JP3888695B2 - ヒトlect2に対する抗体、それを産生する細胞、その測定法及び測定用キット - Google Patents
ヒトlect2に対する抗体、それを産生する細胞、その測定法及び測定用キット Download PDFInfo
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Description
本発明は、新規な蛋白質ヒトLECT2と反応する抗体、その抗体を産生する融合細胞、ヒトLECT2の測定法及び測定用キットに関する。
背景技術
最近、好中球の癌細胞破壊反応への関与が知られるようになり、癌組織において好中球の浸潤像が観察されることから、好中球が癌細胞の分泌する走化性因子に応答したものと考えられている。
LECT2(Leukocyte-derived chemotaxin 2)は、このような癌細胞から分泌される走化性因子を探索する中から見いだされたものであり、T細胞白血病細胞SKW−3の培養上清から得られた走化性因子と考えられるものである。
ヒトLECT2は、T細胞白血病細胞SKW−3の培養上清中に存在するウシ血清中のLECT2をコードするDNAを用いてヒトのcDNAライブラリーの中から90%以上のホモロジーを有する蛋白質として新たに見出されたものである。下記表1は、ヒトLECT2とウシLECT2のアミノ酸配列を比較できるように示したものである。
【表1】
このヒトLECT2もウシLECT2同様の走化性因子であると考えられ、病態の把握や癌の治療への応用が期待されることから、このヒトLECT2の測定法を確立することが望まれた。
なお、当初、ウシLECT2をLECT2a、ヒトLECTをLECT2bと称していたが、従前の名称は相応しくないことから名称を変更した。
本発明は上記課題に鑑みなされたものであり、ヒトLECT2に対する抗体、それを産生する細胞、その測定法及び測定用キットを提供することを目的とする。
発明の開示
上記課題を解決するため、本発明の第1である抗体は、ヒトLECT2(配列表の配列番号1で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質)と特異的に反応することを特徴とする。かかる抗体としては、例えば、融合細胞クローンG2A5D7(受託番号FERM P−15638)によって産生される抗体、融合細胞クローンA1G1C6(受託番号FERM P−15639)によって産生される抗体、融合細胞クローン5C5(受託番号FERM P−15640)によって産生される抗体、融合細胞クローンH12D10D6(受託番号FERM P−15641)、あるいは、融合細胞クローン89F2(受託番号FERM P−16229)によって産生される抗体がある。
本発明の第2である融合細胞は、ヒトLECT2と特異的に反応する抗体を産生することを特徴とする。かかる融合細胞としては、例えば、融合細胞クローンG2A5D7(受託番号FERM P−15638)、A1G1C6(受託番号FERM P−15639)、5C5(受託番号FERM P−15640)、H12D10D6(受託番号FERM P−15641)、89F2(受託番号FERM P−16229)がある。
本発明の第3であるヒトLECT2の測定法は、下記a)〜c)及びd)〜f)の工程を含むことを特徴とする。即ち、
a)ヒトLECT2と特異的に反応する第1の抗体を不溶性支持体に結合せしめてなる固相化抗体に標準物質としてのヒトLECT2を反応せしめた後、
b)ヒトLECT2と特異的に反応する第2の抗体を標識物質により標識化した標識抗体を反応させ、
c)この反応生成物の標識量を測定することにより検量線を作成する工程、
及び
d)前記固相化抗体に検体を反応せしめた後、
e)前記標識抗体を反応させ、
f)この反応生成物の標識量を測定し、前記検量線から検体中に含まれるヒトLECT2を測定する工程。
本発明の第4であるヒトLECT2の測定用キットは、ヒトLECT2と特異的に反応する第1の抗体を不溶性支持体に結合せしめてなる固相化抗体と、ヒトLECT2と特異的に反応する第2の抗体を標識物質により標識化した標識抗体とを備えたことを特徴とする。
本発明の第3、第4において、第1の抗体は、融合細胞クローンG2A5D7(受託番号FERM P−15638)によって産生される抗体、融合細胞クローンA1G1C6(受託番号FERM P−15639)によって産生される抗体、融合細胞クローン5C5(受託番号FERM P−15640)によって産生される抗体、融合細胞クローンH12D10D6(受託番号FERM P−15641)によって産生される抗体、あるいは、融合細胞クローン89F2(受託番号FERM P−16229)によって産生される抗体であり、前記第2の抗体は前記5つの抗体のいずれかであって第1の抗体とは異なるものであることが好ましい。また、標識物質としては、例えば、ペルオキシダーゼ、ビオチン、β−D−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ及びマイクロペルオキシダーゼからなる群から選ばれたものを用いることができる。
本発明のヒトLECT2の測定法及び測定用キットによれば、検体中に含まれる走化性因子ヒトLECT2を測定することができるため、その測定結果を利用して肝臓等の病態の把握や治療への応用が可能となるという効果が得られる。
【図面の簡単な説明】
図1はELISA法によるヒトLECT2の検出結果を表すグラフであり、図2はウェスターンブロットによる各クローンのモノクローナル抗体の反応特異性を表す説明図であり、図3はヒトLECT2の濃度と吸光度との関係を表すグラフであり、図4は急性肝炎患者検体の急性期と寛解期におけるヒトLECT2の測定値を表すグラフであり、図5は健常者の組織の染色像を表す写真であり、(A)は100倍拡大写真、(B)は200倍拡大写真であり、図6は肝硬変患者の組織の染色像を表す写真であり、(A)は100倍拡大写真、(B)は200倍拡大写真である。
発明を実施するための最良の形態
[ヒトLECT2に特異的に反応する抗体、及び、その抗体を産生する融合細胞]
ヒトLECT2に特異的に反応する抗体の作製について以下に説明する。
A.抗原
抗原としてはヒトLECT2(配列番号1で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質)をクローニングし、免疫原として使用した。
B.上記抗原による免疫
免疫動物としては哺乳動物であるマウスのほかラット、ハムスターなども用いることができる。通常マウスが最も汎用され、BALB/cマウス、その他の系(strain)のマウスを用いることができる。この際、免疫計画及び抗原の濃度は十分な量の抗原刺激を受けたリンパ球が形成されるよう選ばれるべきである。例えばマウス1匹に25μgの抗原を2週間間隔で腹腔に3回免疫後、さらに25μgを静脈に投与する。最終免疫の数日後に融合のための脾臓細胞を取り出す。
C.細胞融合
上記のごとく免疫した哺乳動物の個体から脾臓を無菌的に取り出し、そこから単細胞懸濁液を調製する。この脾臓細胞(抗体産生細胞)を適当な骨髄腫細胞と適当な融合促進剤の使用により細胞融合させる。骨髄腫細胞としては免疫動物と同種の哺乳動物に由来するものが望ましいが、ラット、ハムスター等の脾臓細胞とマウスの骨髄腫細胞を融合させることもできる。脾臓細胞と骨髄腫細胞の好ましい比率は約20:1〜約2:1の範囲である。約108個の脾細胞について0.5〜1.5mlの融合媒体の使用が適当である。好ましい融合促進剤としては、例えば平均分子量1000〜4000のポリエチレングリコールを有利に使用できるが、この分野で知られている他の融合促進剤(例えばセンダイウイルス(別名HVJ))を用いることもできる。また、これら融合促進剤を用いた方法以外に電気ショックを用いる方法により細胞融合を行ってもよい。
D.目的とする抗体を産生する融合細胞の選択
別の容器(例えばマイクロタイタープレート)で未融合の脾細胞、未融合の骨髄腫細胞及び融合した融合細胞の混合物を未融合の骨髄腫細胞を支持しない選択培地で希釈し、未融合の細胞を死滅させるのに十分な時間(約1時間)培養する。培地は薬物抵抗性(例えば8−アザグアニン抵抗性)で未融合の骨髄腫細胞を支持しないもの(例えばHAT培地)が使用される。この選択培地中では未融合の骨髄腫細胞は死滅する。この未融合の脾細胞は非腫瘍性細胞なので、ある一定期間後(1週間後)死滅する。これに対して融合した細胞は、骨髄腫の親細胞の腫瘍性と親脾細胞の性質を合わせ持つため、選択培地中で生存できる。
かくして、融合細胞が検出された後、前記のヒトLECT2に対する抗体について酵素免疫測定法(Enzyme Linked Immunosorbent Assay)によりスクリーニングを行い、ヒトLECT2と特異的に結合するモノクローナル抗体を産生する融合細胞だけを選択する。このような融合細胞として、例えば融合細胞クローンG2A5D7(受託番号FERM P−15638)、融合細胞クローンA1G1C6(受託番号FERM P−15639)、融合細胞クローン5C5(受託番号FERM P−15640)、融合細胞クローンH12D10D6(受託番号FERM P−15641)、融合細胞クローン89F2(受託番号FERM P−16229)が挙げられる。
F.目的とする抗体の取得
目的とする抗体を産生する融合細胞を適当な方法(例えば限界希釈法)でクローン化した後、抗体は2つの異なった方法で産生することができる。その第1の方法によれば、融合細胞を一定期間、適当な培地で培養することにより、その培養上清からその融合細胞の産生するモノクローナル抗体を得ることができる。第2の方法によれば、融合細胞は同質遺伝子、または半同質遺伝子を持つ免疫動物の腹腔に注射することができる。一定時間後の宿主動物の血液中および腹水中より、その融合細胞の産生するモノクローナル抗体を得ることができる。
[ヒトLECT2の測定法]
A.固相化抗体
ヒトLECT2と特異的に反応する抗体を不溶性支持体に結合せしめてなる固相化抗体を作成するには、この抗体と不溶性支持体を接触させることにより不溶性支持体の表面に抗体を吸着させて行うほか、共有結合等の化学的な方法によっても結合させることができる。
不溶性担体としては、例えばポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリアクリルニトリル、フッ素樹脂、架橋デキストラン、ポリサッカライドなどの高分子、その他紙、ガラス、金属、アガロースおよびこれらの組み合わせなどを例示することができる。また、不溶性担体の形状としては、トレイ状、球状、棒状、線維状、盤状、容器状、セル、試験管など種々の形状であることができる。
B.標識抗体
ヒトLECT2に特異的に反応する抗体は、完全抗体であってもよく、FabまたはF(ab)’2等のフラグメントであってもよい。
標識物質としては、通常の免疫学的測定方法に使用し得るものであれば特に限定されるものではないが、酵素、アビジン、蛍光物質、発光物質及び放射性物質等を使用するのが好ましい。酵素としてはペルオキシダーゼ、β−D−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、マイクロペルオキシダーゼ、蛍光物質としてはフルオレッセインイソチオシアネート、フィコビリプロテイン、フィコエリスリン等、発光物質としてはイソルシノール、ルシゲニン等、そして放射性物質としては125I、131I、14C、3H等を用いることができる。また、標識物質としてビオチンを用いた場合にはさらに酵素標識アビジンを用いることにより高い感度を得ることができるので、より好ましい。この場合の標識酵素としては抗体に標識した場合の酵素と同様の酵素を用いることができるが、ペルオキシダーゼは特に好ましい。
酵素を標識物質として用いた場合にはその活性を測定するために基質、必要により発色剤が用いられる。酵素としてペルオキシダーゼを用いる場合には、基質としてH2O2を用い、発色剤として2,2’−アジノ−ジ−[3−エチルベンズチアゾリンスルホン酸]アンモニウム塩(ABTS)、5−アミノサリチル酸、o−フェニレンジアミン(OPD)、4−アミノアンチピリン、3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン等、酵素にアルカリフォスファターゼを用いる場合は基質としてo−ニトロフェニルフォスフェート等、酵素にβ−D−ガラクトシダーゼを用いる場合は基質としてフルオロセイン−ジ−(β−D−ガラクトピラノシド)、4−メチルウンベリフェリル−β−D−ガラクトピラノシド等を用いることができる。
C.検量線の作成
固相化抗体に標準物質としてのヒトLECT2を反応せしめ、次いで固相化抗体と特異的に反応したヒトLECT2に標識抗体を反応させ、その後、この標識抗体の標識量を測定する。これにより、ヒトLECT2の量に対する標識量の関係、即ち検量線が得られる。
この免疫学的測定方法において用いられる反応用媒体としては、例えばリン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、酢酸緩衝液などを含んだpH6.0〜8.0の範囲のものが示される。
D.検体に含まれるヒトLECT2の測定
固相化抗体に検体を反応せしめ、次いで標識抗体を反応させる。このときに検体中に含まれるヒトLECT2の濃度に応じて標識抗体が反応する。その後、この標識抗体の標識量を測定する。この測定値を検量線に照らすことにより、検体中のヒトLECT2の濃度が測定される。尚、反応用媒体については、上記C.で述べた通りである。
[ヒトLECT2の測定用キット]
測定用キットは、少なくとも、
(1)ヒトLECT2と特異的に反応する第1の抗体を不溶性支持体に結合せしめてなる固相化抗体、
(2)ヒトLECT2と特異的に反応する第2の抗体を標識物質により標識化した標識抗体
を含み、その他に、反応用媒体を含んでいてもよいし、あるいは、標準物質(ヒトLECT2)を含んでいてもよい。尚、標識抗体の標識物質が酵素の場合には、通常、酵素の活性を測定するための基質及び反応停止液を含む。また、不溶性支持体、標識物質については上述したのでその説明は省略する。この測定用キットによれば、上述の測定法を実施することができる。
以下に、本発明の好適な実施例を図面に基づいて説明する。尚、本発明の実施の形態は、下記の実施例に何ら限定されるものではなく、本発明の技術的範囲に属する限り種々の形態を採り得ることはいうまでもない。
[実施例1]免疫原(ヒトLECT2)の作製
[1−1]ヒトLECT2のクローニングおよびクローニングされたヒトLECT2のヌクレオチド配列の決定
ヒトLECT2 cDNAのクローニングは次のようにして行った。50μg/mlのPHA−P(DIFCO社製)でT細胞白血病細胞SKW−3を処理しpolyA+RNAを調製した。5μgのpolyA+RNAを用い、oligo−dTをプライマーにしてファーストストランドcDNA(1st cDNA)を合成した。
次に、ウシLECT2(配列番号9にそのアミノ酸配列を示す)の部分アミノ酸配列を基にPCRのプライマーを合成した。即ち、アミノ酸配列WAIICAより6種類のオリゴヌクレオチドを演繹して5’のプライマーとし、アミノ酸配列HIENCDより4種類のオリゴヌクレオチドを演繹して3’のプライマーとした。PCR法により、1st cDNAを鋳型とし上記プライマーの組み合わせである24種類の反応にてDNA断片の増幅を行った。アミノ酸配列DVLCSDGSTVYAPFを基にDNAプローブ(GATGTC/GCTA/GTGCTCT/CGATGGC/GTCT/CACT/AGTC/GTATGCT/CCCT/CTT、配列番号4参照)を使い、増幅されたDNA断片をアガロースゲルで分離し、サザンブロットにより解析した。その結果、約370bpのDNA断片が検出され、それをpUC19にクローニングした。
ヒト肝臓cDNAライブラリーを、クローニングされたcDNA断片をプローブとしてスクリーニングしたところ、130万個のクローン中12クローンの陽性クローンを得た。それぞれのクローンはすべて、制限酵素の解析により2種類に分けられることがわかり、それぞれのグループの一番長いcDNA断片のクローンの塩基配列の決定をした。その結果、2種類のcDNAは同一の遺伝子由来で3’側に存在する2種類のpolyAシグナルにより生じることが推定された。また、コードされたタンパク質のアミノ酸配列よりウシLECT2の決定されたアミノ酸配列に約90%のホモロジーを有することが判明し、このコードされると考えられるタンパク質をヒトLECT2と命名した。このヒトLECT2のアミノ酸配列及び塩基配列を配列番号1及び2に示す。
[1−2]ヒトLECT2遺伝子を含む組換えプラスミドの構築
クローニングされたヒトLECT2 cDNAをもとに、5’側のプライマーとしてGGCGAATTCGAAAACCTGTATTTTCAGGGGCCCTGGGCTAATATATG(配列番号5参照)、3’側のプライマーとしてCGCAAGCTTTTACAGGTATGCAGTAG(配列番号6参照)をそれぞれ用い、熱変性:94℃、1分間、アニーリング:55℃、2分間、伸長反応:72℃、3分間、の25サイクルのPCR法にてヒトLECT2のcDNAを含むDNA断片を増幅させた。EcoRI、HindIIIでの処理後、この断片をpMALTM−C(Biolab Inc.)のEcoRI/HindIII部位にクローニングした。この組換えプラスミドを、pMAL−TEV−ヒトLECT2と命名した。この発現ベクターは、IPTG存在下で、tacプロモーターの制御下マルトース結合タンパク質(maltose-binding-protein)とヒトLECT2の融合タンパク質を産生させることができ、その連結部分にTEVプロテアーゼ(Tabacco Etch Virus由来)の切断部位が入っているので特異的な切断ができることが特徴である。
また、クローニングされたヒトLECT2 cDNAをもとに、5’側のプライマーとしてGCGGGATCCCCGGGCCATGGGCTAATAT(配列番号7参照)、3’側のプライマーとしてCGCGGATCCTTACAGGTATGCAGTAG(配列番号8参照)をそれぞれ用い、熱変性:94℃、1分間、アニーリング:55℃、2分間、伸長反応:72℃、3分間、の25サイクルのPCR法にてヒトLECT2のcDNAを含むDNA断片を増幅させた。BamHIで処理後、この断片をpGEX−3X(Pharmacia Inc.)のBamHI部位にクローニングした。この組換えプラスミドを、pGEX−Xa−ヒトLECT2と命名した。この発現ベクターは、IPTG存在下で、tacプロモーターの制御下グルタチオン−S−トランスフェラーゼとヒトLECT2の融合タンパク質を産生させることができ、その連結部分にXaプロテアーゼの切断部位が入っているので特異的な切断ができることが特徴である。
[1−3]ヒトLECT2遺伝子を含む組換えプラスミドによる大腸菌の形質転換
上記のようにして得られた組換えプラスミドpMAL−TEV−ヒトLECT2を用いて大腸菌JM109株を形質転換後、得られた大腸菌クローンを、デオキシ法により期待された塩基配列を有するものに関してスクリーニングし、期待されるDNA断片を持つ大腸菌クローンMal−ヒトLECT2(受託番号FERM P−14669、なお国際寄託へ移管請求したことにより受託番号FERM BP−5302が付された)を得た。
[1−4]動物細胞によるヒトLECT2の産生
pUC19のBamHI部位にHindIIIからEcoRIの方向でクローニングされたヒトLECT2 cDNAの5’側をエキソヌクレアーゼIIIにより−14の塩基配列まで欠失させ、T4 DNAポリメラーゼで平滑末端にした後、PstIリンカーをライゲーションし、PstIとBglIIで切断し、発現ベクターpcDL−SRα294のPstI/BamHI部位にクローニングした。この組換え発現ベクターをチャイニーズハムスターCHO細胞にトランスフェクションし、ヒトLECT2を高発現する株1株(C1D8−1)(受託番号FERM P−14668、なお国際寄託へ移管請求したことにより受託番号FERM BP−5301が付された)を得た。
(分子量の決定)
リコンビナントヒトLECT2(動物細胞発現)は、35S−メチオニンによってメタボリックラベルし、CHO細胞の培養上清をSDSゲル電気泳動にかけることにより検出した。その結果、分子量が約14kDaと16kDaの2本のバンド(16kDaが主要であり、2つのバンドはプロセッシングの違いにより生じると考えられる)が得られた。
[実施例2]免疫
上記実施例1のように作製した免疫原ヒトLECT2 100μlとフロイントの完全アジュバント100μlを良く混合して懸濁液を作製し、この懸濁液を2匹のマウス(雄BALB/c)の腹腔に1匹当たり抗原として25μlずつ投与した。さらに1週間おきに同量の抗原を5回投与し、その3日後に脾臓を取り出し融合実験を行った。
別に、家兎2羽に対しても同様に免疫し、採決して血清を分離した後、常法に従い吸収操作を行い、IgG分画を分離してポリクロナール抗体を得た。
[実施例3]細胞融合及び目的とするモノクローナル抗体を産生する融合細胞の選択と取得
摘出したマウスの脾臓細胞と、同系マウスの骨髄腫細胞(SP−2/O−Ag−14)とを約10:1の割合で混合し、50%ポリエチレングリコール4000を融合促進剤として細胞融合を行った。融合後の細胞は1×106cells/mlの細胞濃度となるように10%牛血清を含むHAT培地(ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを含む培地)に懸濁し、96ウエルのマイクロタイタープレート(ヌンク社製マキシソープ、以下同じ)に1ウエルあたり100μlずつ分注した。
融合細胞は、CO2インキュベータ(5%CO2、37℃)中で培養し、HAT培地で培地交換を行い、HAT培地中で馴化し、さらに10%FCS−RPMI1640培地で馴化した。
融合培養細胞上清中の抗体は、ヒトLECT2蛋白質を固相化したマイクロタイタープレートを用いてELISA法により検出した。陽性となったウエルに対しては限界希釈法によるクローニングを2回繰り返し、ヒトLECT2に対する反応性を有するクローンを5種類選択し、それぞれをG2A5D7、A1G1C6、5C5、H12D10D6、89F2(受託番号FERM P−15638、FERM P−15639、FERM P−15640、FERM P−15641、FERM P−16229)と命名した。
得られたクローンはそれぞれ10%DMSOを含む90%牛血清中に懸濁させ、液体窒素中に保存した。各クローンの産生するモノクローナル抗体は、クローンをマウスの腹腔内で増殖させ、その腹水中からプロテイン−Aセファロースカラームを用いてそれぞれを精製した。
[実施例4]モノクローナル抗体の特異性の確認
▲1▼ELISA法による特異性の確認
ヒトLECT2のPBS溶液(1〜1000ng/ml)を調製し、この溶液でヒトLECT2を固相化したマイクロタイタープレートに各クローンの抗体溶液を反応させた後、ペルオキシダーゼ標識抗マウスイムノグロブリン(カベル社製)を反応させ、オルトフェニレンジアミンと過酸化水素の溶液を基質として波長492nmにおける吸光度を測定した。その結果を図1に示す。
吸光度の値は固相化したヒトLECT2の濃度に伴って上昇し、ある濃度からは一定になることから、各クローンともヒトLECT2に特異的に反応することが確認された。
▲2▼ウエスターンブロットによる特異性の確認
ヒトLECT2とマルトース結合タンパク質(MBP)の混合物を抗原としてSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)(16.5%モノアクリルアミド/ビスアクリルアミド;3%ビス/モノアクリルアミド+ビス)を行い、泳動後ウェスターンブロットにより反応の特異性を確認した。各クローンのモノクローナル抗体とも約16kDに反応性を認め、MBPとは反応しなかった。この結果を図2に示す。
尚、図2でCBBはクマーシーブリリアントブルーの略で蛋白染色を示す。第1レーンは分子量マーカー、他はヒトLECT2+MBPを抗原として泳動し、第1レーン、第2レーンは蛋白染色、他は各モノクローナル抗体によるウェスターンブロットを示す。
[実施例5]ELISA法によるサブクラスの確認
上記実施例3で得られた各モノクローナル抗体について、アメリカンコーレックス社製モノクローナルサブクラスイソタイピングキットを用いてクラス・サブクラスを確認した。結果はクローンA1G1C6及びG2A5がIgG2b、クローンH12D10がIgMであった。尚、クローン5C5、89F2については未確認である。
[実施例6]抗体固相化
上記実施例3で得られたモノクローナル抗体クローンG2A5を0.1M炭酸緩衝液pH9.0で5μl/mlの濃度に調製し、96ウェルのマイクロタイタープレートの各ウエルに100μlずつ加え、4℃で20時間静置反応させた。抗体溶液を捨て、1%BSA、5%ショ糖を含むPBSを各ウエルに200μlずつ加え、室温(20〜25℃)で2時間静置してブロッキングを行った。ブロッキング液を捨て、プレートを風乾し、固相化抗体を得た。この固相化抗体は乾燥剤と共に密封して保存した。
[実施例7]標識抗体の作製
上記実施例2で得たポリクローナル抗体の精製IgG1mg当たり0.056Uのフィシンを添加し、37℃で8時間反応させた後、Ultrogel ACA44を用いてゲルろ過し、Fab’分画を得た。このFab’分画にマレイミド法によりペルオキシダーゼを標識し、ペルオキシダーゼ標識抗体とした。なお、標識は医学書院刊、石川栄治著、「酵素免疫測定法第3版」に従って行った。
[実施例8]ヒトLECT2の測定
ヒトLECT2蛋白質をPBSで希釈して0.001〜20ng/mlの溶液を調製し、この液200μlを上記実施例6で得た抗体固相化プレートの各ウエルに添加し、室温で1時間反応させた後、各ウエルをPBS300μlで4回洗浄し、余分のPBSを除き、上記実施例7で得たペルオキシダーゼ標識抗体(100μl)を加え、室温で1時間反応させ、再度PBSで洗浄し、テトラメチルベンジジンと過酸化水素の溶液100μlを加えて反応させ、1.5Nリン酸100μlを加えて反応を停止し、波長450nmにおける吸光度を測定した。このときの測定結果を表2及び図3に示す。
【表2】
これにより、ヒトLECT2の量に対する標識量の関係、即ち検量線が得られ、この検量線を用いることにより検体中のヒトLECT2の量に対する標識量の関係、即ち、検量線が得られ、この検量線を用いることにより検体中のヒトLECT2の含有量を知ることができる。
急性肝炎の患者検体について、その急性期と寛解期における測定値の比較を行ったデータを表3及び図4に示す。
【表3】
測定系に関する予備的検討の結果、検体中のヒトLECT2は比較的早期にその抗原性を喪失すること、特に血清では速やかに抗原性が消失することが明らかとなったことから、検体として血漿を用い、各血漿は採血後速やかに分離することによって得たあと、測定時までは−20℃以下で凍結保存した。また、検体の希釈率が5倍以下の場合、測定値に影響を与える可能性があることから、検体は10倍希釈して測定した。
各検体の急性期及び寛解期の測定値を比較すると、明らかに寛解期において測定値が低下していることから、検体中のヒトLECT2の濃度は患者の病態を反映しているものと判断した。
このように、検体中の走化性因子ヒトLECT2の含有量を測定することができるため、その測定結果を利用して病態の把握や治療への応用が可能となる。
[実施例9]免疫組織染色
健常者の肝臓組織及びC型肝硬変患者の肝臓組織を取り、常法に従いホルマリン固定し、パラフィン包埋した。このパラフィン包埋組織からミクロトームを用いて組織切片を作製し、常法に従い脱パラフィンを用い、実施例3で得たモノクローナル抗体クローン89F2より精製したIgG分画のPBS溶液約100μl(5μg/ml)を切片にのせ、37℃で30分間反応させた後、PBSで洗浄した。これにペルオキシダーゼ標識抗マウスIgG(ダコ社製)を37℃で30分間反応させ、再度PBSで洗浄した後、3,3’,5,5’−ジアミノベンジジンと過酸化水素の溶液を反応させ染色した。細胞の核はヘマトキシリンで染色した。
図5は、健常者の組織の染色像を表す写真であり、(A)は100倍拡大写真、(B)は200倍拡大写真である。また、図6は、肝硬変患者の組織の染色像を表す写真であり、(A)は100倍拡大写真、(B)は200倍拡大写真である。
健常者、肝硬変患者の組織切片とも、肝細胞の細胞質にびまん性の染色を認めた。具体的には、健常者、肝硬変患者とも肝実質細胞にジアミノベンジジンの顆粒状の染色(茶色に染まっている)が認められたが、肝硬変患者では陰陽性の細胞の混在が認められ、健常者とは異なる染色パターン(健常者では肝実質細胞がすべて陽性)を示した。結合組織には染色は認められなかった。なおM図5及び図6の写真中、青く点状に染まっているのは核である。このことは、LECT2が細胞周期と何らかの関連を持っていることを示唆している。
産業上の利用可能性
本発明のヒトLECT2に対する抗体によれば、免疫治療や診断、及びこれらに関連した産業分野において有用である。また、本発明の融合細胞によれば、ヒトLECT2に対する抗体を入手するうえで有用である。更に、本発明のヒトLECT2に対する抗体は、ヒトLET2の測定法及び測定用キットに用いることができる。この測定法及び測定用キットによれば、検体中に含まれるヒトLECT2(走化性因子と考えられる)を測定することができるため、その測定結果を利用して病態の把握や治療への応用が可能となるという効果が得られる。具体的には、例えば種々の疾患(例えば肝炎や肝硬変など)の患者から取り出した組織等に対し、本発明の抗体を反応させて、LECT2を発現している細胞が組織のどこに存在しているかを調べることができる。これにより各種疾患の診断や治療へつなげることが可能となる。
寄託機関
C1D8−1及びMaI−ヒトLECT2は、以下の国際寄託機関に、それぞれ下記の受託番号と寄託日で寄託されている。
名称:通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所
住所:日本国茨城県つくば市東1丁目1番3号(郵便番号305)
受託番号及び寄託日
(1)C1D8−1
FERM BP−5301:1994年11月25日
(2)Mal−ヒトLECT2
FERM BP−5302:1994年11月25日
融合細胞クローンG2A5D7、A1G1C6、5C5、H12D10D6、89F2は、以下の国内寄託機関に、それぞれ下記の受託番号と寄託日で寄託されている。
名称:通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所
住所:日本国茨城県つくば市東1丁目1番3号(郵便番号305)
受託番号及び寄託日
(1)融合細胞クーロンG2A5D7
FERM P−15638:1996年5月21日
(2)融合細胞クーロンA1G1C6
FERM P−15639:1996年5月21日
(3)融合細胞クーロン5C5
FERM P−15640:1996年5月21日
(4)融合細胞クーロンH12D10D6
FERM P−15641:1996年5月21日
(5)融合細胞クーロン89F2
FERM P−16229:1997年5月19日
【配列表】
配列番号:1
配列の長さ:151
配列の型:アミノ酸
トポロジー:直鎖状
配列の種類:タンパク質
配列の特徴
存在位置:58
他の情報:Xaa=ValまたはIle
配列
配列番号:2
配列の長さ:1092
配列の型:核酸
鎖の数:2本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:cDNA
起源:ヒト
細胞の種類:肝臓
配列の特徴:
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1060..1065
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配列
配列番号:3
配列の長さ:1092
配列の型:核酸
鎖の数:2本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:cDNA
起源:ヒト
細胞の種類:肝臓
配列の特徴:
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配列
配列番号:4
配列の長さ:41
配列の型:核酸
トポロジー:直鎖状
配列の種類:他の核酸 合成DNA(cDNAプローブ)
配列の特徴
存在位置:6
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他の情報:N=CまたはG
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他の情報:N=CまたはG
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存在位置:39
他の情報:N=TまたはC
配列
配列番号:5
配列の長さ:47
配列の型:核酸
トポロジー:直鎖状
配列の種類:他の核酸 合成DNA(プライマー)
配列
配列番号:6
配列の長さ:26
配列の型:核酸
トポロジー:直鎖状
配列の種類:他の核酸 合成DNA(プライマー)
配列
配列番号:7
配列の長さ:28
配列の型:核酸
トポロジー:直鎖状
配列の種類:他の核酸 合成DNA(プライマー)
配列
配列番号:8
配列の長さ:26
配列の型:核酸
トポロジー:直鎖状
配列の種類:他の核酸 合成DNA(プライマー)
配列
配列番号:9
配列の長さ:98
配列の型:アミノ酸
トポロジー:直鎖状
配列の種類:タンパク質
配列
Claims (8)
- 融合細胞クローンG2A5D7(受託番号FERM P−15638)によって産生され、新規蛋白質ヒトLECT2(配列表の配列番号1で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質)と特異的に反応することを特徴とする抗体。
- 融合細胞クローンA1G1C6(受託番号FERM P−15639)によって産生され、新規蛋白質ヒトLECT2(配列表の配列番号1で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質)と特異的に反応することを特徴とする抗体。
- 融合細胞クローン5C5(受託番号FERM P−15640)によって産生され、新規蛋白質ヒトLECT2(配列表の配列番号1で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質)と特異的に反応することを特徴とする抗体。
- 融合細胞クローンH12D10D6(受託番号FERM P−15641)によって産生され、新規蛋白質ヒトLECT2(配列表の配列番号1で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質)と特異的に反応することを特徴とする抗体。
- 請求の範囲第1項〜第4項のいずれかに記載の抗体を産生することを特徴とする融合細胞。
- 融合細胞クローンG2A5D7(受託番号FERM P−15638)、A1G1C6(受託番号FERM P−15639)、5C5(受託番号FERM P−15640)、及びH12D10D6(受託番号FERM P−15641)の群から選ばれた一つである請求の範囲第5項記載の融合細胞。
- 下記a)〜c)及びd)〜f)の工程を含み、下記第1の抗体は請求の範囲第1項〜第4項のいずれかに記載された抗体であり、下記第2の抗体は請求の範囲第1項〜第4項のいずれかに記載された抗体であって前記第1の抗体とは異なるものであることを特徴とするヒトLECT2の測定法。
a)ヒトLECT2と特異的に反応する第1の抗体を不溶性支持体に結合せしめてなる固相化抗体に標準物質としてのヒトLECT2を反応せしめた後、
b)ヒトLECT2と特異的に反応する第2の抗体を標識物質により標識化した標識抗体を反応させ、
c)この反応生成物の標識量を測定することにより検量線を作成する工程、及び
d)前記固相化抗体に検体を反応せしめた後、
e)前記標識抗体を反応させ、
f)この反応生成物の標識量を測定し、前記検量線から検体中に含まれるヒトLECT2を測定する工程。 - ヒトLECT2と特異的に反応する第1の抗体を不溶性支持体に結合せしめてなる固相化抗体と、
ヒトLECT2と特異的に反応する第2の抗体を標識物質により標識化した標識抗体とを備え、
前記第1の抗体は請求の範囲第1項〜第4項のいずれかに記載された抗体であり、前記第2の抗体は請求の範囲第1項〜第4項のいずれかに記載された抗体であって前記第1の抗体とは異なるものであることを特徴とするヒトLECT2の測定用キット。
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