Gln Ile Gly Trp Met
1 5 10
【０１０４】
<210> 15
<211> 292
<212> PRT
<213> HIV-1
<400>
Met Thr Met Ile Thr Pro Ser Leu Ala Ala Trp Val Lys Val Ile Glu
1 5 10 15
Glu Lys Ala Phe Ser Pro Glu Val Ile Pro Met Phe Ser Ala Leu Ser
20 25 30
Glu Gly Ala Thr Pro Gln Asp Leu Asn Thr Met Leu Asn Thr Val Gly
35 40 45
Gly His Gln Ala Ala Met Gln Met Leu Lys Glu Thr Ile Asn Glu Glu
50 55 60
Ala Ala Glu Trp Asp Arg Val His Pro Val His Ala Gly Pro Ile Ala
65 70 75 80
Pro Gly Gln Met Arg Glu Pro Arg Gly Ser Asp Ile Ala Gly Thr Thr
85 90 95
Ser Thr Leu Gln Glu Gln Ile Gly Trp Met Thr Asn Asn Pro Pro Ile
100 105 110
Pro Val Gly Glu Ile tyr Lys Arg Trp Ile Ile Leu Gly Leu Asn Lys
115 120 125
Ile Val Arg Met tyr Ser Pro Val Ser Ile Leu Asp Ile Arg Gln Gly
130 135 140
Pro Lys Glu Pro Phe Arg Asp tyr Val Asp Arg Phe tyr Lys Thr Leu
145 150 155 160
Arg Ala Glu Gln Ala Ser Gln Glu Val Lys Asn Trp Met Thr Glu Thr
165 170 175
Leu Leu Val Gln Asn Ala Asn Pro Asp Cys Lys Thr Ile Leu Lys Ala
180 185 190
Leu Gly Pro Ala Ala Thr Leu Glu Glu Met Met Thr Ala Cys Gln Gly
195 200 205
Val Gly Gly Pro Gly His Lys Ala Arg Val Leu Ala Glu Ala Met Ser
210 215 220
Gln Val Thr Asn Ser Ala Thr Ile Met Met Gln Arg Gly Asn Phe Arg
225 230 235 240
Asn Gln Lys Lys Thr Val Lys Cys Phe Asn Cys Gly Lys Glu Gly His
245 250 255
Ile Ala Lys Asn Cys Arg Ala Pro Arg Lys Lys Gly Cys Trp Lys Cys
260 265 270
Gly Lys Glu Gly His Gln Met Lys Asp Cys Thr Glu Arg Gln Ala Asn
275 280 285
Phe Leu Gly Asn
290
【０１０５】
<210> 16
>211> 292
<212> PRT
<213> HIV-1
<400>
Met Thr Met Ile Thr Pro Ser Leu Ala Ala Trp Val Lys Val Ile Glu
1 5 10 15
Glu Lys Ala Phe Ser Pro Glu Val Ile Pro Met Phe Ser Ala Leu Ser
20 25 30
Glu Gly Ala Thr Pro Gln Asp Leu Asn Thr Met Leu Asn Thr Val Gly
35 40 45
Gly His Gln Ala Ala Met Gln Met Leu Lys Glu Thr Ile Asn Glu Glu
50 55 60
Ala Ala Glu Trp Asp Arg Val His Pro Val His Ala Gly Pro Ile Ala
65 70 75 80
Pro Gly Gln Met Arg Glu Pro Arg Gly Ser Asp Ile Ala Gly Thr Thr
85 90 95
Ser Thr Leu Gln Glu Gln Ile Gly Trp Met Thr Asn Asn Pro Pro Ile
100 105 110
Pro Val Gly Glu Ile Tyr Lys Arg Trp Ile Ile Leu Gly Leu Asn Lys
115 120 125
Ile Val Arg Met Tyr Ser Pro Val Ser Ile Leu Asp Ile Arg Gln Gly
130 135 140
Pro Lys Glu Pro Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe Tyr Lys Thr Leu
145 150 155 160
Arg Ala Glu Gln Ala Ser Gln Glu Val Lys Asn Trp Met Thr Glu Thr
165 170 175
Leu Leu Val Gln Asn Ala Asn Pro Asp Cys Lys Thr Ile Leu Lys Ala
180 185 190
Leu Gly Pro Ala Ala Thr Leu Glu Glu Met Met Thr Ala Cys Gln Gly
195 200 205
Val Gly Gly Pro Gly His Lys Ala Arg Val Leu Ala Glu Ala Met Ser
210 215 220
Gln Val Thr Asn Ser Ala Thr Ile Met Met Gln Arg Gly Asn Phe Arg
225 230 235 240
Asn Gln Lys Lys Thr Val Lys Cys Phe Asn Cys Gly Lys Glu Gly His
245 250 255
Ile Ala Lys Asn Cys Arg Ala Pro Arg Lys Lys Gly Cys Trp Lys Cys
260 265 270
Gly Lys Glu Gly His Gln Met Lys Asp Cys Thr Glu Arg Gln Ala Asn
275 280 285
Phe Leu Gly Asn
290
【０１０６】
<210> 17
<211> 879
<212> DNA
<213> HIV-1
<400>
atg acc atg att acg cca agc ttg gct gca tgg gta aaa gta ata gaa
Met Thr Met Ile Thr Pro Ser Leu Ala Ala Trp Val Lys Val Ile Glu
1 5 10 15
gaa aag gct ttc agc cca gaa gtg ata ccc atg ttt tca gca tta tca
Glu Lys Ala Phe Ser Pro Glu Val Ile Pro Met Phe Ser Ala Leu Ser
20 25 30
gaa gga gcc acc cca caa gat tta aat acc atg cta aac aca gtg ggg
Glu Gly Ala Thr Pro Gln Asp Leu Asn Thr Met Leu Asn Thr Val Gly
35 40 45
gga cat caa gca gcc atg caa atg tta aaa gag acc atc aat gag gaa
Gly His Gln Ala Ala Met Gln Met Leu Lys Glu Thr Ile Asn Glu Glu
50 55 60
gct gca gaa tgg gat aga gtg cat cca gtg cat gca ggg cct att gca
Ala Ala Glu Trp Asp Arg Val His Pro Val His Ala Gly Pro Ile Ala
65 70 75 80
cca ggc cag atg aga gaa cca agg gga agt gat ata gca gga act act
Pro Gly Gln Met Arg Glu Pro Arg Gly Ser Asp Ile Ala Gly Thr Thr
85 90 95
agt acc ctt cag gaa caa ata gga tgg atg aca aac aat cca cct atc
Ser Thr Leu Gln Glu Gln Ile Gly Trp Met Thr Asn Asn Pro Pro Ile
100 105 110
cca gta gga gaa atc tat aaa aga tgg ata atc ctg gga tta aat aaa
Pro Val Gly Glu Ile Tyr Lys Arg Trp Ile Ile Leu Gly Leu Asn Lys
115 120 125
ata gta aga atg tat agt cct gtt agt att ctg gac ata aga caa gga
Ile Val Arg Met Tyr Ser Pro Val Ser Ile Leu Asp Ile Arg Gln Gly
130 135 140
cca aag gaa ccc ttt aga gac tat gta gat cgg ttc tat aaa act tta
Pro Lys Glu Pro Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe Tyr Lys Thr Leu
145 150 155 160
aga gcc gag caa gct tca cag gag gta aaa aat tgg atg aca gaa acc
Arg Ala Glu Gln Ala Ser Gln Glu Val Lys Asn Trp Met Thr Glu Thr
165 170 175
ttg ttg gtc caa aat gcg aac cca gac tgt aag act att cta aaa gca
Leu Leu Val Gln Asn Ala Asn Pro Asp Cys Lys Thr Ile Leu Lys Ala
180 185 190
tta gga cca gca gct aca cta gaa gaa atg atg aca gca tgt cag gga
Leu Gly Pro Ala Ala Thr Leu Glu Glu Met Met Thr Ala Cys Gln Gly
195 200 205
gtg ggg gga ccc ggc cat aag gca aga gtg ttg gct gaa gca atg agc
Val Gly Gly Pro Gly His Lys Ala Arg Val Leu Ala Glu Ala Met Ser
210 215 220
caa gta aca aat tca gct acc ata atg atg cag aga ggt aat ttt agg
Gln Val Thr Asn Ser Ala Thr Ile Met Met Gln Arg Gly Asn Phe Arg
225 230 235 240
aac caa aaa aaa act gtt aag tgt ttc aat tgt ggc aaa gaa ggg cac
Asn Gln Lys Lys Thr Val Lys Cys Phe Asn Cys Gly Lys Glu Gly His
245 250 255
ata gcc aaa aat tgc agg gcc cct agg aaa aag ggc tgt tgg aaa tgt
Ile Ala Lys Asn Cys Arg Ala Pro Arg Lys Lys Gly Cys Trp Lys Cys
260 265 270
gga aag gaa gga cac caa atg aaa gat tgt act gag aga cag gct aat
Gly Lys Glu Gly His Gln Met Lys Asp Cys Thr Glu Arg Gln Ala Asn
275 280 285
ttt tta ggg aac taa
Phe Leu Gly Asn
290
【０１０７】
<210> 18
<211> 115
<212> PRT
<213> HIV-1
<400>
Met Thr Met Ile Thr Pro Ser Leu Ala Ala Trp Val Lys Val Ile Glu
1 5 10 15
Glu Lys Ala Phe Ser Pro Glu Val Ile Pro Met Phe Ser Ala Leu Ser
20 25 30
Glu Gly Ala Thr Pro Gln Asp Leu Asn Thr Met Leu Asn Thr Val Gly
35 40 45
Gly His Gln Ala Ala Met Gln Met Leu Lys Glu Thr Ile Asn Glu Glu
50 55 60
Ala Ala Glu Trp Asp Arg Val His Pro Val His Ala Gly Pro Ile Ala
65 70 75 80
Pro Gly Gln Met Arg Glu Pro Arg Gly Ser Asp Ile Ala Gly Thr Thr
85 90 95
Ser Thr Leu Gln Leu Glu Gly Ser Gly Pro Ser Arg Cys Gly Arg Met
100 105 110
His Gly Thr
115
【０１０８】
<210> 19
<211> 348
<212> DNA
<213> HIV-1
<400>
atg acc atg att acg cca agc ttg gct gca tgg gta aaa gta ata gaa
Met Thr Met Ile Thr Pro Ser Leu Ala Ala Trp Val Lys Val Ile Glu
1 5 10 15
gaa aag gct ttc agc cca gaa gtg ata ccc atg ttt tca gca tta tca
Glu Lys Ala Phe Ser Pro Glu Val Ile Pro Met Phe Ser Ala Leu Ser
20 25 30
gaa gga gcc acc cca caa gat tta aat acc atg cta aac aca gtg ggg
Glu Gly Ala Thr Pro Gln Asp Leu Asn Thr Met Leu Asn Thr Val Gly
35 40 45
gga cat caa gca gcc atg caa atg tta aaa gag acc atc aat gag gaa
Gly His Gln Ala Ala Met Gln Met Leu Lys Glu Thr Ile Asn Glu Glu
50 55 60
gct gca gaa tgg gat aga gtg cat cca gtg cat gca ggg cct att gca
Ala Ala Glu Trp Asp Arg Val His Pro Val His Ala Gly Pro Ile Ala
65 70 75 80
cca ggc cag atg aga gaa cca agg gga agt gat ata gca gga act act
Pro Gly Gln Met Arg Glu Pro Arg Gly Ser Asp Ile Ala Gly Thr Thr
85 90 95
agt acc ctt cag ctc gag gga tcc ggg ccc tct aga tgc ggc cgc atg
Ser Thr Leu Gln Leu Glu Gly Ser Gly Pro Ser Arg Cys Gly Arg Met
100 105 110
cat ggt acc taa
His Gly Thr
115
【０１０９】
<210> 20
<211> 215
<212> PRT
<213> HIV-1
<400>
Met Thr Met Ile Thr Pro Ser Leu Ala Ala Trp Val Lys Val Ile Glu
1 5 10 15
Glu Lys Ala Phe Ser Pro Glu Val Ile Pro Met Phe Ser Ala Leu Ser
20 25 30
Glu Gly Ala Thr Pro Gln Asp Leu Asn Thr Met Leu Asn Thr Val Gly
35 40 45
Gly His Gln Ala Ala Met Gln Met Leu Lys Glu Thr Ile Asn Glu Glu
50 55 60
Ala Ala Glu Trp Asp Arg Val His Pro Val His Ala Gly Pro Ile Ala
65 70 75 80
Pro Gly Gln Met Arg Glu Pro Arg Gly Ser Asp Ile Ala Gly Thr Thr
85 90 95
Ser Thr Leu Gln Glu Gln Ile Gly Trp Met Thr Asn Asn Pro Pro Ile
100 105 110
Pro Val Gly Glu Ile Tyr Lys Arg Trp Ile Ile Leu Gly Leu Asn Lys
115 120 125
Ile Val Arg Met Tyr Ser Pro Val Ser Ile Leu Asp Ile Arg Gln Gly
130 135 140
Pro Lys Glu Pro Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe Tyr Lys Thr Leu
145 150 155 160
Arg Ala Glu Gln Ala Ser Gln Glu Val Lys Asn Trp Met Thr Glu Thr
165 170 175
Leu Leu Val Gln Asn Ala Asn Pro Asp Cys Lys Thr Ile Leu Lys Ala
180 185 190
Leu Gly Pro Ala Ala Thr Leu Glu Leu Glu Gly Ser Gly Pro Ser Arg
195 200 205
Cys Gly Arg Met His Gly Thr
210 215
【０１１０】
<210> 21
<211> 648
<212> DNA
<213> HIV-1
<400>
atg acc atg att acg cca agc ttg gct gca tgg gta aaa gta ata gaa
Met Thr Met Ile Thr Pro Ser Leu Ala Ala Trp Val Lys Val Ile Glu
1 5 10 15
gaa aag gct ttc agc cca gaa gtg ata ccc atg ttt tca gca tta tca
Glu Lys Ala Phe Ser Pro Glu Val Ile Pro Met Phe Ser Ala Leu Ser
20 25 30
gaa gga gcc acc cca caa gat tta aat acc atg cta aac aca gtg ggg
Glu Gly Ala Thr Pro Gln Asp Leu Asn Thr Met Leu Asn Thr Val Gly
35 40 45
gga cat caa gca gcc atg caa atg tta aaa gag acc atc aat gag gaa
Gly His Gln Ala Ala Met Gln Met Leu Lys Glu Thr Ile Asn Glu Glu
50 55 60
gct gca gaa tgg gat aga gtg cat cca gtg cat gca ggg cct att gca
Ala Ala Glu Trp Asp Arg Val His Pro Val His Ala Gly Pro Ile Ala
65 70 75 80
cca ggc cag atg aga gaa cca agg gga agt gat ata gca gga act act
Pro Gly Gln Met Arg Glu Pro Arg Gly Ser Asp Ile Ala Gly Thr Thr
85 90 95
agt acc ctt cag gaa caa ata gga tgg atg aca aac aat cca cct atc
Ser Thr Leu Gln Glu Gln Ile Gly Trp Met Thr Asn Asn Pro Pro Ile
100 105 110
cca gta gga gaa atc tat aaa aga tgg ata atc ctg gga tta aat aaa
Pro Val Gly Glu Ile Tyr Lys Arg Trp Ile Ile Leu Gly Leu Asn Lys
115 120 125
ata gta aga atg tat agt cct gtt agt att ctg gac ata aga caa gga
Ile Val Arg Met Tyr Ser Pro Val Ser Ile Leu Asp Ile Arg Gln Gly
130 135 140
cca aag gaa ccc ttt aga gac tat gta gat cgg ttc tat aaa act tta
Pro Lys Glu Pro Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe Tyr Lys Thr Leu
145 150 155 160
aga gcc gag caa gct tca cag gag gta aaa aat tgg atg aca gaa acc
Arg Ala Glu Gln Ala Ser Gln Glu Val Lys Asn Trp Met Thr Glu Thr
165 170 175
ttg ttg gtc caa aat gcg aac cca gac tgt aag act att cta aaa gca
Leu Leu Val Gln Asn Ala Asn Pro Asp Cys Lys Thr Ile Leu Lys Ala
180 185 190
tta gga cca gca gct aca cta gaa ctc gag gga tcc ggg ccc tct aga
Leu Gly Pro Ala Ala Thr Leu Glu Leu Glu Gly Ser Gly Pro Ser Arg
195 200 205
tgc ggc cgc atg cat ggt acc taa
Cys Gly Arg Met His Gly Thr
210 215
【０１１１】
<210> 22
<211> 120
<212> PRT
<213> HIV-1
<400>
Met Ala Ser Glu Phe Glu Gln Ile Gly Trp Met Thr Asn Asn Pro Pro
1 5 10 15
Ile Pro Val Gly Glu Ile Tyr Lys Arg Trp Ile Ile Leu Gly Leu Asn
20 25 30
Lys Ile Val Arg Met Tyr Ser Pro Val Ser Ile Leu Asp Ile Arg Gln
35 40 45
Gly Pro Lys Glu Pro Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe Tyr Lys Thr
50 55 60
Leu Arg Ala Glu Gln Ala Ser Gln Glu Val Lys Asn Trp Met Thr Glu
65 70 75 80
Thr Leu Leu Val Gln Asn Ala Asn Pro Asp Cys Lys Thr Ile Leu Lys
85 90 95
Ala Leu Gly Pro Ala Ala Thr Leu Glu Leu Glu Gly Ser Gly Pro Ser
100 105 110
Arg Cys Gly Arg Met His Gly Thr
115 120
【０１１２】
<210> 23
<211> 363
<212> DNA
<213> HIV-1
<400>
atg gct agc gaa ttc gaa caa ata gga tgg atg aca aac aat cca cct
Met Ala Ser Glu Phe Glu Gln Ile Gly Trp Met Thr Asn Asn Pro Pro
1 5 10 15
atc cca gta gga gaa atc tat aaa aga tgg ata atc ctg gga tta aat
Ile Pro Val Gly Glu Ile Tyr Lys Arg Trp Ile Ile Leu Gly Leu Asn
20 25 30
aaa ata gta aga atg tat agt cct gtt agt att ctg gac ata aga caa
Lys Ile Val Arg Met Tyr Ser Pro Val Ser Ile Leu Asp Ile Arg Gln
35 40 45
gga cca aag gaa ccc ttt aga gac tat gta gat cgg ttc tat aaa act
Gly Pro Lys Glu Pro Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe Tyr Lys Thr
50 55 60
tta aga gcc gag caa gct tca cag gag gta aaa aat tgg atg aca gaa
Leu Arg Ala Glu Gln Ala Ser Gln Glu Val Lys Asn Trp Met Thr Glu
65 70 75 80
acc ttg ttg gtc caa aat gcg aac cca gac tgt aag act att cta aaa
Thr Leu Leu Val Gln Asn Ala Asn Pro Asp Cys Lys Thr Ile Leu Lys
85 90 95
gca tta gga cca gca gct aca cta gaa ctc gag gga tcc ggg ccc tct
Ala Leu Gly Pro Ala Ala Thr Leu Glu Leu Glu Gly Ser Gly Pro Ser
100 105 110
aga tgc ggc cgc atg cat ggt acc taa
Arg Cys Gly Arg Met His Gly Thr
115 120
【０１１３】
<210> 24
<211> 197
<212> PRT
<213> HIV-1
<400>
Met Ala Ser Glu Phe Glu Gln Ile Gly Trp Met Thr Asn Asn Pro Pro
1 5 10 15
Ile Pro Val Gly Glu Ile Tyr Lys Arg Trp Ile Ile Leu Gly Leu Asn
20 25 30
Lys Ile Val Arg Met Tyr Ser Pro Val Ser Ile Leu Asp Ile Arg Gln
35 40 45
Gly Pro Lys Glu Pro Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe Tyr Lys Thr
50 55 60
Leu Arg Ala Glu Gln Ala Ser Gln Glu Val Lys Asn Trp Met Thr Glu
65 70 75 80
Thr Leu Leu Val Gln Asn Ala Asn Pro Asp Cys Lys Thr Ile Leu Lys
85 90 95
Ala Leu Gly Pro Ala Ala Thr Leu Glu Glu Met Met Thr Ala Cys Gln
100 105 110
Gly Val Gly Gly Pro Gly His Lys Ala Arg Val Leu Ala Glu Ala Met
115 120 125
Ser Gln Val Thr Asn Ser Ala Thr Ile Met Met Gln Arg Gly Asn Phe
130 135 140
Arg Asn Gln Lys Lys Thr Val Lys Cys Phe Asn Cys Gly Lys Glu Gly
145 150 155 160
His Ile Ala Lys Asn Cys Arg Ala Pro Arg Lys Lys Gly Cys Trp Lys
165 170 175
Cys Gly Lys Glu Gly His Gln Met Lys Asp Cys Thr Glu Arg Gln Ala
180 185 190
Asn Phe Leu Gly Asn
195
【０１１４】
<210> 25
<211> 594
<212> DNA
<213> HIV-1
<400>
atg gct agc gaa ttc gaa caa ata gga tgg atg aca aac aat cca cct
Met Ala Ser Glu Phe Glu Gln Ile Gly Trp Met Thr Asn Asn Pro Pro
1 5 10 15
atc cca gta gga gaa atc tat aaa aga tgg ata atc ctg gga tta aat
Ile Pro Val Gly Glu Ile Tyr Lys Arg Trp Ile Ile Leu Gly Leu Asn
20 25 30
aaa ata gta aga atg tat agt cct gtt agt att ctg gac ata aga caa
Lys Ile Val Arg Met Tyr Ser Pro Val Ser Ile Leu Asp Ile Arg Gln
35 40 45
gga cca aag gaa ccc ttt aga gac tat gta gat cgg ttc tat aaa act
Gly Pro Lys Glu Pro Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe Tyr Lys Thr
50 55 60
tta aga gcc gag caa gct tca cag gag gta aaa aat tgg atg aca gaa
Leu Arg Ala Glu Gln Ala Ser Gln Glu Val Lys Asn Trp Met Thr Glu
65 70 75 80
acc ttg ttg gtc caa aat gcg aac cca gac tgt aag act att cta aaa
Thr Leu Leu Val Gln Asn Ala Asn Pro Asp Cys Lys Thr Ile Leu Lys
85 90 95
gca tta gga cca gca gct aca cta gaa gaa atg atg aca gca tgt cag
Ala Leu Gly Pro Ala Ala Thr Leu Glu Glu Met Met Thr Ala Cys Gln
100 105 110
gga gtg ggg gga ccc ggc cat aag gca aga gtg ttg gct gaa gca atg
Gly Val Gly Gly Pro Gly His Lys Ala Arg Val Leu Ala Glu Ala Met
115 120 125
agc caa gta aca aat tca gct acc ata atg atg cag aga ggt aat ttt
Ser Gln Val Thr Asn Ser Ala Thr Ile Met Met Gln Arg Gly Asn Phe
130 135 140
agg aac caa aaa aaa act gtt aag tgt ttc aat tgt ggc aaa gaa ggg
Arg Asn Gln Lys Lys Thr Val Lys Cys Phe Asn Cys Gly Lys Glu Gly
145 150 155 160
cac ata gcc aaa aat tgc agg gcc cct agg aaa aag ggc tgt tgg aaa
His Ile Ala Lys Asn Cys Arg Ala Pro Arg Lys Lys Gly Cys Trp Lys
165 170 175
tgt gga aag gaa gga cac caa atg aaa gat tgt act gag aga cag gct
Cys Gly Lys Glu Gly His Gln Met Lys Asp Cys Thr Glu Arg Gln Ala
180 185 190
aat ttt tta ggg aac taa
Asn Phe Leu Gly Asn
195
【０１１５】
<210> 26
<211> 97
<212> PRT
<213> HIV-1
<400>
Met Ala Ser Glu Phe Glu Met Met Thr Ala Cys Gln Gly Val Gly Gly
1 5 10 15
Pro Gly His Lys Ala Arg Val Leu Ala Glu Ala Met Ser Gln Val Thr
20 25 30
Asn Ser Ala Thr Ile Met Met Gln Arg Gly Asn Phe Arg Asn Gln Lys
35 40 45
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50 55 60
Asn Cys Arg Ala Pro Arg Lys Lys Gly Cys Trp Lys Cys Gly Lys Glu
65 70 75 80
Gly His Gln Met Lys Asp Cys Thr Glu Arg Gln Ala Asn Phe Leu Gly
85 90 95
Asn
【０１１６】
<210> 27
<211> 294
<212> DNA
<213> HIV-1
<400>
atg gct agc gaa ttc gaa atg atg aca gca tgt cag gga gtg ggg gga
Met Ala Ser Glu Phe Glu Met Met Thr Ala Cys Gln Gly Val Gly Gly
1 5 10 15
ccc ggc cat aag gca aga gtg ttg gct gaa gca atg agc caa gta aca
Pro Gly His Lys Ala Arg Val Leu Ala Glu Ala Met Ser Gln Val Thr
20 25 30
aat tca gct acc ata atg atg cag aga ggt aat ttt agg aac caa aaa
Asn Ser Ala Thr Ile Met Met Gln Arg Gly Asn Phe Arg Asn Gln Lys
35 40 45
aaa act gtt aag tgt ttc aat tgt ggc aaa gaa ggg cac ata gcc aaa
Lys Thr Val Lys Cys Phe Asn Cys Gly Lys Glu Gly His Ile Ala Lys
50 55 60
aat tgc agg gcc cct agg aaa aag ggc tgt tgg aaa tgt gga aag gaa
Asn Cys Arg Ala Pro Arg Lys Lys Gly Cys Trp Lys Cys Gly Lys Glu
65 70 75 80
gga cac caa atg aaa gat tgt act gag aga cag gct aat ttt tta ggg
Gly His Gln Met Lys Asp Cys Thr Glu Arg Gln Ala Asn Phe Leu Gly
85 90 95
aac taa
Asn
【０１１７】
<210> 28
<211> 132
<212> PRT
<213> HIV-1
<400>
Met Ala Ser Glu Phe Pro Ile Val Gln Asn Ile Gln Gly Gln Met Val
1 5 10 15
His Gln Ala Ile Ser Pro Arg Thr Leu Asn Ala Trp Val Lys Val Ile
20 25 30
Glu Glu Lys Ala Phe Ser Pro Glu Val Ile Pro Met Phe Ser Ala Leu
35 40 45
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50 55 60
Gly Gly His Gln Ala Ala Met Gln Met Leu Lys Glu Thr Ile Asn Glu
65 70 75 80
Glu Ala Ala Glu Trp Asp Arg Val His Pro Val His Ala Gly Pro Ile
85 90 95
Ala Pro Gly Gln Met Arg Glu Pro Arg Gly Ser Asp Ile Ala Gly Thr
100 105 110
Thr Ser Thr Leu Gln Leu Glu Gly Ser Gly Pro Ser Arg Cys Gly Arg
115 120 125
Met His Gly Thr
130
【０１１８】
<210> 29
<211> 399
<212> DNA
<213> HIV-1
<400>
atg gct agc gaa ttc cct ata gtg cag aac atc cag ggg caa atg gta
Met Ala Ser Glu Phe Pro Ile Val Gln Asn Ile Gln Gly Gln Met Val
1 5 10 15
cat cag gcc ata tca cct aga act tta aat gca tgg gta aaa gta ata
His Gln Ala Ile Ser Pro Arg Thr Leu Asn Ala Trp Val Lys Val Ile
20 25 30
gaa gaa aag gct ttc agc cca gaa gtg ata ccc atg ttt tca gca tta
Glu Glu Lys Ala Phe Ser Pro Glu Val Ile Pro Met Phe Ser Ala Leu
35 40 45
tca gaa gga gcc acc cca caa gat tta aat acc atg cta aac aca gtg
Ser Glu Gly Ala Thr Pro Gln Asp Leu Asn Thr Met Leu Asn Thr Val
50 55 60
ggg gga cat caa gca gcc atg caa atg tta aaa gag acc atc aat gag
Gly Gly His Gln Ala Ala Met Gln Met Leu Lys Glu Thr Ile Asn Glu
65 70 75 80
gaa gct gca gaa tgg gat aga gtg cat cca gtg cat gca ggg cct att
Glu Ala Ala Glu Trp Asp Arg Val His Pro Val His Ala Gly Pro Ile
85 90 95
gca cca ggc cag atg aga gaa cca agg gga agt gat ata gca gga act
Ala Pro Gly Gln Met Arg Glu Pro Arg Gly Ser Asp Ile Ala Gly Thr
100 105 110
act agt acc ctt cag ctc gag gga tcc ggg ccc tct aga tgc ggc cgc
Thr Ser Thr Leu Gln Leu Glu Gly Ser Gly Pro Ser Arg Cys Gly Arg
115 120 125
atg cat ggt acc taa
Met His Gly Thr
130
【０１１９】
<210> 30
<211> 231
<212> PRT
<213> HIV-1
<400>
Met Pro Val Gln Gln Thr Gly Gly Gly Asn Tyr Ile His Val Pro Leu
1 5 10 15
Ser Pro Arg Thr Leu Asn Ala Trp Val Lys Leu Val Glu Asp Lys Lys
20 25 30
Phe Gly Ala Glu Val Val Pro Gly Phe Gln Ala Leu Ser Glu Gly Cys
35 40 45
Thr Pro Tyr Asp Ile Asn Gln Met Leu Asn Cys Val Gly Asp His Gln
50 55 60
Ala Ala Met Gln Ile Ile Arg Glu Ile Ile Asn Asp Glu Ala Ala Asp
65 70 75 80
Trp Asp Ala Gln His Pro Ile Pro Gly Pro Leu Pro Ala Gly Gln Leu
85 90 95
Arg Asp Pro Arg Gly Ser Asp Ile Ala Gly Thr Thr Ser Thr Val Glu
100 105 110
Glu Gln Ile Gln Trp Met Tyr Arg Pro Gln Asn Pro Val Pro Val Gly
115 120 125
Asn Ile Tyr Arg Arg Trp Ile Gln Ile Gly Leu Gln Lys Cys Val Arg
130 135 140
Met Tyr Asn Pro Thr Asn Ile Leu Asp Val Lys Gln Gly Pro Lys Glu
145 150 155 160
Pro Phe Gln Ser Tyr Val Asp Arg Phe Tyr Lys Ser Leu Arg Ala Glu
165 170 175
Gln Thr Asp Pro Ala Val Lys Asn Trp Met Thr Gln Thr Leu Leu Ile
180 185 190
Gln Asn Ala Asn Pro Asp Cys Lys Leu Val Leu Lys Gly Leu Gly Met
195 200 205
Asn Pro Thr Leu Glu Glu Met Leu Thr Ala Cys Gln Gly Val Gly Gly
210 215 220
Pro Gly Gln Lys Ala Arg Leu
225 230
【０１２０】
<210> 31
<211> 696
<212> DNA
<213> HIV-1
<400>
atg cct gta caa cag aca ggc ggt ggc aac tat atc cac gtg cca ctg
Met Pro Val Gln Gln Thr Gly Gly Gly Asn Tyr Ile His Val Pro Leu
1 5 10 15
agc ccc cga act cta aat gct tgg gta aaa tta gta gag gac aag aag
Ser Pro Arg Thr Leu Asn Ala Trp Val Lys Leu Val Glu Asp Lys Lys
20 25 30
ttc ggg gca gaa gta gtg cca gga ttt caa gca ctc tca gaa ggc tgc
Phe Gly Ala Glu Val Val Pro Gly Phe Gln Ala Leu Ser Glu Gly Cys
35 40 45
acg ccc tat gat atc aac caa atg ctt aat tgt gtg ggc gat cac caa
Thr Pro Tyr Asp Ile Asn Gln Met Leu Asn Cys Val Gly Asp His Gln
50 55 60
gca gct atg caa ata atc aga gag att atc aat gac gaa gca gca gat
Ala Ala Met Gln Ile Ile Arg Glu Ile Ile Asn Asp Glu Ala Ala Asp
65 70 75 80
tgg gat gca cag cac cca ata cca ggc ccc tta cca gca ggg cag ctt
Trp Asp Ala Gln His Pro Ile Pro Gly Pro Leu Pro Ala Gly Gln Leu
85 90 95
aga gac cca agg ggg tct gac ata gca gga aca aca agc aca gta gaa
Arg Asp Pro Arg Gly Ser Asp Ile Ala Gly Thr Thr Ser Thr Val Glu
100 105 110
gaa cag atc cag tgg atg tat agg cca caa aat ccc gtg ccg gta ggg
Glu Gln Ile Gln Trp Met Tyr Arg Pro Gln Asn Pro Val Pro Val Gly
115 120 125
aac atc tac aga aga tgg atc cag ata ggg cta cag aag tgt gtc agg
Asn Ile Tyr Arg Arg Trp Ile Gln Ile Gly Leu Gln Lys Cys Val Arg
130 135 140
atg tac aac cca act aac atc tta gac gta aag cag gga cca aag gaa
Met Tyr Asn Pro Thr Asn Ile Leu Asp Val Lys Gln Gly Pro Lys Glu
145 150 155 160
ccg ttc cag agc tat gtg gac agg ttc tat aaa agc ttg agg gca gaa
Pro Phe Gln Ser Tyr Val Asp Arg Phe Tyr Lys Ser Leu Arg Ala Glu
165 170 175
caa aca gat ccg gca gta aag aac tgg atg acc caa acg ctg cta ata
Gln Thr Asp Pro Ala Val Lys Asn Trp Met Thr Gln Thr Leu Leu Ile
180 185 190
cag aat gcc aac cca gac tgc aag tta gta cta aaa gga ctg ggg atg
Gln Asn Ala Asn Pro Asp Cys Lys Leu Val Leu Lys Gly Leu Gly Met
195 200 205
aat ccc acc cta gaa gag atg ctg act gcc tgt cag ggg gta ggt gga
Asn Pro Thr Leu Glu Glu Met Leu Thr Ala Cys Gln Gly Val Gly Gly
210 215 220
cca ggc caa aaa gcc aga cta taa
Pro Gly Gln Lys Ala Arg Leu
225 230
【０１２１】
【図１】図１ ｐＷ６Ａの制限酵素地図である。
【図２】図２ ＹＡＭ２４−１２抗体固相と各種標識抗
体との組合せ試験結果である。
体との組合せ試験結果である。
【図３】図３ ｐ２４−１２抗体固相と各種標識抗体と
の組合せ試験結果である。
の組合せ試験結果である。
【図４】図４ ＹＡＭ２４−７抗体固相と各種標識抗体
との組合せ試験結果である。
との組合せ試験結果である。
【図５】図５ ＹＡＭ２４−９抗体固相と各種標識抗体
との組合せ試験結果である。
との組合せ試験結果である。
【図６】図６ 標識ポリクローナル抗体と各種固相モノ
クローナル抗体との組合せ試験結果である。
クローナル抗体との組合せ試験結果である。
【図７】図７ 本発明の方法によるＨＩＶ−Ｉｐ２４抗
原の測定感度（全域）を示した結果である。
原の測定感度（全域）を示した結果である。
【図８】図８ 本発明の方法によるＨＩＶ−Ｉｐ２４抗
原の測定感度（低濃度域）を示した結果である。
原の測定感度（低濃度域）を示した結果である。
【図９】図９ 既存測定法によるＨＩＶ−Ｉｐ２４抗原
の測定感度（全域）を示した結果である。
の測定感度（全域）を示した結果である。
【図１０】図１０ 既存測定法によるＨＩＶ−Ｉｐ２４
抗原の測定感度（低濃度域）を示した結果である。
抗原の測定感度（低濃度域）を示した結果である。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(56)参考文献 特開 平５−276988（ＪＰ，Ａ)
特開 昭62−164696（ＪＰ，Ａ)
特表 平４−505621（ＪＰ，Ａ)
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
G01N 33/569
G01N 33/577
Claims (16)
- 【請求項１】ＨＩＶ−１ｐ２４抗原のＣ末端領域を認識
する少なくとも１種類のポリクローナル抗体と、ＨＩＶ
−１ｐ２４抗原のＮ末端を認識する少なくとも１種類の
モノクローナル抗体と、ＨＩＶ−１ｐ２４抗原の中間部
位を認識する少なくとも１種類のモノクローナル抗体と
を用いることを特徴とするＨＩＶ−１ｐ２４抗原のサン
ドイッチ法を用いた免疫測定方法。 - 【請求項２】前記ＨＩＶ−１ｐ２４抗原Ｃ末端領域を主
要認識部位とするポリクローナル抗体がペプチドｐ２４
ｂ（配列番号２２に記載のアミノ酸配列）及びペプチド
ｐ２４ｃ（配列番号２６に記載のアミノ酸配列）のそれ
ぞれとは反応せずかつペプチド２４ｂｃ（配列番号２４
に記載のアミノ酸配列）を認識することを特徴とする請
求項１に記載の免疫測定方法。 - 【請求項３】前記ＨＩＶ−１ｐ２４抗原のＣ末端領域を
主要認識部位とするポリクローナル抗体がＨＩＶ−１ｐ
２４抗原のアミノ酸２０７〜２１８（配列番号１２に記
載のアミノ酸配列）を含むペプチドを認識することを特
徴とする請求項２に記載の免疫測定方法。 - 【請求項４】前記ＨＩＶ―１ｐ２４抗原のＮ末端を認識
するモノクローナル抗体がペプチド２４ａ（配列番号１
８に記載のアミノ酸配列）とは反応せずかつペプチド２
４ａ＋（配列番号２８に記載のアミノ酸配列）を認識す
ることを特徴とする請求項１に記載の免疫測定方法。 - 【請求項５】前記ＨＩＶ−１ｐ２４抗原のＮ末端を認識
するモノクローナル抗体がＨＩＶ−１ｐ２４抗原のアミ
ノ酸配列１〜２７（配列番号１３に記載のアミノ酸配
列）を含むペプチドを認識するモノクローナル抗体であ
ることを特徴とする請求項４記載の免疫測定方法。 - 【請求項６】前記ＨＩＶ−１ｐ２４抗原のＮ末端を認識
するモノクローナル抗体がｐ２４Ｎ１−９であることを
特徴とする請求項５に記載の免疫測定方法。 - 【請求項７】前記ＨＩＶ−１ｐ２４抗原の中間部位を認
識するモノクローナル抗体がペプチド２４ａ（配列番号
１８に記載のアミノ酸配列）及びペプチド２４ｂ(配列
番号２２に記載のアミノ酸配列)のそれぞれとは反応せ
ずかつペプチド２４ａｂ（配列番号２０に記載のアミノ
酸配列）を認識することを特徴とする請求項１に記載の
免疫測定方法。 - 【請求項８】前記ＨＩＶ−１ｐ２４抗原の中間部位を認
識するモノクローナル抗体がＨＩＶ−１ｐ２４抗原のア
ミノ酸配列１０７〜１１８（配列番号１４に記載のアミ
ノ酸配列）を含むペプチドを認識することを特徴とする
請求項７に記載の免疫測定方法。 - 【請求項９】前記ＨＩＶ−１ｐ２４抗原の中間部位を認
識するモノクローナル抗体がｐ２４Ｎ３−３であること
を特徴とする請求項８に記載の免疫測定方法。 - 【請求項１０】前記ＨＩＶ−１ｐ２４抗原を認識するポ
リクローナル抗体及びモノクローナル抗体がＨＩＶ２−
ｐ２５抗原をも認識することを特徴とする請求項１ない
し９に記載の免疫測定方法。 - 【請求項１１】前記ポリクローナル抗体が液相にあるこ
とを特徴とする請求項１ないし１０のいずれかに記載の
免疫測定方法。 - 【請求項１２】前記液相にあるポリクローナル抗体が直
接又は間接に標識されていることを特徴とする請求項１
１に記載の免疫測定方法。 - 【請求項１３】前記標識が酵素標識であることを特徴と
する請求項１２に記載の免疫測定方法。 - 【請求項１４】前記モノクローナル抗体が固相に結合さ
れていることを特徴とする請求項１１ないし１３に記載
の免疫測定方法。 - 【請求項１５】ＨＩＶ−１ｐ２４抗原のＣ末端領域を主
要認識部位とするポリクローナル抗体が標識された標識
抗体と、ＨＩＶ−１ｐ２４抗原のＮ末端を認識するモノ
クローナル抗体及びＨＩＶ−１ｐ２４抗原の中間部位を
認識するモノクローナル抗体が固相化された抗体結合固
相とを含む、サンドイッチ測定法用のＨＩＶ−１ｐ２４
抗原測定試薬。 - 【請求項１６】ＨＩＶ−１ｐ２４抗原のＣ末端領域を主
要認識部位とするポリクローナル抗体が標識された標識
抗体と、ＨＩＶ−１ｐ２４抗原のＮ末端を認識するモノ
クローナル抗体が固相化された抗体結合固相と、ＨＩＶ
−１ｐ２４抗原の中間部位を認識するモノクローナル抗
体が固相化された抗体結合固相とを含む、サンドイッチ
測定法用のＨＩＶ−１ｐ２４抗原測定試薬。
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